הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ביולוגית מערכות ויסות חילוף חומרים על ידי איתות קולטן אסטרוגן לסרטן השד

9.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53832

⸱

17 במרץ 2016

 , 
1Department of Food Sciences and Human Nutrition, University of Illinois, Urbana-Champaign

במאמר זה

סיכום

שילוב נתונים מניסויי ריצוף גנומי וניסויים מטבולומיים הוא אתגר. במאמר זה אנו מדווחים, לראשונה, על ייצור, ניתוח ואינטגרציה של נתוני טרנסקריפטום, ציסטרום ומטבולום מתאי סרטן השד שטופלו באסטרדיול.

תקציר

עם כניסתו של -omics גישות הבנתנו את המחלות הכרוניות כמו סרטן ותסמונת מטבולית השתפרה. עם זאת, כריית יעיל של המידע המערך הנתונים גדול בקנה המידה כי מתקבלים microarrays ביטוי גנים, ניסויי רצף עמוקים או פרופיל מטבולים חיונית לחשוף ולאחר מכן למקד בצורה יעילה הרגולטורים הקריטיים של פנוטיפים תא פגועים. קולטן אסטרוגן α (ERα) הוא אחד הגורמים מאסטר תמלול הסדרת תוכניות הגן שחשוב סרטן שד תגובת אסטרוגן. על מנת להבין את תפקידו של ERα איתות במטבוליזם סרטן השד השתמשנו נתונים transcriptomic, cistromic ו metabolomic מתאי MCF-7 שטופלו אסטרדיול. בדו"ח זה תארנו דור של דגימות RNA-seq, שבב Seq וניסויי metabolomics ועל ניתוח חישובית אינטגרטיבית של הנתונים המתקבלים. גישה זו שימושית המגדירה שומה רומןמנגנוני cular ומעגלי רגולטוריות גן מוסדר על ידי גורם שעתוק מסוים אשר משפיע חילוף חומרים של תאים נורמלים או חולים.

מבוא

אסטרוגנים הם הרגולטורים החשובים של תהליכים פיזיולוגיים רבים בשתי נקבות וזכרים כולל רקמות הרבייה, רקמות מטבולית, המוח ועצמות 1. בנוסף השפעות מועילות ברקמות אלה, אסטרוגנים גם לנהוג סרטן עולה חלב ורקמות רבייה. אסטרוגנים בעיקר לעבוד דרך למיונים להשרות סוג תא השפעות ספציפיות. רצף עמוק של תמלילי מוסדר על ידי ERα באמצעות RNA-seq ו הגנום כולו ניתוח אתרי הקישור ERα DNA באמצעות שבב Seq הוכיח להיות שימושי כדי להבין כיצד ERα עובד ברקמות וסוגי סרטן שונים שעולים מהם. אנחנו ואחרים פרסמנו פרופילי ביטוי גנים הקשורים קולטנים שונים (ERα vs ERβ) 2,3, הליגנדים שונים 3-5 ו coregulators השונה 2,4,6,7.

RNA-seq הוא השיטה העיקרית לבחון את transcriptome, מציע דיוק גבוה ויעילות לעומת ba microarrayניתוח ביטוי גנים SED 8. RNA המתקבל שורות תאים 2-4,7, רקמות או דגימות גידולים הם רצף, ממופה מכלולי גנומי זמינים וגנים מוסדרים באופן דיפרנציאלי מזוהים. הכרומטין immunoprecipitation (שבב) הוא מועסק לנתח את גורם שעתוק coregulator הכרומטין מחייב לאתרים מחייב רגולטוריות ידוע. שבב Seq (שבב ואחריו רצף קצב העברת נתונים גבוה) מספק זיהוי משוחדת של אתרי קישור העולמיים. Metabolomics היא גישה אחרת ביולוגיה מערכתית משמשת יותר ויותר, אשר מודדת באופן כמותי, בתגובת multiparametric הדינמית של מערכות חיות לגירויים שונים, כוללים כימיקלי הפרעות גנטיות.

