הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

כימות של ביטוי חלבון ו Co-לוקליזציה שימוש חיסונית-histochemical Multiplexed מכתים והדמיה Multispectral

12.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53837

⸱

8 באפריל 2016

 ,  ,  ,  , 
1Division of Urologic Surgery, Washington University in St. Louis School of Medicine, 2Department of Urology, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 4O’Brien Urology Research Center, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health

במאמר זה

סיכום

אימונוהיסטוכימיה היא טכניקת מעבדה רבת עוצמה להערכת לוקליזציה וביטוי של חלבונים בתוך רקמות. שיטות אוטומטיות למחצה לכימות מציגות סובייקטיביות ולעתים קרובות יוצרות תוצאות בלתי ניתנות לשחזור. כאן, אנו מתארים שיטות לאימונוהיסטוכימיה מרובה וכימות אובייקטיבי של ביטוי חלבון ולוקליזציה משותפת באמצעות הדמיה מולטי-ספקטרלית.

תקציר

אימונוהיסטוכימיה היא טכניקת זיהוי קלינית ומעבדת מחקר נפוצה לחקירת ביטוי חלבונים ולוקליזציה בתוך רקמות. מערכות כמותיות למחצה רבות פותחו לניקוד ביטוי באמצעות אימונוהיסטוכימיה, אך סובייקטיביות אינהרנטית מגבילה את יכולת השחזור והדיוק של התוצאות. יתר על כן, החקירה של סמנים ביולוגיים חופפים מרחבית כגון גורמי שעתוק גרעיניים קשה עם טכניקות אימונוהיסטוכימיה עדכניות. פיתחנו וביצענו אופטימיזציה של מערכת לחקירה בו-זמנית של חלבונים מרובים באמצעות שיטות תפוקה גבוהות של אימונוהיסטוכימיה מרובה והדמיה מולטי-ספקטרלית. אימונוהיסטוכימיה מרובה מבוצעת על ידי יישום רציף של נוגדנים ראשוניים עם נוגדנים משניים מצומדים לחזרת פרוקסידאז או פוספטאז אלקליין. כרומוגנים שונים משמשים לזיהוי כל חלבון מעניין. שקופיות מוכתמות נטענות לסורק שקופיות אוטומטי ונוצר פרוטוקול לרכישת תמונות אוטומטית. ספרייה ספקטרלית נוצרת על ידי צביעת קבוצה של שקופיות עם כרומוגן יחיד על כל אחת. תת-קבוצה של תמונות מוכתמות מייצגות מיובאות לתוכנת הדמיה מולטי-ספקטרלית ואלגוריתם להבחנה בין סוגי רקמות נוצר על ידי הגדרת תאי רקמה בתמונות. תאים תת-תאיים מפולחים על ידי שימוש בכתמים נגדיים של המטוקסילין והתאמת האלגוריתם הפנימי. סף מוחל כדי לקבוע חיוביות ולוקליזציה משותפת של חלבון. לאחר מכן האלגוריתם הסופי מוחל על כל מערך הרקמות. הנתונים המתקבלים מאפשרים למשתמש להעריך את ביטוי החלבון על סמך סוג הרקמה (למשל אפיתל לעומת סטרומה) ותא תאי (גרעין לעומת ציטופלזמה לעומת קרום פלזמה). ניתוח לוקליזציה משותפת מאפשר חקירה של סוגי תאים חיוביים כפולים, שליליים כפולים וחיוביים יחידים. שילוב של הדמיה מולטי-ספקטרלית עם אימונוהיסטוכימיה מרובה ורכישת תמונה אוטומטית היא שיטה אובייקטיבית בעלת תפוקה גבוהה לחקירת סמנים ביולוגיים בתוך רקמות.

מבוא

אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא טכניקת מעבדה סטנדרטית עבור זיהוי של חלבון בתוך רקמות, IHC עדיין נעשה שימוש נרחב הוא במחקר והן פתולוגיה אבחון. ההערכה של מכתים IHC היא בדרך כלל חצי כמותית, החדרת הטיה פוטנציאלית לתוך פרשנות של תוצאות. רבי גישות וכמותיות פותחו אשר משלבות הוא בעצמה מכתימה והיקף מכתים לתוך אבחנה סופית 1-4. מערכות אחרות כוללות עוצמת ניקוד ומיקום subcellular כדי למקם טוב יותר ביטוי 5. התאגדות של ממוצע ציונים של צופים רבים לעתים קרובות מנוצלת כדי למזער את ההשפעות של צופה יחיד הטיה 6. למרות מאמצים אלה, הסובייקטיביות ניתוח עדיין נשאר, במיוחד כאשר אנו מעריכים את מידת מכתים 7. סטנדרטיזציה פרוטוקול וסובייקטיביות מזעור מכניסת האדם הוא בעל חשיבות עליונה ליצירת תוצאות IHC מדויק, לשחזור.

תוכן "> ישנן אפשרויות אחרות מלבד IHC לקביעת ביטוי חלבון בתוך רקמות. בתוך מערך המחקר, אימונוהיסטוכימיה נצפתה באופן מסורתי כאמצעי לבחון חלבון לוקליזציה 8, ואילו טכניקות אחרות כגון immunoblotting נתפסות תקן זהב על חקירת ביטוי חלבון . רקמת קביעה או תא תא ספציפי ביטוי קשה בלי שילוב של טכניקות מתקדמות כגון לכידת ליזר חלוק או תא microdissection 9,10. שימוש נוגדני ניאון בשקופיות רקמות מציע פשרה סבירה, אבל autofluorescence רקע בשל NADPH, lipofuscins, רשתי סיבי קולגן, ואלסטין יכול לעשות quantitation מדויק קשה 11.

