כימות של ביטוי חלבון ו Co-לוקליזציה שימוש חיסונית-histochemical Multiplexed מכתים והדמיה Multispectral

Summary

אימונוהיסטוכימיה היא טכניקת מעבדה רבת עוצמה להערכת לוקליזציה וביטוי של חלבונים בתוך רקמות. שיטות אוטומטיות למחצה לכימות מציגות סובייקטיביות ולעתים קרובות יוצרות תוצאות בלתי ניתנות לשחזור. כאן, אנו מתארים שיטות לאימונוהיסטוכימיה מרובה וכימות אובייקטיבי של ביטוי חלבון ולוקליזציה משותפת באמצעות הדמיה מולטי-ספקטרלית.

Abstract

אימונוהיסטוכימיה היא טכניקת זיהוי קלינית ומעבדת מחקר נפוצה לחקירת ביטוי חלבונים ולוקליזציה בתוך רקמות. מערכות כמותיות למחצה רבות פותחו לניקוד ביטוי באמצעות אימונוהיסטוכימיה, אך סובייקטיביות אינהרנטית מגבילה את יכולת השחזור והדיוק של התוצאות. יתר על כן, החקירה של סמנים ביולוגיים חופפים מרחבית כגון גורמי שעתוק גרעיניים קשה עם טכניקות אימונוהיסטוכימיה עדכניות. פיתחנו וביצענו אופטימיזציה של מערכת לחקירה בו-זמנית של חלבונים מרובים באמצעות שיטות תפוקה גבוהות של אימונוהיסטוכימיה מרובה והדמיה מולטי-ספקטרלית. אימונוהיסטוכימיה מרובה מבוצעת על ידי יישום רציף של נוגדנים ראשוניים עם נוגדנים משניים מצומדים לחזרת פרוקסידאז או פוספטאז אלקליין. כרומוגנים שונים משמשים לזיהוי כל חלבון מעניין. שקופיות מוכתמות נטענות לסורק שקופיות אוטומטי ונוצר פרוטוקול לרכישת תמונות אוטומטית. ספרייה ספקטרלית נוצרת על ידי צביעת קבוצה של שקופיות עם כרומוגן יחיד על כל אחת. תת-קבוצה של תמונות מוכתמות מייצגות מיובאות לתוכנת הדמיה מולטי-ספקטרלית ואלגוריתם להבחנה בין סוגי רקמות נוצר על ידי הגדרת תאי רקמה בתמונות. תאים תת-תאיים מפולחים על ידי שימוש בכתמים נגדיים של המטוקסילין והתאמת האלגוריתם הפנימי. סף מוחל כדי לקבוע חיוביות ולוקליזציה משותפת של חלבון. לאחר מכן האלגוריתם הסופי מוחל על כל מערך הרקמות. הנתונים המתקבלים מאפשרים למשתמש להעריך את ביטוי החלבון על סמך סוג הרקמה (למשל אפיתל לעומת סטרומה) ותא תאי (גרעין לעומת ציטופלזמה לעומת קרום פלזמה). ניתוח לוקליזציה משותפת מאפשר חקירה של סוגי תאים חיוביים כפולים, שליליים כפולים וחיוביים יחידים. שילוב של הדמיה מולטי-ספקטרלית עם אימונוהיסטוכימיה מרובה ורכישת תמונה אוטומטית היא שיטה אובייקטיבית בעלת תפוקה גבוהה לחקירת סמנים ביולוגיים בתוך רקמות.

Introduction

אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא טכניקת מעבדה סטנדרטית עבור זיהוי של חלבון בתוך רקמות, IHC עדיין נעשה שימוש נרחב הוא במחקר והן פתולוגיה אבחון. ההערכה של מכתים IHC היא בדרך כלל חצי כמותית, החדרת הטיה פוטנציאלית לתוך פרשנות של תוצאות. רבי גישות וכמותיות פותחו אשר משלבות הוא בעצמה מכתימה והיקף מכתים לתוך אבחנה סופית ^1-4. מערכות אחרות כוללות עוצמת ניקוד ומיקום subcellular כדי למקם טוב יותר ביטוי ^5. התאגדות של ממוצע ציונים של צופים רבים לעתים קרובות מנוצלת כדי למזער את ההשפעות של צופה יחיד הטיה ^6. למרות מאמצים אלה, הסובייקטיביות ניתוח עדיין נשאר, במיוחד כאשר אנו מעריכים את מידת מכתים ^7. סט....

Protocol

הערה: הפרוטוקול במסמך מתאר מכתים וניתוח של microarray רקמות (TMA), שתואר לעיל ^12,17,18. 4 מיקרומטר עבה סעיף TMA הושג מבלוק פרפין באמצעות microtome סטנדרטי.

הערה: ספרייה ספקטרלי עבור 4 chromogens ו counterstain יש ליצור אלקטרוני כדי לכמת את התמונה. על מנת לעשות זאת, פרוטוקול אופטימיזציה עבור כל נוגדן פרט צריך לרוץ עם נוגדן אחד לכל שקופית, מינוס counterstain הסופי. שקופית חמישית צריכה להיות מוכתמת hematoxylin לייצר 5 התמונות הדרושות כדי ליצור את ספריית הרפאים.

1. Multiplex אימונוהיסטוכימיה

Results

באיור 1, אימון מתבצע על רקמות ערמונית לתמונות קטע לחלקי אפיתל סטרומה, יחד עם התא שאינם רקמות. באמצעות E-cadherin סמן קרום אפיתל, חלוקת תאים בוצעה על מנת להפריד את הגרעין, הציטופלסמה, וכן חלקים קרום, שמוצג באיור 2.