על ידי ביצוע פרופיל מטבולים עולמי, הודעה תפקודית ניתן המתקבל תאים, רקמות, ודם. בנוסף, מידע מניסויים transcriptome לא תמיד משקפים שינויים בפועל ברמת אנזימי שתורמים הביוכימיים. מְשׁוּלָבניתוח של נתוני transcriptome ו metabolome מאפשר לנו לזהות לתאם שינויים בביטוי גנים עם שינויים המטבוליט בפועל. רתימת מידע מכל מערכי נתונים בקנה מידה גדול אלה מספקים את הפרטים מכניסטית כדי להבין את התפקיד של גורמי שעתוק ויסות מערכות ביולוגיות מורכבות, במיוחד אלה הנוגעים להתפתחות אנושית ומחלות כמו סרטן וסוכרת.

האופי המורכב של הגנום היונק מהווה אתגר לשלב באופן מלא לפרש את הנתונים שהתקבלו מניסויי transcriptome, cistrome ו metabolome. זיהוי אירועים מחייבים פונקציונליים שיובילו שינויים בביטוי של גני היעד חשוב כי אתרי קישור פונקציונליים פעם מזוהות; שהתפתח ניתוח, כולל ניתוח מוטיב שעתוק מחייבים (TF), יכול להתבצע עם דיוק גבוה. זה מוביל לזיהוי מפלים ומנגנוני TF משמעות ביולוגית. כמו כן comparis ישירהעל ניסויים RNA-seq ו-Seq שבב הם לא תמיד אפשרי מאחר שהנתונים כל ניסוי יש שונות קשקשים ורעשים ובמקרים מסוימים להיות מעורפלים ומטושטשים אותות משמעותיים על ידי רעש האוכלוסייה. אנחנו לא מודעים לכל מחקר המשלב את המידע על שלוש גישות עצמאיות אלא קשורות להבין את ויסות חילוף חומרים הישירה ידי ERα בסרטן השד. לכן, המטרה הכללית שלנו במאמר זה היא להתייחס אירועים מחייבים פרודוקטיבי ביטוי גנים ושינויים המטבוליט. על מנת להשיג מטרה זו, אנו משולבים נתוני RNA-seq, שבב Seq ו metabolomics ניסויים וזיהינו אלה אסטרוגן מושרה ERα מחייב אירועים שיגרמו לשינויי ביטוי גני מסלולים מטבוליים. בפעם הראשונה, אנו מספקים מערך שלם של פרוטוקולים (איור 1) להפקת שבב Seq, RNA-seq ו פרופיל metabolomics וביצוע ניתוח אינטגרטיבי של הנתונים לחשוף מעגלי גן רומן ויסות חילוף חומרים של שדשורות תאים סרטניים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת דוגמאות RNA-seq