פלטפורמות פתולוגיה חישובית אוטומטיות הן כיוון מבטיח אלקטרוני כדי לכמת את המטרה יותר של מכתים פתולוגיה 12-15. שילוב הדמיה multispectral עם microarrays רקמותמאפשר ניתוח תפוקה גבוהה של ביטוי חלבון מדגם גדולה. בעזרת שיטות אלה, ניתוח של שיתוף לוקליזציה חלבון, ההטרוגניות מכתימים, ורקמות ולוקליזציה subcellular אפשרי תוך צמצום ניכר הוא הטיות מובנהיות וסיכון זמן דרוש לניתוח, תוך חזרת נתונים רציף ולא 16 בפורמט הקטגורים. לכן, מטרת המחקר הנוכחי הייתה להדגים את התועלת של ומתודולוגיה לביצוע אימונוהיסטוכימיה מרובב עם ניתוח, באמצעות תוכנת הדמיה multispectral.

פרוטוקול זה נכתב עבור ידני, מכתים immunohistochemical זמני של שקופית קטע רקמה אחת עם ארבעה נוגדנים חד שבטיים מותאמים. כניסוי נציג, אלפא קולטן אסטרוגן נגד ארנב גרעיני (ERα) ו קולטן האנדרוגן (AR) הם multiplexed עם קרום הנכנס אנטי עכבר CD147 קרום הנכנס אנטי עכבר E-cadherin. כל נוגדן של בחירה עשוי להיות substitutאד עבור הנוגדנים המפורטים להלן, אבל כל שילוב של נוגדנים דורש אופטימיזציה נפרד. טיפול קדם לכל הנוגדנים חייב להיות זהה. נוגדני AR ו CD147 צריכים להיות מותאמים באופן אינדיבידואלי ולאחר מכן כמו קוקטייל. כל נוגדן מזוהה באמצעות מערכת פולימר ללא ביוטין ואחד 4 chromogens ייחודי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: הפרוטוקול במסמך מתאר מכתים וניתוח של microarray רקמות (TMA), שתואר לעיל 12,17,18. 4 מיקרומטר עבה סעיף TMA הושג מבלוק פרפין באמצעות microtome סטנדרטי.

הערה: ספרייה ספקטרלי עבור 4 chromogens ו counterstain יש ליצור אלקטרוני כדי לכמת את התמונה. על מנת לעשות זאת, פרוטוקול אופטימיזציה עבור כל נוגדן פרט צריך לרוץ עם נוגדן אחד לכל שקופית, מינוס counterstain הסופי. שקופית חמישית צריכה להיות מוכתמת hematoxylin לייצר 5 התמונות הדרושות כדי ליצור את ספריית הרפאים.