בניסוי אחד, השתמשנו מרובב IHC לחקור את ביטוי לוקליזציה של AR, ERα, E-cadherin, ו CD147, כפי שמוצג

Discussion

השימוש אימונוהיסטוכימיה מסורתיים להערכת ביטוי החלבון הוא מוגבל על ידי שיטות סובייקטיביות, וכמותיות של ניתוח ^22,23. פלטפורמות Advance נוצרו לניתוח תפוקה גבוהה הביטוי ולוקליזציה סמן ביולוגי. פילוח מפורט של שתי רקמות ותאים subcellular מאפשר למשתמשים ללמוד ביטוי סמן ביולוגי, לוקליזציה, ואת שיתוף לוקליזציה עם סמנים אחרים בעלי עניין. במחקרים קודמים, יש לנו הדגימו את התועלת של IHC והדמיה multispectral, במיוחד כאשר נעשה שימוש כדי ללמוד חלבונים מקומי לאותו ^18,20,21 תא.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylene	Fisher Chemical	X3F1GAL	דירוג NFPA: בריאות – 2, אש – 3 , תגובתיות – 0
אתיל אלכוהול-200 הוכחה	פישר סיינטיפיק	4355223	דירוג NFPA: בריאות – 0, אש – 3 , תגובתיות – 0
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500	דירוג NFPA: בריאות – 2, אש – 0 , תגובתיות – 0
Tris Hydroxymethyl aminomethane HCl	Fisher Scientific	BP153-1	דירוג NFPA: בריאות – 2, אש – 0 , תגובתיות – 0
Tween 20	Chem-Impex	1512	דירוג NFPA: בריאות – 0, אש – 1 , תגובתיות – 0
מי מלח חוצץ פוספט	פישר סיינטיפיק	BP2944-100	דירוג NFPA: בריאות – 1, אש – 0 , תגובתיות – 0
Peroxidazed	Biocare Medical	PX968	יש להימנע ממגע עם העור והעיניים. עלול לגרום לגירוי בעור ולנזק לעיניים.
קולטן אסטרוגן אלפא	תרמו פישר Scientific-Labvision	RM9101	אינו מסווג כמסוכן
קולטן אנדרוגן	SCBT	sc-816	אינו מסווג כמסוכן
CD147	Biodesign	P87535M	אינו מסווג כמסוכן
E-cadherin	Dako	M3612	אינו מסווג כמסוכן
Renoir Red Andibody Diluent	Biocare רפואי	PD904	הוא תוכנן במיוחד לעבודה עם נוגדנים מבוססי Tris
DeCloaking Chamber	Biocare	Medical Model DC2002	נקוט באמצעי זהירות רגילים לשימוש בסיר לחץ
עט מחסום-Immuno Edge	Vector Labs	H-4000
Denaturing Kit-Elution Step	Biocare Medical	DNS001H	לא מסווג כמסוכן
Mach 2 עז נגד ארנב HRP פולימר	Biocare Medical	RHRP520	לא מסווג כמסוכן
Mach 2 עז נגד ארנב AP Polymer	Biocare Medical	RALP525	לא מסווג כמסוכן
Mach 2 Goat Anti-Mouse HRP Polymer	Biocare Medical	M3M530	לא מסווג כמסוכן
Betazoid DAB Chromogen Kit	Biocare Medical	BDB2004	1. DAB ידוע כחשוד כמסרטן. 2. אין לחשוף רכיבי DAB לאור חזק או לאור שמש ישיר. 3. ללבוש ציוד מגן אישי ובגדים מתאימים. 4. DAB עלול לגרום לרגישות בעור. יש להימנע ממגע עם העור והעיניים. 5. שימו לב לכל הסביבה הפדרלית, הממלכתית והמקומית בנוגע לסילוק
ערכת כרוגן אדום עיוות	Biocare Medical	WR806	קורוזיבי. חומצה שעלולה לגרום לגירוי בעור או לנזק לעיניים.
ערכת כרומוג'ן ירוק Vina Biocare	Medical	BRR807	מזיק אם נבלע
ערכת כרומין סגולה באג'ורן	Biocare Medical	BJP807	נוזל דליק. הרחק מחום, להבות וניצוצות. מזיק בבליעה או ספיגה. הימנע ממגע עם העור או העיניים, והימנע משאיפה.
חתול המטוקסילין	ביוקר רפואי	CATHE	סגול   פתרון   עם   א   עדין   אצטי   חומצה   (חומץ)   ריח.   מאי   be   מרגיז   ל   עור   או   העיניים.   הימנע מ  צור קשר   עם   עור   ו-  העיניים.   הימנע מ  בליעה.
XYL Mounting Media	ריצ'רד אלן	8312-4	דירוג NFPA: בריאות – 2, אש – 3, תגובתיות – 0
1.5 Coverslips	Fisher Brand	22266858	קצוות חדים
דגירה (לחות) תא	מיושן	מיושן	מספר ספקים זמינים
תנור	הסעה יציב- תרמי	C-4008-Q
רקע מגיב חוסם מעניש	Biocare Medical	BP974	מוצר זה אינו מסווג כמסוכן.
תוכנת inForm	PerkinElmer	CLS135781	תוכנת הדמיה מולטי-ספקטרלית עיקרית המשמשת בכתבי יד
תוכנת Nuance תוכנת	PerkinElmer	Nuance EX	המשמשת ליצירת ספריות ספקטרליות בתוך כתב יד
מיקרוסקופ Vectra וסורק שקופיות	PerkinElmer	VECTRA	סורק שקופיות אוטומטי ומיקרוסקופ להשגת קוביות תמונה IM3