  1. תרבות טיפול בתאים
    1. התרבות התאים MCF7 ב משופר MEM (IMEM) בתוספת אדום בינוני-פנול עם FBS פעיל מקצה 10%, 1% פניצילין / סטרפטומיצין על 37 מעלות צלזיוס אווירה humidified 5% CO 2.
      הערה: שורת תאי Same ומצבו תרבית תאים משמשים לאורך כל תקופת המחקר.
    2. זרע 100,000 תאים MCF7 לכל היטב 6 צלחות היטב. יש triplicates עבור כל טיפול. ביום 3, להסיר את בינונית ומוסיפים 2 מ"ל בינוני טרי עם או בלי 10 -8 M E2 היטב כל אחד. דגירה צלחות עבור 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס באווירה 2 humidified 5% CO.
    3. כדי לקצור את התאים, להוסיף מגיב בידוד RNA 1 מ"ל (guanidinium חומצה thiocyanate-פנול, כלורופורם) לכל היטב דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). ואז לאסוף מגיב lysate התא על ידי pipetting והפיקדונות לתוך צינורות 1.5 מ"ל
  2. בידוד RNA
    1. הוסף 200 μl chlorofoRM ל מגיב התא lysate 1 מ"ל (1.1.3) ו מערבולת למשך 10 שניות. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. צנטריפוגה דגימות ב XG 16,000 במשך 15 דקות ב 4 ° C.. בעקבות צנטריפוגה, ולהעביר את השלב מימית (העליון) לצינור חדש מבלי להפריע בשלבים אחרים.
    2. הוסף 500 μl 100% isopropanol לצינור חדש עם השלב שהועבר-מימי, ומערבב על ידי היפוך. לדגור לילה -20 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה דגימות ב XG 16,000 במשך 10 דקות ב 4 °. שים לב גלול בחלק התחתון של הצינור. בטל supernatant לשטוף את הכדור עם 750 אתנול μl RNase ללא 70% על ידי מערבולת קצרה.
    3. צנטריפוגה דגימות ב 6000 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant, צנטריפוגות מדגם ב XG 16,000 עבור 1 דקות ב 4 ° C כדי לאסוף את כל אתנול הנותרים. הסר את אתנול הנותר על ידי pipetting עם קצה ג'ל טעינה ולהגדיר את הצינוריות בצד למטה אוויר יבש למשך 10 דקות. ממס את הגלולה ב 20-50 מי μl DEPC שטופל depenדינג בגודל של הכדורים.
  3. לטהר את RNA באמצעות ערכת ניקוי RNA בעקבות פרוטוקול 4. למדוד את ריכוז RNA באמצעות ערכת assay מבוסס fluorometry בעקבות פרוטוקול 9.
    הערה: OD ב 260 ננומטר הוא נלקח על מנת לקבוע את ריכוז RNA ויחס של OD ב 260 ננומטר ו -280 ננומטר משמשים כדי לקבוע את הטוהר של מדגם. מומלץ לבדוק את איכות RNA באמצעות assay Bio-מנתח.
  4. קח על 0.5 עד 1 מיקרוגרם RNA מטוהרים על רצף.
    הערה: מרכז ביוטק מכין את ספריות רצף ומבצע-סוף לזווג לקרוא רצף בשיטות שפורטו בעבר 2.