1. Multiplex אימונוהיסטוכימיה

  1. מגלשות אופים בתנור C 60 מעלות במשך 20 דקות. שימוש במנדף כימי, לטבול שקופיות קסילן 100%. חזור על 2 שינויים של קסילן. לטבול שקופיות באתנול 100% במשך 5 דקות. חזור עם אתנול 100% טרי.
  2. לטבול שקופיות באתנול 95% במשך 3 דקות. חזור עם טרי95% אתנול. לטבול שקופיות באתנול 70% במשך 3 דקות. לטבול שקופית במים מזוקקים במשך 3 דקות. חזור עם מים מזוקקים טריים. שקופית קש אנכית לניקוז מים משקופית. החל 200 μl של חוסם peroxidase אנדוגני מוכן לשימוש במשך 5 דקות.
  3. מסננים חוסם peroxidase משקופית וטבלו 45 מ"ל מוכן לשימוש חיץ אחזור (pH פחות מ 7.0). מקום מיכל שקופיות בתוך סיר לחץ ותכנית להתחיל מוגדר 124 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות. אפשר בסיר לחץ להתקרר במשך 20 דקות. לפני הפתיחה.
  4. סור מכל של חיץ יחזור להתקרר 10 דקות נוספות. יש לשטוף שקופית במים מזוקקים למשך 10 דקות. מסנני מים משקופית ובזהירות להתוות את הרקמה בשקופית עם עט מחסום הידרופובי.
  5. הוסף 200 μl של פוספט בופר סליין (PBS) .Transfer שקופיות אל כלי קיבול שטוח עם מכסה (תא דגירה) המכיל גזה לחה.
  6. כן 1 ליטר 1x טריס שנאגר מלוח עם Tween-20 (TBST) על ידי דילול 50 מ 'l של 20x טריס שנאגרו מלוחים המכיל 1% Tween-20 ו -950 מ"ל מים מזוקקים.
  7. מסננים PBS משקופית ולהחיל 200 μl של 1x TBST. דגירה 2 דקות. מסנני TBST משקופית ולחזור שקופיות בתא דגירה. החל 200 μl של מוכן לשימוש בלוק חלבון אוניברסלי, תא קרוב דגירה במשך 7 דקות.
  8. מסננים לחסום חלבון ולחזור שקופיות בתא דגירה. לדלל נוגדן אנטי ERα 1: 400 על ידי הוספת 0.6 μl של נוגדנים 239.4 μl של diluent נוגדן. החל 200 μl של נוגדן מדולל להחליק קאמרי קרוב.
  9. דגירה שקופיות בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות. מסנני נוגדן משקופית ולשטוף עם TBST ואחריו טבילה למשך 5 דקות ב TBST.
  10. מסנני TBST משקופית ולחזור שקופיות בתא דגירה. החל 200 μl של מוכן לשימוש עז פולימר peroxidase חזר נגד הארנב קאמרי קרוב. דגירה למשך 30 דקות. בטמפרטורת החדר. שקופית לשטוף עם שקופיות TBST ומניחים מיכל של TBST במשך 5 דקות.
  11. כן חזרת חום peroxidase-3,3'-diaminobenzidine (HRP-DAB) אַב צֶבַע ידי הוספת 8 μl של אַב צֶבַע DAB 250 μl חיץ DAB מצע ערבוב טוב.
  12. מסננים TBST משקופית, בתמורה שקופיות בתא דגירה ולהחיל 200 μl של אַב צֶבַע חום HRP-DAB עבור 6 דקות. לשטוף ביסודיות את השקופית עם מים מזוקקים במקום שקופיות במיכל של מים מזוקקים.
  13. מערבבים את הפתרון denaturing ידי שילוב 50 μl של מגיב elution הראשון עם 150 μl של מגיב חיץ השני. מסננים מים את השקופית וליישם פתרון denaturing מדולל לשקופית במשך 3 דקות. בטמפרטורת החדר. למזוג ולשטוף denaturing מגיב עם TBST. לטבול שקופיות ב TBST במשך 5 דקות.
  14. הכן קוקטייל נוגדנים AR / CD147 ידי דילול 4.2 μl של נוגדן anti-AR ו -2.8 μl של נוגדן אנטי CD147 עם 203 μl של diluent נוגדן. מסננים TBST משקופית, לחזור שקופיות בתא דגירה ולהחיל 200 μl של ג AR / CD147ocktail לשקופית. תא סגור דגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. לשטוף שקופיות עם TBST וטבלו TBST במשך 5 דקות.
  15. מסננים TBST, בתמורה שקופיות בתא דגירה ולהחיל 200 μl של פולימר phosphatase אלקליין מוכן לשימוש עז נגד ארנב. תא סגור שקופיות דגירה במשך 30 דקות. בטמפרטורת החדר. לשטוף שקופיות עם TBST וטבלו TBST במשך 5 דקות.
  16. הכן phosphatase אלקליין אדום אַב צֶבַע על ידי הוספת 3.2 μl של אַב צֶבַע אדום 250 μl אדום חיץ אַב צֶבַע ומערבבים היטב.
  17. מסנני TBST משקופית ולחזור שקופיות בתא דגירה. החל 200 μl של אַב צֶבַע phosphatase אלקליין אדום מדולל לתא שקופיות, קרוב דגירה במשך 7 דקות.
  18. מסנני אַב צֶבַע וביסודיות לשטוף שקופיות עם מים מזוקקים. מניחים שקופיות במיכל של מים מזוקקים למשך 5 דקות. מסנני מים משקופית, לשטוף עם TBST ולחזור בתא דגירה. החל 200 μl עז פולימר אנטי עכבר HRP לשקופית קלותא דואר. דגירה למשך 30 דקות. בטמפרטורת החדר.
  19. מסנני פולימר משקופית ולשטוף עם TBST. שקופית מקום ב TBST במשך 5 דקות. הכן 200 μl של אַב צֶבַע סגול צמודי HRP על ידי הוספת 3.2 μl של מגיב ייצוב 250 μl של חיץ ומערבבים היטב. להוסיף 3.2 μl של אַב צֶבַע סגול ומערבבים היטב, ולאחר מכן 3.2 μl של מגיב מי חמצן ומערבבים היטב.
  20. מסננים TBST את השקופית וליישם 200 μl של אַב צֶבַע סגול מוכן להחליק דגירה במשך 7 דקות. בטמפרטורת החדר. שקופית לשטוף עם מגלשת מים ומקום מזוקק במכל של מים מזוקקים למשך 5 דקות.
  21. מערבבים את הפתרון denaturing על ידי ערבוב 50 μl של מגיב elution הראשון עם 150 μl של מגיב חיץ השני. מסננים מים את השקופית וליישם פתרון denaturing מדולל לשקופית במשך 3 דקות. בטמפרטורת החדר.
  22. לשטוף denaturing מגיב הסתלק TBST. מניחים שקופיות במיכל של TBST במשך 5 דקות. לדלל נוגדן אנטי E-cadherinעד 1: 200 על ידי הוספת נוגדנים 1.1 μl אל 218.9 μl diluent נוגדן. מסננים את TBST משקופית, בתמורה שקופיות בתא דגירה ולהחיל 200 μl של E-cadherin לשקופית. תא סגור דגירה 30 דקות. בטמפרטורת החדר.
  23. שקופית לשטוף עם שקופיות TBST ומניחים מיכל של TBST במשך 5 דקות. מסננים את TBST משקופית, לחזור שקופיות בתא דגירה ולהחיל 200 פולימר HRP אנטי עכבר μl עז. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. שקופית לשטוף עם שקופיות TBST ומניחים מיכל של TBST במשך 5 דקות.
  24. כן אַב צֶבַע HRP צמוד השחור על ידי הוספת 8 μl של אַב צֶבַע 250 חיץ μl. החל 200 μl אַב צֶבַע להחליק ולפתח 2 דקות. לשטוף ביסודיות שקופיות עם מים מזוקקים וטבל מיכל של מים מזוקקים.
  25. לדלל hematoxylin על ידי הוספת 40 μl hematoxylin 200 μl מים מזוקקים. מסנני מים משקופית ולהחיל 200 μl של hematoxylin בדילול להחליק במשך 30 שניות. שקופית לשטוףביסודיות במים זורמים מהברז למשך 2 דקות., ולאחר מכן לשטוף במים מזוקקים למשך 30 שניות. שקופית מקום בתנור C 60 מעלות במשך 15-30 דקות.
  26. לטבול שקופיות קסילן וטרי 100% למשך 30 שניות, לנגב קסילן עודף לסרוגין להוסיף טיפה אחת של תקשורת הרכבה קבעה. Coverslip עם coverslip מס '1.5.