2. הכנת מדגם שבב Seq

  1. תרבות טיפול בתאים
    1. זרע 500,000 תאים MCF7 לכל צלחת 10 ס"מ במדיום הגידול.
      הערה: עבור כל לנתץ 16 צלחות שימשו. ביום 3, להסיר את בינונית ומוסיפים 5 מ"ל בינוני טרי עם או בלי 10 -8 M E2 לכלצַלַחַת. פנקו את התאים במשך 45 דקות (37 מעלות צלזיוס אווירה humidified 5% CO 2).
  2. קציר Crosslink ו- Cell
    1. הוסף 250 μl 37% פורמלדהיד לתוך מדיום 5 מ"ל ל crosslink הכרומטין, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. עצור crosslinking ידי שטיפת התאים עם 5 מ"ל קרח קר 1x MEM.
    2. קציר התאים ב 250 תא μl חיץ תמוגה (10 mM EDTA, 50 מ"מ Tri HCl, 1% SDS, 0.5% N, תחמוצת N-dimethyldodecan-1-אמין) לכל צלחת.
  3. פיצול של הכרומטין
    1. Sonicate התאים למשך 30 שניות x 8 ב המגבר של 30 להגיע בגדלים הכרומטין הנדרש. מגניב כל דגימה על קרח לאחר sonication של 30 שניות.
    2. צנטריפוגה ב 16, 000 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C, ובזהירות פיפטה supernatant מבלי להפריע גלולה בחלק התחתון.
    3. קחו aliquot 5 μl של supernatant, ולבדוק את גודל ה- DNA על ידי אלקטרופורזה באמצעות ג'ל 1.5% agarose כפי שתואר לעיל 10. הגודל האידיאלישל ה- DNA צריך להיות בין 200-500 נ"ב.
  4. הכרומטין immunoprecipitation
    1. שמור 25 μl של lysate התא כקלט. בתוך צינור 50 מ"ל, לערבב 4 מ"ל של lysate התא עם 20 מ"ל חיץ IP (2 מ"מ EDTA, 100 מ"מ NaCl, 20 מ"מ טריס- HCl, ו -0.5% טריטון X), נוגדן ERα (500 μl F10 ו 500 μl HC- 20), ו -500 μl ProtA ו ProtG חלבון ציפוי חרוזים מגנטיים. דגירה את התערובת על ידי סיבוב ב לילה 4 ° C. כדי לאפשר ההיווצרות של הרכב נוגדן chromatin-.
  5. מתרחץ-crosslinking הפוך
    1. השתמש עמדה מגנטית לאסוף את החרוזים המגנטיים בצד הממוגנט להסיר את החיץ לשטוף.
    2. שטפו את החרוזים המגנטי 25 חיץ מ"ל לשטוף לי (2 מ"מ EDTA, 20 מ"מ טריס HCl, 01% SDS, 1% טריטון X, ו -150 מ"מ NaCl). כדי לשטוף את החרוזים המגנטיים ביסודיות מבלי להפריע מתחמים-חלבון ה- DNA, להוסיף 25 מיליליטר החיץ לשטוף לאט אל הצינור בצד ואז להפוך את הצינורות עד שכל החרוזים המגנטיים הם wi המעורב היטבth למאגר לשטוף מבלי להיראות כמו גלולה. כחלופה, השתמש המסובב כדי להפוך את הצינור. אל מערבולת הדגימות. שטוף את החרוזים המגנטיים תוך שימוש באותה השיטה בשלבים הבאים.
    3. שטפו את החרוזים המגנטי 25 מ"ל Wash חיץ השנייה (EDTA מ"מ 2, 20 מ"מ טריס HCl, 01% SDS, 1% טריטון X, ו- 500 מ"מ NaCl).
    4. שטפו את החרוזים המגנטי 25 מ"ל Wash חיץ III (1.6 mM EDTA, 10 מ"מ טריס HCl, 1% NP-40, 1% Dexycholate ו -250 מ"מ LiCl).
    5. שטפו את החרוזים המגנטי 25 חיץ מ"ל 1x TE (1 mM EDTA, ו -10 מ"מ טריס HCl) פעמיים.
    6. Elute DNA חיץ Elution 500 μl (1% SDS, ו -10 מ"מ NaHCO 3) ולאחר מכן להקצות 500 elution DNA μl לתוך 4 צינורות. עבור DNA מ תשומות, elute DNA ב 125 חיץ Elution μl.
    7. דגירת הצינורות ב 65 מעלות צלזיוס למשך הלילה על גוש חימום. מכסים את הצינורות על בלוק חימום ברדיד אלומיניום כדי לשמור על החום אפילו על כל הצינורות. מניחי משקל על הצינורות כדי למנוע מהם הפתיחה.
  6. בידוד DNA
    1. מצנן את הצינורות ב RT במשך 5 דקות. לבודד דנ"א דגימות לנתץ באמצעות ערכת בידוד DNA שבב. פעל על פי ההנחיות של היצרן.
      1. לחמם את הצפת elution על 65 מעלות צלזיוס. להוסיף 625 μl חיץ מחייבים על צינור אחד. אם הצורות המשקעות, להוסיף עוד חיץ 250 μl מחייב עד הפתרון הוא ברור.
      2. טען המדגם על הטור צנטריפוגות ב XG 16,000 למשך 30 שניות. לשטוף את המדגם עם 250 חיץ לשטוף μl. זכור להוסיף אתנול למאגר לשטוף כאשר בפעם הראשונה להשתמש בו. חזור על לשטוף.
      3. Elute את ה- DNA ב 15 חיץ Elution μl. מערבבים את הדנ"א של אותה ומורידה מ 4 צינורות להשיג כ -55 DNA μl.
    2. לבודד את ה- DNA קלט באמצעות ערכת טיהור DNA.
      1. לחמם את הצפת elution על 65 מעלות צלזיוס. להוסיף 625 μl חיץ מחייב צינור כל דגירה במשך 10 דקות. טען את המדגם על עמודה collecti 2 מ"לעל הצינור.
      2. לשטוף את המדגם עם 750 חיץ לשטוף μl, צנטריפוגות ב XG 16,000 דקות 1. חזור על צנטריפוגה כדי להסיר כל חיץ נותר. Elute את ה- DNA לתוך 30 μl של EB.
    3. למדוד את ריכוז ה- DNA באמצעות Assay מסחרי Fluorochrome עם שינוי 11.
      1. לדלל את חיץ TE 20x לתוך 1x TE כמו חיץ assay על דילול הדגימות המגיבות ו- DNA. קחו 5 μl DNA שבודד לדלל אותו לתוך 50 μl ב 1x TE.
      2. מ 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​DNA פתרון המניות לבצע תקן ה- DNA החל ריק עד 1, 10, 100, 1000 מיקרוגרם / מ"ל. בצלחת 96 היטב, להקצות 25 μl של תקן זה וכן דילול DNA בשני עותקים. (בשלושה עותקים עבור תקן מומלץ.)
      3. כן מגיב עובד על ידי ביצוע דילול פי 200 מן מגיב dsDNA במאגר 1x TE בצינור פלסטיק. מכסה את הפתרון מגיב עובד עם נייר אלומיניום כדי למנוע אור. הוסף 200 μl עובד מגיב לתוך מדגם זה. בcubate בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום, כדי למנוע אור.
      4. מדוד את בתפרחת של דגימות באמצעות קורא צלחת פלואורסצנטי (עירור ב 480 ננומטר, פליטת 520 ננומטר). צור את עקומת סטנדרט DNA של בתפרחת לעומת ריכוז ה- DNA. קביעת הריכוזים של הדגימות מבוססות על עקומת סטנדרט DNA שנוצרה.
  7. אימות של ניסוי שבב באמצעות qPCR
    1. קח 2 μl מבודד DNA ומדולל לתוך 20 μl במים. הגדר את התגובה qPCR בשלושה עותקים על ידי ערבוב 2.5 דילול DNA μl, 5 μl תערובת אמן גרין ואני PCR, 1 פריימר μl, ו -1.5 מים חינם nuclease μl.
    2. הפעל את qPCR עם המערכת המהירה Real-Time PCR באמצעות התכנית הבאה: שלב 1: 95 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות, שלב 2: 95 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות, חזור על שלב 2 39 פעמים.
  8. שלח 10 ng דגימת DNA למרכז ביוטק עבור סידור.
    הערה: BIOTECמרכז h מכין את ה- DNA שבב לתוך ספריות על פי הוראה, ומבצע רצף חד לקרוא בשיטות שפורטו בעבר 2.