2. רכישת תמונה אוטומטית וניתוח

  1. טען שקופיות מוכתמות על סורק שקופיות אוטומטי. בהתבסס על הקוטר, הפרדה, מספר ליבות TMA, ליצור פרוטוקול סריקה אוטומטית על פי הוראות ההפעלה של היצרן.
  2. תוכנת הדמית multispectral להרחיב לבנות ספריית רפאים מן השקופיות מלאות מוכתמות chromogens הפרט לבין השקופיות מוכתמות hematoxylin. פתח קוביית תמונת רכש שקופית מלאה ולחץ על ארבעה לחמישה תחומים עיקריים מוכתמים חיובי להגדיר אופטי כי אַב צֶבַע. חזור עם קוביות תמונת שקופיות בקרה אחרות עד representi ספרייה ספקטרלי מלאng כל chromogens נוצר, ולאחר מכן שמור את הספרייה רפאים.
  3. בגין פרויקט חדש בתוך תוכנת הדמיה multispectral. בחר "Multispectral (.im3)" עבור האפשרות פורמט התמונה ואת "Brightfield" עבור פורמט דגימה. ראשית, להגדיר את הפרויקט על ידי בחירת אפשרויות רצויות: "רקמות מגזר", "מצא את התכונות", "phenotyping", "ציון" ו "יצוא". בשלב זה, את רזולוציית התמונה ניתן לשנות כדי לזרז את זמן הניתוח אם תרצה בכך.

פילוח רקמות 3.

  1. ייבא את ספריית ספקטרלי שנוצרו בעבר ובחר כל chromogens להיכלל בניתוח.
  2. קוביות פתח את התמונה כדי להיכלל נתוני האימון להגדיר על ידי בחירת האפשרות "פתח תמונה Cube". כדי להגיע לרמת דיוק הדרכה, לבחור לפחות 18% של המספר הכולל של תמונות כדי להיות מנותח. בחר דימויים המייצגים את כל מצבי מחלה מנת לשפר את דיוק פילוח. חלק של תמונות זה אניהים שנקרא אימון הקבוצה של תמונות.
  3. תמונות איזון לבנות באימון שקבע בחירת הכלי טפטף עין ובחירת שטח בתמונה אחת כי הוא לבן.
  4. "מראש" בחר כפתור לעבור פילוח רקמות. השתמש בלוח "קטגוריות רקמות" לבחור סוגי רקמות להיות מנותח (כלומר "רקמה" ו- "לא-רקמות"). עבור לוקליזציה רקמת חלבון מדויקת יותר, קטגוריות רקמות מרובות ניתן להשתמש (כלומר. "Epithelia," "stroma," ו "רקמות שאינן").
  5. התחל ביצירת האלגוריתם והגדיר קטגוריות רקמה על ידי ציור סביב קבוצות של תאים בתוך תמונות אימונים. כאשר סיים עם קטגוריה ברקמה אחת, חזור עבור קטגוריות רקמה אחרות. הקפד לבחור קבוצות של תאים בתוך דימויים אופייניים לסוג בקטגורית רקמה.
  6. חזור על התהליך עבור כל התמונות בתוך אימון קבוצה של תמונות.
  7. רכיבים בחר (chromogens) להיכלל traiנינג עבור "Segmenter רקמות". בעת ביצוע ניתוח של תמונות אימונוהיסטוכימיה brightfield, כל הרכיבים כלולים בדרך כלל באימונים. כלול תמונות מכתימות שליליות בשפע האימונים להגדיר כדי למנוע הטיה במהלך שלב זה.
  8. בחר "סולם תבנית" מתאים לאימון segmenter הרקמות. תחת 20X גדל, בקנה מידת דפוס גדול הוא בדרך כלל מתאימה. כשעובדים עם רקמות עם הארכיטקטורה קנס בהגדלה גבוהה, בקנה מידה דפוס קטן מתאים יותר.
  9. בחר בלחצן "רקמות רכבת Segmenter" כדי להתחיל באימון segmenter הרקמות. שים דיוק מוקפץ תיבת מוצגות משקף השיעור של פיקסלים בתוך אזורי אימון מסווגות כראוי.
    הערה: התוכנה ללא הרף מנסה לשפר את הדיוק של האלגוריתם עד הפסיק באופן ידני. אנחנו הוכחנו בעבר כי הכשרה ב -18% של תוצאות תמונות דיוק אימון 97% 12.
  10. לאחר רקמת segmenter מאומן, לבחור ברזולוציית קטע מתאימה. מגזר ברזולוציה תואמת הזמן הנדרש תמונות מגזר, עם רזולוציה גסה הדורשת זמן פחות ונחישותו הנאצלת הדורשים יותר זמן.
  11. מגזר להגדיר את האימון כולו של תמונות על ידי לחיצה על "תמונות מגזריות". אפשר בפעם התוכנה נאותה ליישם את האלגוריתם על כל תמונות האימון. בסיום, לסקור את האימון מוגדר למצוא את כל רקמת סיווג שגויה עם אלגוריתם אימון הנוכחי.
  12. כדי לכוונן את תהליך פילוח הרקמות, להוסיף, לערוך, או להסיר אזורי אימון רקמות. השתמש באפשרות "קצוות לקצץ" אם פיקסלים להאריך בשולי בקטגוריה רקמה אחת לאחרת. אם מאפשרים לקבוצות קטנות של פיקסלים מסווגות באופן שגוי, להתאים את הסף על גודל פלח המינימום.
  13. כאשר עריכות הושלמו, בחר "תמונות מגזר", זה יהיה להתחיל מחדש לאמן את segmenter רקמות ליצור אלגוריתם חדש עבור פילוח רקמות. האלגוריתם הקודםהוא נשמר באופן אוטומטי וניתן חזר במידת הצורך.
  14. כאשר בטוח עם תוצאות אלגוריתם פילוח רקמות, להתקדם פילוח תא על ידי לחיצה על הכפתור "המתקדם".