3. Assay Metabolomics הכנת דוגמאות

  1. תרבות טיפול בתאים
    1. זרע 400,000 תאים MCF7 לכל צלחת 10 ס"מ במדיום הגידול. עבור כל טיפול להכין שלוש דוגמאות. השתמש בשתי צלחות בכל מדגם לקבל מספיק תאים לצורך זיהוי. ביום 3, להסיר את בינונית ומוסיפים 5 מ"ל בינוני טרי עם או בלי 10 -8 M E2 אל התאים. פנקו את התאים למשך 24 שעות (37 מעלות צלזיוס אווירה humidified 5% CO 2).
  2. אוסף דוגמאות
    1. הוסף 5 מ"ל קר כקרח 1x PBS לצלחת, לשאוב את PBS לאחר הטיית בקצרה את הצלחת כמה פעמים. חזור פעמיים, להסיר כמה שיותר PBS ככל האפשר לאחר לשטוף האחרון.
    2. הוסף 750 μl של אצטון טרום קר על כל צלחת לגרד את התאים. מערבבים את התאים אצטון משתי צלחותלצינור 2 מ"ל על הקרח.
    3. תא ספירה לנורמליזציה
      1. עבור כל טיפול, להשתמש בשתי צלחות נוספות עבור כימות תא. לדה-לצרף התאים מהצלחת, להוסיף 2 מ"ל של HE חיץ (1x HBSS, 10 HEPES מ"מ, 0.075% NaHCO 3, ו 1 mM EDTA) אל כל צלחת דגירה במשך 5 דקות.
      2. אסוף ומערבב היטב את התאים על ידי pipetting תאי חיץ HE. מסך השימושים 20 פתרון התא μl לספור את מספר הסלולרי באמצעות hemocytometer.
  3. אחסן את דגימות ב -80 ° C לפני שליחת למרכז Metabolomics לזהות ולכמת את מטבוליטים באמצעות ספקטרומטריית מסה גז כרומטוגרפיה (GC-MS) ניתוח.

4. ניתוח אינטגרטיבי

  1. RNA-seq ניתוח נתונים:
    1. הפעילו את איכות קבצי FASTQ באמצעות FastQC: קרא QC (http://galaxy.illinois.edu)
      1. בחר FastQC: קרא תחת הכלי של NGS: QC ומניפולציה. העלה את קובץ הנתונים הגולמי histor הנוכחיy.
        הערה: מומלץ לתת כותרת עבור קובץ הפלט כדי להזכיר לך מה את העבודה הייתה שכן יכול להיות במספר יציאות.
    2. Execute ואת קובץ הפלט יופיע תחת ההיסטוריה. חזור על אותו התהליך עבור כל קובץ רצף. מתאמים לקצץ בעזרת קליפ תחת NGS: Toolkit FASTX.
    3. יישר מקריא hg19 באמצעות Tophat2 עם ביאור התייחסות הגנום RefSeq 12 (ערכי ברירת מחדל).
      1. בחר Tophat2 תחת כלי של NGS: ניתוח RNA. ציין את סוג הספרייה לזווג (סוף יחיד vs-סוף לזווג).
      2. העלה קובץ הקלט FASTQ מההיסטוריה הנוכחית. בחר את הגנום התייחסות. בחר את הגדרות ברירת המחדל. או להשתמש ברשימת הפרמטרים המלאה לשנות.
      3. Execute וזה יהיה לייצר שני קבצי פלט: אחד הוא מסלול BED UCSC של צמתים; עוד אחד הוא רשימה של מערכים לקריאה בפורמט BAM.
    4. העלאת קבצי BAM לכלי ניתוח נתוני רצף. חישוב ערכי ביטוי באמצעות קוואנטכלי ification.
    5. לזהות באופן דיפרנציאלי גנים למעלה מוסדרים באמצעות ביטוי כלי ניתוח ערכי ברירת מחדל ומקפל שינוי> 2 ו p-value <0.05. כמו כן, לזהות באופן דיפרנציאלי גנים למטה מוסדרים באמצעות ביטוי כלי ניתוח ערכי ברירת מחדל ומקפל שינוי <0.5 ו- p-value <0.05.
  2. ניתוח נתוני השבב Seq:
    1. יישר FASTQ מקריא hg19 באמצעות 13 Bowtie2 (ערכי ברירת מחדל) בגלקסיה.
      1. בחר Bowtie2 תחת הכלי של המל"ל: מיפוי. אמת, אם הספרייה עצמה לזווג זוג (יחיד-end vs-סוף לזווג). העלה את קובץ FASTQ מההיסטוריה הנוכחי.
      2. בחר את הגנום התייחסות. השתמש בהגדרות ברירת המחדל פרמטר. Execute וזה יהיה לייצר קובץ פלט עם רצף ממופה קורא כקובץ BAM. חזור על התהליך עבור כל קובץ רצף.
    2. לזהות פסגות באמצעות MACS 14 הפסקת p-value של 6.0e-7 ו- FDR של 0.01, כפי שתואר לעיל 2.
  3. Metabolomics ניתוח נתונים:
    1. המרה שמות כימיים של מטבוליטים כדי KEGG_IDs.
    2. לזהות מטבוליטים מוסדר באופן דיפרנציאלי על ידי השוואת רמות זוהה רכב vs. E2 שטופלו דגימות (א 2 לקפל חתוכים נעשה שימוש במחקר זה).
  4. ניתוח אינטגרטיבי:
    1. זיהוי גנים שיש להם אתרי קישור ERα באמצעות כלי ניתוח נתונים רצף. תרגום אזורים לתפקד גנים באמצעות 20 kb כמו מרחק חתוך.
    2. זיהוי הגנים למעלה ולמטה מוסדר באופן דיפרנציאלי מניתוח נתוני Seq RNA באמצעות שינוי לקפל> 2 ומקפלים שינוי <0.5, בהתאמה עם ערך p <0.05 כפי מנותקים. השוואה לרשימת גנים המכילים חייב אתר ERα באמצעות השוואה דיאגרמת ון.
    3. השתמש ברשימה זו כדי לזהות מסלולי מטבוליים מווסתים E2 באמצעות מודול 15 Metscape של cytoscape.
      1. על ידי בחירת מודול Metscape מיישומים, לבחור בניית רשת ולאחר מכן-bas המסלולאפשרות ed.
      2. בחר את האורגניזם (אדם). קובץ נתונים בוחר רשימה מתחמת מוסדרת E2 (KEGG ID) וכן E2 למעלה מוסדר רשימת גן.
      3. בחר מתחם -Reaction -Enzyme-ג'ין כסוג הרשת. בחר מתחם / גנים כמו השאילתה.
      4. בניית רשת. חזור באמצעות E2 למטה מוסדרת מתחם וגנים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