חלוקת תאים 4.

  1. בחר את התאים subcellular להיכלל פילוח התא. ודא כי "גרעינים" כבר נבחרו לבחור "הציטופלסמה" או "ממברנה".
    הערה: "ממברנה" פילוח צריך להיבחר רק כאשר סמן חלבון ספציפי קרום נכלל IHC, כגון E-cadherin.
  2. בכרטיסייה "גרעינים", יש כמה אפשרויות. התחל בבחירת הגדרות מתאימות עבור פילוח גרעיני (ראה שלב 4.3). בחר אם קטגוריות פרט או כל רקמה תיכללנה פילוח.
  3. בחר בגישה עבור פילוח גרעיני
    1. בחר את counterstain "פיקסל מבוסס (Threshold)" גישה עבור שיטה פשוטה לקבלה טובהתוצאות בלי לדעת הרבה על הגדרות עיבוד תמונה.
      הערה: זו הופכת את הבחירה הראשונה טובה. בעת בחירת גישה, "פיקסל מבוסס (Threshold)" הוא מתאים יותר כאשר יש כתם מונה גרעיני אמין, בעוד "אובייקט מבוסס" אמור לשמש אם קיים מחסור של counterstain הגרעיני העקבי.
    2. בחר את הגישה "פיקסל המבוסס (Threshold)" כשיש counterstain גרעיני אמין.
      הערה: גישה זו היא אך ורק פיקסל מבוסס. גישה זו יכולה לשמש גם לצרכי ניתוח תמונה אחרים שיכול להיות מרוצה עם סף פשוט, כגון איתור כל הפיקסלים בתוך קטגורית רקמה להכתים חיובי עבור כתם IHC.
    3. בחר את הגישה מבוססת אובייקטים אם counterstain הגרעיני אינו מספק מכתים עקבי עצמים מסוימים גרעיניים, גישות המבוססות morphometry מתקדמות יותר יש צורך לזהות גרעינים.
    4. בחר "מרכיבי פילוח גרעיני", "Nuclאוזן גודל ", ו" לנקות "אם משתמש רוצה להגדיר הגדרות פילוח גרעינים נוספים.
  4. בחר פרמטרי צורה הציטופלסמה
    1. בחר בלחצן "המתקדם" לעבור פילוח הציטופלסמה.
      הערה: ישנן מספר אפשרויות בתוך פילוח הציטופלסמה לבחירה. אפשרות הכינה "מרחק פנימי לגרעין" היא פיקסל מבוסס. הוא משקף את המרחק בין החלק החיצוני של הגרעין הפנימי של הציטופלסמה. הגדלת ערך זה מקטין את ההסתברות כי האות גרעיני חוצה לתוך תא הציטופלסמה.
    2. הבא בחר "מרחק חיצוני לגרעין".
      הערה: זהו גם פיקסל מבוסס. המרחק החיצוני לגרעין משקף את המרחק בין החלק החיצוני של הגרעין לבין החלק החיצוני של התא. ערך זה יכול להיות מוגדר גדול או קטן מספיק כדי לכלול או לא לכלול אותות קרום אם תרצה בכך.
    3. בא בחר "גודל מינימאלי".
      הערה: הגודל המינימלי, pixel המבוסס, משקף את גודל מדגם הציטופלסמה המינימום להיכלל בניתוח. אם גודל הציטופלסמה קטן בתא מסוים כגון כאשר תאים צפופים יחד, פילוח הציטופלסמה זה נשלל מן הניתוח.
    4. בחר את האפשרות הבאה, "רכיב" עם "ראשי", "משני", ובחר "שליישונים" כאפשרויות משניות.
      הערה: כאן אפשר לבחור סמן הציטופלסמה ספציפי. בדומה לפילוח גרעיני, אם סמן ספציפי ציטופלסמית IHC נוצל בעבר, רכיב זה יכול לשמש כדי להגדיר את הציטופלסמה ידי מציאת ערך סף מינימום. זה מסייע בהגדרת הציטופלסמה אך אין זה הכרחי עבור דיוק מקובל.
    5. מעבר ל האחרון שלוש האפשרויות הלשוניות הוא "ממברנה". כאן, המשתמש מגדיר את תא קרום בטוש חלבון. בחר "ראשוניים", "משני", ו / או "שליישונים" עבור כל סמן קרום ספציפי בשימוש. התאם "מלא סולם OD "כדי למצוא סף מינימאלי או חיובי עבור כל סמן על קרום תא.
    6. המשך תחת הלשונית "ממברנה" ובחר באפשרות "גודל תא מקסימום".
      הערה: זהו המרחק לשווי קרום, בפיקסלים, אשר מציין את הגודל המרבי של התאים. ערך של 12 מתאים בדרך כלל עבור תמונות שצולמו בהגדלה 20X.
    7. לאחר בחירת כל האפשרויות, בחר "תמונת פלח" או "כל מגזר". להחיל את ההגדרות לתמונות ולבחון אותם "בנפרד" או במצב "גלריה".
      הערה: התאם את הגדרות ספים במידת צורך, מחדש קטע עד מרוצה מתוצאות פילוח תא אימון הקבוצה של תמונות.