transcriptomics
כדי לנתח גנים לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי על ידי טיפול E2, בחרנו לבצע ניסוי RNA-seq. בנוסף לאספקת מידע על רמות ה- mRNA, נתוני Seq RNA יכול לשמש גם כדי לעקוב אחר שינויים ללא קידוד RNA (RNAs ללא קידוד ארוך, מיקרו-רנ"א) ואירועים שחבור חלופי. אנחנו לא מספקים מידע על ניתוח של RNAs ללא קידוד או לחילופין עיבד גנים, מאז היקף המחקר שלנו היא לזהות גנים המקודדים חלבונים שחשובים וויסות חילוף חומרים. עם זאת, RNA-seq הוא דרך מצוינת של...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במאמר זה תיארנו הדור וניתוח אינטגרטיבי של RNA-seq, שבב Seq ונתונים metabolomics מתאי MCF-7 כי מטופלים עם E2. פתחנו סדרה של פרוטוקולים האסטראטגי כדי לנצל את השיטות היעילות ביותר ואת מרכולתם רכה ידידותית למשתמש אשר מייצרות גילוי ביולוגי רלוונטי. למיטב ידיעתנו, ושלנו הוא המחקר הראשון לשלב נתוני -omics משלושה ניתוח שונה מסלולי מטבוליים חדשים זיהו כי ERα מוסדר ישירות בתאי סרטן השד.

transcriptomics
זה קריטי כדי ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אוניברסיטת אילינוי קיבל מענק החוקר שהופעלו מתוך פייזר ZME ו YCZ קיבל תמיכה משכורת מענק זה.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של המכון הלאומי המזון והחקלאות, משרד החקלאות של ארה"ב, פרס ILLU-698-909 (ZME) ופייזר, Inc (ZME). תוך הם באחריות בלעדית של הכותבים ואינם מייצגים בהכרח את הדעות הרשמיות של משרד החקלאות האמריקאי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תערובת טריגליצרידיםSigma17810-1AMP-S
חומצה אולאית SigmaO1257-10MGאבקה מסיסה במים חומצה אולאית 
TRIzolReagent Life טכנולוגיות 15596-026
Dynabeads חלבון Aטכנולוגיות חיים 10006D
Dynabeads חלבון Gטכנולוגיות חיים מהירה 10007D
QIAGEN28106בידוד DNA של דגימת קלט 
ערכת בידוד ChIP-DNA של ZYMO Zymo מחקר D5205ChIP DNA נקי & רכז
Quant-iTª PicoGreen¨ ערכת בדיקת dsDNAInvitrogen P7589כימות DNA
ללא RNase סטQIAGEN79254טיהור RNA
DEPC מים מטופלים LIFE TECH462224Dnase/Rnase דגם חינם
120 סוניק Dismembratorפישר סיינטיפיק FB120110עם 1/8 בדיקה 
  מתחם סאונד פישר סיינטיפיקפישר סיינטיפיק FB-432-Aלהפחתת קול
  שפופרות אפנדורף 5.0 מ"לאפנדורף 0030 119.401200 צינורות (2 שקיות של 100 ea.)
תערובת פריימר אקראית NEBS1330S
DNTP MIXNEBN0447S
M-MuLV Reverse TranscriptaseNEBM0253S
FastStart SYBR Green MasterROCHE4673484001
AgaroseFisher BP1601001.5% ג'ל אגרוז 
קיוביט RNA HS ערכת בדיקהטכנולוגיות חיים Q32852כימות RNA (100 בדיקות) 
פורמלדהידSigmaF8775
טבליות מעכב פרוטאז רוש 4693116001כל טבליה מספיקה למאגר ליזה של 10 מ"ל
טבליות קוקטייל מעכב פוספטאז PhosSTOPRoche 4906845001כל טבליה מספיקה למאגר ליזה של 10 מ"ל
ערכות בדיקת Qubitטכנולוגיות חיים Q32850עבור 100 בדיקות
מונה תאים אוטומטיצינור ORFLOMXZ000
מסובב VWR10136-084
Victor X5 קורא צלחות מרובות PerkinElmer2030-0050
מיקרוצנטריפוגה 5417REppendorf22621807
מעמד מגנטידיאגנודB04000001 
מערכת PCR מהירה בזמן אמתמדע יישומי 
ערכת טיהור PCR 4351405