5. phenotyping של תאים

הערה: חלוקת תאים מדויקת נדרשה על מנת לקבל phenotyping תא מדויק, ותכונת phenotyping היא שאפשר לאלף.

  1. השתמש "הוסף &# 34; כפתור להוסיף פנוטיפים לרשימת "פנוטיפים". משתמשים יכולים לבחור צבע עבור הפנוטיפ.
  2. לחץ על "פנוטיפים ערוכים" להקצות פנוטיפ לתא. לחץ על תא מסוים כדי להציג תפריט נפתח, המאפשרים למשתמש לבחור את הפנוטיפ ולאחר מכן להמשיך הלאה. לזהות לפחות חמש (5) תאי בכל פנוטיפ כדי להמשיך. בחירת 25 תאים או יותר של כל פנוטיפ הוא זקוק כדי להשיג תוצאות אופטימליות.

6. ניקוד IHC ושיתוף לוקליזציה

  1. בחר "מתקדם" כדי להעביר את "ציון IHC או אם" צעד. בחר "קטגורית רקמות" להבקיע.
    הערה: רק בקטגוריה ברקמה אחת יכולה להיות בקיעה במהלך ניתוח מסוים, אבל אם תוצאות ניקוד בקטגורית רקמה אחרת הם רצויים, הניתוח ניתן לחזור מאוחר יותר עם הגדרות שונות.
  2. בחר סוג "ניקוד" רצוי.
    הערה: חיוביות יוצרת שני פחים (חיוביים ושליליים) עבור רכיב של ריבית, בעוד משמשות חיוביות כפולות לניתוח שיתוף לוקליזציה. אפשרויות אחרות כוללות 4-סל, 10-בן, ו -50 סלים ניתוחים סמן בחירה.
  3. בחר את התא "תא" לשמש בקיע ניתוח.
  4. דומה למציאת סף מינימום של המערך הגרעיני הראשי, בחר "תצוגת רכיב נתונים" ו להזיז את הסמן מעל תמונות האימון למצוא ספי מינימום אופטי צפיפות מתאימה של מכתים עבור תאים חיוביים עבור הרכיב (ים) של עניין.
  5. אם תא צבעוני מאוד הם ייכללו, להנמיך את מקסימום הסף ברמה מתאימה. אחרת, להשתמש בלחצן האוטומטי לבחור מקסימום סף לניתוח.
  6. בחר להכשרת תמונות להבקיע כדי לאמת ערכי סף.
    הערה: אחוז התאים בתוך סל מסוים יוחזר ניתן להשוות ידי בדיקה ויזואלית או ספירה ידנית. לכשיושלם, בחר "מתקדם" כדי להמשיך לשלב "ייצוא".

7. החלת ניתוח אלגוריתם ו אצווה

  1. בדוק את האלגוריתם נוצר באמצעות פילוח רקמות, פילוח תא, וערכי בקיע ידי יצוא הנתונים עבור להגדיר את האימון. עקוב אחר הוראות כדי ליצור תיקייה חדשה עבור ספריית היצוא. תמונות וטבלאות בחר להיווצר נכללו בניתוח. לבצע את הניתוח על ידי בחירת "ייצוא עבור כל".
  2. שולחנות מיוצאים קבצי טקסט מופרדים בטאבים וניתן לפתוח בתוכניות ניתוח ביותר נתונים.
  3. כאשר הניתוח הושלם, להציג פילוח תא ניקוד נתונים עבור תמונות עם מכתים גבוה ונמוך כאחד להעריך דיוק של הגדרות.
  4. כשתהיה מרוצה עם הגדרות, להחיל את האלגוריתם נוצר מתוך אימון הקבוצה של תמונות על הסט השלם של תמונות באמצעות ניתוח יצווה. לחץ על כרטיסיית "הניתוח יצווה" ואת אלגוריתם הפתח יועתק מהפרויקט הפעיל.
  5. בחר ספריית יצוא חדשה ובחר אשר תמונות tables הם להיכלל בניתוח. תחת אפשרות קבצי קלט, בחר באפשרות "הוסף תמונות" ולבחור את כל התמונות להיכלל בניתוח יצווה.
  6. לבצע את הניתוח על ידי בחירה באפשרות "הפעל". כמו במקרה של הניתוח להגדיר את האימון, שלב זה ידרוש כמות משתנה של זמן, בהתאם להגדרות בפרט ומספר התמונות נכללו באנליזה.
  7. כאשר יושלם, להתקדם "סקירה / מיזוג" הכרטיסייה. ברירת מחדל של הספרייה יצווה לספריית היצוא מהניתוח יצווה ניתן לשנות אם תרצה בכך. בחר "כלול כל" ובחר "מיזוג" כדי ליצור גיליונות נתונים עם נתוני סיכום לניתוח.

8. ניתוח של יצוא נתונים

  1. פתח שולחנות לייצא תוכנה לניתוח נתונים ולהסיר או להסתיר עמודות נתונים שאינם רלוונטיים לניתוח, כגון ערכי מינימום ומקסימום עבור כל רכיב. הנתונים העיקריים המשמשים בניתוח נמצאים ג הצפיפות האופטי הממוצעolumn לכל רכיב.
  2. סקירה לייצא מפות פילוח ותמונות גלם כדי לקבוע אילו דוגמאות או ליבות TMA הם ייכללו מניתוח. ערכי אחוז רקמות לסייע בקביעה האם מדגם צריך להיכלל או לא, עם הפסקה שרירותית של <5% משמשת לרוב עבור קריטריונים דרים.
  3. סר נתונים לא רלוונטיים או שורות המכילות דגימות להיכלל ניתוח נתונים.
  4. השתמש בנתוני כימות חלבון לחקור שינויים במצב מחלה או יחסים עם מאפייני Clinico-פתולוגיים של המחלה 12,18-21.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

באיור 1, אימון מתבצע על רקמות ערמונית לתמונות קטע לחלקי אפיתל סטרומה, יחד עם התא שאינם רקמות. באמצעות E-cadherin סמן קרום אפיתל, חלוקת תאים בוצעה על מנת להפריד את הגרעין, הציטופלסמה, וכן חלקים קרום, שמוצג באיור 2.

בניסוי אחד, השתמשנו מרובב IHC לחקור את ביטוי לוקליזציה של AR, ERα, E-cadherin, ו CD147, כפי שמוצג

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השימוש אימונוהיסטוכימיה מסורתיים להערכת ביטוי החלבון הוא מוגבל על ידי שיטות סובייקטיביות, וכמותיות של ניתוח 22,23. פלטפורמות Advance נוצרו לניתוח תפוקה גבוהה הביטוי ולוקליזציה סמן ביולוגי. פילוח מפורט של שתי רקמות ותאים subcellular מאפשר למשתמשים ללמוד ביטוי סמן ביולוגי, לוקליזציה, ואת שיתוף לוקליזציה עם סמנים אחרים בעלי עניין. במחקרים קודמים, יש לנו הדגימו את התועלת של IHC והדמיה multispectral, במיוחד כאשר נעשה שימוש כדי ללמוד חלבונים מקומי לאותו 18,20,21 תא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

המחברים מודים אוניברסיטת יוזמות Translational מחקר ויסקונסין במעבדה לפתולוגיה, שנשען בחלקו על ידי UW המחלקה לפתולוגיה המעבדה לרפואה CA014520 P30 UWCCC מענק עבור שימוש במתקנים ושירותיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
XyleneFisher ChemicalX3F1GALדירוג NFPA: בריאות – 2, אש – 3 , תגובתיות – 0
אתיל אלכוהול-200 הוכחהפישר סיינטיפיק4355223דירוג NFPA: בריאות – 0, אש – 3 , תגובתיות – 0
Tris BaseFisher ScientificBP152-500דירוג NFPA: בריאות – 2, אש – 0 , תגובתיות – 0
Tris Hydroxymethyl aminomethane HClFisher ScientificBP153-1דירוג NFPA: בריאות – 2, אש – 0 , תגובתיות – 0
Tween 20Chem-Impex1512דירוג NFPA: בריאות – 0, אש – 1 , תגובתיות – 0
מי מלח חוצץ פוספטפישר סיינטיפיקBP2944-100דירוג NFPA: בריאות – 1, אש – 0 , תגובתיות – 0
PeroxidazedBiocare MedicalPX968יש להימנע ממגע עם העור והעיניים. עלול לגרום לגירוי בעור ולנזק לעיניים.
קולטן אסטרוגן אלפאתרמו פישר Scientific-LabvisionRM9101אינו מסווג כמסוכן
קולטן אנדרוגןSCBTsc-816אינו מסווג כמסוכן
CD147BiodesignP87535Mאינו מסווג כמסוכן
E-cadherinDakoM3612אינו מסווג כמסוכן
Renoir Red Andibody DiluentBiocare רפואיPD904הוא תוכנן במיוחד לעבודה עם נוגדנים מבוססי Tris
DeCloaking Chamber BiocareMedical Model DC2002נקוט באמצעי זהירות רגילים לשימוש בסיר לחץ
עט מחסום-Immuno Edge Vector LabsH-4000
Denaturing Kit-Elution StepBiocare MedicalDNS001Hלא מסווג כמסוכן
Mach 2 עז נגד ארנב HRP פולימרBiocare MedicalRHRP520לא מסווג כמסוכן
Mach 2 עז נגד ארנב AP PolymerBiocare MedicalRALP525לא מסווג כמסוכן
Mach 2 Goat Anti-Mouse HRP PolymerBiocare MedicalM3M530לא מסווג כמסוכן
Betazoid DAB Chromogen KitBiocare MedicalBDB20041. DAB ידוע כחשוד כמסרטן.
2. אין לחשוף רכיבי DAB לאור חזק או לאור שמש ישיר.
3. ללבוש ציוד מגן אישי ובגדים מתאימים.
4. DAB עלול לגרום לרגישות בעור. יש להימנע ממגע עם העור והעיניים.
5. שימו לב לכל הסביבה הפדרלית, הממלכתית והמקומית בנוגע לסילוק
ערכת כרוגן אדום עיוותBiocare MedicalWR806קורוזיבי. חומצה שעלולה לגרום לגירוי בעור או לנזק לעיניים. 
ערכת כרומוג'ן ירוק Vina BiocareMedicalBRR807מזיק אם נבלע
ערכת כרומין סגולה באג'ורןBiocare MedicalBJP807נוזל דליק. הרחק מחום, להבות וניצוצות. מזיק בבליעה או ספיגה. הימנע ממגע עם העור או העיניים, והימנע משאיפה.
חתול המטוקסיליןביוקר רפואיCATHEסגול   פתרון   עם   א   עדין   אצטי   חומצה   (חומץ)   ריח.   מאי   be
  מרגיז   ל   עור   או   העיניים.   הימנע מ  צור קשר   עם   עור   ו-  העיניים.   הימנע מ  בליעה.
XYL Mounting Mediaריצ'רד אלן8312-4דירוג NFPA: בריאות – 2, אש – 3, תגובתיות – 0
1.5 CoverslipsFisher Brand22266858קצוות חדים
דגירה (לחות) תאמיושןמיושןמספר ספקים זמינים
תנורהסעה יציב- תרמיC-4008-Q
רקע מגיב חוסם מענישBiocare MedicalBP974מוצר זה אינו מסווג כמסוכן. 
תוכנת inFormPerkinElmerCLS135781תוכנת הדמיה מולטי-ספקטרלית עיקרית המשמשת בכתבי יד
תוכנת Nuance תוכנתPerkinElmerNuance EXהמשמשת ליצירת ספריות ספקטרליות בתוך כתב יד
מיקרוסקופ Vectra וסורק שקופיותPerkinElmerVECTRAסורק שקופיות אוטומטי ומיקרוסקופ להשגת קוביות תמונה IM3