מקורות

  1. Hamilton, K. J., Arao, Y., Korach, K. S. Estrogen hormone physiology: reproductive findings from estrogen receptor mutant mice. Reprod Biol. 14 (1), 3-8 (2014).
  2. Madak-Erdogan, Z., et al. Integrative genomics of gene and metabolic regulation by estrogen receptors alpha and beta, and their coregulators. Mol Syst Biol. 9, 676(2013).
  3. Gong, P., et al. Transcriptomic analysis identifies gene networks regulated by estrogen receptor alpha (ERalpha) and ERbeta that control distinct effects of different botanical estrogens. Nucl Recept Signal. 12, e001(2014).
  4. Bergamaschi, A., et al. The forkhead transcription factor FOXM1 promotes endocrine resistance and invasiveness in estrogen receptor-positive breast cancer by expansion of stem-like cancer cells. Breast Cancer Res. 16 (5), 436(2014).
  5. Madak-Erdogan, Z., et al. Nuclear and extranuclear pathway inputs in the regulation of global gene expression by estrogen receptors. Mol Endocrinol. 22 (9), 2116-2127 (2008).
  6. Madak-Erdogan, Z., Lupien, M., Stossi, F., Brown, M., Katzenellenbogen, B. S. Genomic collaboration of estrogen receptor alpha and extracellular signal-regulated kinase 2 in regulating gene and proliferation programs. Mol Cell Biol. 31, 226-236 (2011).
  7. Madak-Erdogan, Z., Ventrella, R., Petry, L., Katzenellenbogen, B. S. Novel roles for ERK5 and cofilin as critical mediators linking ERalpha-driven transcription, actin reorganization, and invasiveness in breast cancer. Mol Cancer Res. 12 (5), 714-727 (2014).
  8. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  9. Invitrogen. Quant-iT™ PicoGreen ® dsDNA Reagent and Kits. , Available from: http://www.nature.com/protocolexchange/system/uploads/3551/original/Quant-iT_Picogreen_dsDNA.pdf?1423512049 (2008).
  10. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  11. Quant-iT™ Assays for high-throughput quantitation of DNA, RNA, and oligos. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/F-065432%20quantit%20htp_FLR.pdf (2006).
  12. Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36(2013).
  13. Langdon, W. B. Performance of genetic programming optimised Bowtie2 on genome comparison and analytic testing (GCAT) benchmarks. BioData Min. 8, (2015).
  14. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq(MACS). Genome Biol. 9 (9), R137(2008).
  15. Gao, J., et al. Metscape: a Cytoscape plug-in for visualizing and interpreting metabolomic data in the context of human metabolic networks. Bioinformatics. 26, 971-973 (2010).
  16. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 7 (3), (2006).
  17. Mokry, M., et al. Efficient double fragmentation ChIP-seq provides nucleotide resolution protein-DNA binding profiles. PLoS One. 5 (11), e15092(2010).
  18. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).
  19. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  20. Hah, N., Kraus, W. L. Hormone-regulated transcriptomes: lessons learned from estrogen signaling pathways in breast cancer cells. Mol Cell Endocrinol. 382, 652-664 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

קולטן אסטרוגן אלפאמטבוליזם של סרטן השדריצוף RNAשיקוע אימונו-חלבון של כרומטיןאנליזה מטבולומיתתאי MCF-7טיפול באסטרדיולאנליזה אומית אינטגרטיביתמעגלי בקרה גנטיםסיגנלינג של קולטנים גרעיניים
ביולוגית מערכות ויסות חילוף חומרים על ידי איתות קולטן אסטרוגן לסרטן השד
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.