מקורות

  1. Valdman, A., et al. Expression of redox pathway enzymes in human prostatic tissue. Anal Quant Cytol Histol. 31 (6), 367-374 (2009).
  2. Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A., Olsen, D. A., Provost, E. Amplification of tissue by construction of tissue microarrays. Exp Mol Pathol. 70 (3), 255-264 (2001).
  3. Jonmarker, S., et al. Expression of PDX-1 in prostate cancer, prostatic intraepithelial neoplasia and benign prostatic tissue. APMIS. 116 (6), 491-498 (2008).
  4. McCarty, K. S., Miller, L. S., Cox, E. B., Konrath, J., McCarty, K. S. Sr Estrogen receptor analyses. Correlation of biochemical and immunohistochemical methods using monoclonal antireceptor antibodies. Arch Pathol Lab Med. 109 (8), 716-721 (1985).
  5. Volante, M., et al. Somatostatin receptor type 2A immunohistochemistry in neuroendocrine tumors: a proposal of scoring system correlated with somatostatin receptor scintigraphy. Mod Pathol. 20 (11), 1172-1182 (2007).
  6. Muris, J. J., et al. Immunohistochemical profiling of caspase signaling pathways predicts clinical response to chemotherapy in primary nodal diffuse large B-cell lymphomas. Blood. 105 (7), 2916-2923 (2005).
  7. Jaraj, S. J., et al. Intra- and interobserver reproducibility of interpretation of immunohistochemical stains of prostate cancer. Virchows Arch. 455 (4), 375-381 (2009).
  8. Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. J Histochem Cytochem. 14 (12), 929-931 (1966).
  9. Peters, T. J. Investigation of tissue organelles by a combination of analytical subcellular fractionation and enzymic microanalysis: a new approach to pathology. J Clin Pathol. 34 (1), 1-12 (1981).
  10. Emmert-Buck, M. R., et al. Laser Capture Microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
  11. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).
  12. Huang, W., Hennrick, K., Drew, S. A colorful future of quantitative pathology: validation of Vectra technology using chromogenic multiplexed immunohistochemistry and prostate tissue microarrays. Hum Pathol. 44 (1), 29-38 (2013).
  13. Rimm, D. L. C-Path: A Watson-Like Visit to the Pathology Lab. Science Translational Medicine. 3 (108), (2011).
  14. Fiore, C., et al. Utility of multispectral imaging in automated quantitative scoring of immunohistochemistry. J Clin Pathol. 65 (6), 496-502 (2012).
  15. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  16. Rizzardi, A. E., et al. Quantitative comparison of immunohistochemical staining measured by digital image analysis versus pathologist visual scoring. Diagn Pathol. 7, 42(2012).
  17. Bauman, T. M., et al. Characterization of fibrillar collagens and extracellular matrix of glandular benign prostatic hyperplasia nodules. PLoS One. 9 (10), e109102(2014).
  18. Bauman, T. M., et al. Beta-catenin is elevated in human benign prostatic hyperplasia specimens compared to histologically normal prostate tissue. Am J Clin Exp Urol. 2 (4), 313-322 (2014).
  19. Bauman, T. M., Ewald, J. A., Huang, W., Ricke, W. A. CD147 expression predicts biochemical recurrence after prostatectomy independent of histologic and pathologic features. BMC Cancer. 15 (1), 549(2015).
  20. Bauman, T. M., et al. Finasteride treatment alters tissue specific androgen receptor expression in prostate tissues. Prostate. 74 (9), 923-932 (2014).
  21. Nicholson, T. M., Sehgal, P. D., Drew, S. A., Huang, W., Ricke, W. A. Sex steroid receptor expression and localization in benign prostatic hyperplasia varies with tissue compartment. Differentiation. 85 (4-5), 140-149 (2013).
  22. Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49 (4), 411-424 (2006).
  23. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
  24. Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4 (7), 844-847 (1998).
  25. Ong, C. W., et al. Computer-assisted pathological immunohistochemistry scoring is more time-effective than conventional scoring, but provides no analytical advantage. Histopathology. 56 (4), 523-529 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

אימונוהיסטוכימיה מרובת-סמניםכימות ביטוי חלבוניםאנליזת קולוקליזציה של חלבוניםאלגוריתם לסגמנטציית רקמותיצירת ספרייה ספקטרליתשיטות לגילוי חרומוגןרכישת תמונות אוטומטיתאנליזה של מדורי תת-תארקמות לבדיקת סמנים ביולוגיים
כימות של ביטוי חלבון ו Co-לוקליזציה שימוש חיסונית-histochemical Multiplexed מכתים והדמיה Multispectral
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.