CRISPR וקטור בינוי אפיון תפוקה גבוהה של שינויי DNA על ידי דור של שורשי עגבניות שעירים

Summary

באמצעות הרכבת DNA, וקטורי CRISPR מרובים ניתן לבנות במקביל לתגובת שיבוט יחידה, מה שהופך את הבנייה של מספר רב של CRISPR וקטורי משימה פשוטה. עגבניות שורשי שעירים מהווים מערכת מודל מצוינת כדי לאמת וקטורי CRISPR וליצור חומרי מוטציה.

Abstract

מוטציות DNA ממוקדות שנוצרו על ידי וקטורים עם טכנולוגיית CRISPR/Cas9 הוכחו כשימושיות למחקרי גנומיקה פונקציונלית. בעוד שרוב אסטרטגיות השיבוט פשוטות לביצוע, הן בדרך כלל משתמשות במספר שלבים ויכולות לדרוש מספר ימים כדי ליצור את המבנים האולטימטיביים. השיטה המוצגת כאן מבוססת על הרכבת DNA ויכולה לייצר וקטורי CRISPR פונקציונליים לחלוטין בתגובת שיבוט אחת. ניתן גם לאגד בניית וקטור, מה שמגדיל עוד יותר את היעילות והתועלת של התהליך. שינוי של השיטה משמש ליצירת וקטורי CRISPR עם מטרות גנים מרובות. לאחר מכן, וקטורי CRISPR הופכים לשורשים שעירים של עגבניות כדי ליצור חומרים טרנסגניים עם שינויים ממוקדים ב-DNA. שורשים שעירים הם מערכת שימושית לבדיקת פונקציונליות וקטורית מכיוון שהם פשוטים מבחינה טכנית לייצור וניתנים לייצור בקנה מידה גדול. לשיטות המוצגות כאן יהיה יישום רחב מכיוון שניתן להשתמש בהן ליצירת מגוון וקטורים של CRISPR ולהשתמש בהן במגוון רחב של מיני צמחים.

Introduction

היכולת ליצור שינויי DNA ממוקדים עם CRISPR / יש Cas9 פוטנציאל גדול ללימודי גנומיקה תפקודית. ישנם שני מרכיבים של מערכת CRISPR / Cas9; nuclease Cas9, נגזר pyogenes Staphylococcus ו RNA מדריך כ 100-NT (gRNA) מולקולה שמנתב Cas9 לאתר DNA ממוקד (ים) ^1. זיהוי מטרות הוענק על היד הראשונה ~ 20-NT של gRNA, המאפשר לייצור תפוקה גבוהה של וקטורי מיקוד ^2,3. רוב האורגניזמים שיכול להיות מהונדסים, כבר היה עם CRISPR / Cas9 הטכנולוגיה ^4,5.

בצמחים, יזמים מכוננים, כמו המקדם 35S CaMV, משמשים בדרך כלל לנהוג הביטוי של nuclease Cas9 ^6. GRNAs באים לידי ביטוי באמצעות היזמים U6 או U3 RNA פולימראז III המגביל את הבסיס הראשון של gRNA או א G עבור U6 או עבור U3, שעתוק יעיל. עם זאת RNA פולימראז II לנשףoters, שהם ללא הגבלות אלה, יש גם שימש ^7,8.

gRNAs שונים לגרום מוטציות DNA עם יעילות שונים, ולכן זה יכול להיות חשוב כדי לאמת וקטורים CRISPR הראשון לפני השקעה טרנספורמציות כל-צמח או הגדרת מסכי פנוטיפי נרחב. ביטוי חולף של CRISPR בונה בצמחים, באמצעות agroinfiltration למשל, בדרך כלל תוצאות בתדירות נמוכה יותר של שינוי ה- DNA לעומת צמחים יציבים ^6, ביצוע זיהוי של מוטציות מבחני פנוטיפי קשות מעשיים עם גישות כאלה. מה שנקראו שורשי שעירים הם מערכת נוחה, חלופה מאז מספר רב של עצמאיים, חומרים טרנספורמציה ביציבות יכול להיוצר תוך מספר שבועות, בניגוד לחודשים לצמחים יציבים. וקטורי CRISPR יעילים מאוד גרימת מוטציות DNA ב שורשי שעירי ^9,10.

שיטות הרכבת DNA ולקשור ביעילות שברת DNA המכיל overlapping מסתיים ^11. יתרון עיקרי של כמה שיטות הרכבת DNA הוא היכולת לשלב ssDNA (כלומר, oligos) לתוך המוצרים הנאספים. מאז gRNAs הוא רק ~ 20-NT ארוך מטרות חדשות יכולות להתבצע עם oligos המסונתז, שיטות הרכבת DNA אלה בהחלט מתאימות לשיבוט CRISPR. הפרוטוקולים המתוארים כאן מבוססים על סדרת P201 של וקטורי CRISPR כי נעשה שימוש בהצלחת סויה ^10, צפצפת ¹² ועכשיו עגבניות. תהליך השכפול הציג מציע מספר יתרונות על פני שיטת השיבוט הנוכחית ^10. כלומר, וקטורים מתפקדים במלואה יכולים להיוצר תגובת שיבוט יחידה ביום אחד. בניית וקטור ניתנת ותקווה גם כדי לייצר וקטורי CRISPR מרובים במקביל, מקטינה עוד יותר ידות על עלויות זמן וחומר. כמו כן, אנו מציגים פרוטוקול ההדור של שורשי שעירים עגבניים כמו שיטה יעילה להפקת חומרים מהונדסים עם מחיקות גן ממוקדות. שורשי שעירים משמשים תקףאכלו הווקטורים CRISPR ולספק חומר לניסויים הבאים.

Protocol

1. עיצוב מדריך RNA ובינוי וקטור

1. לזהות רצפי היעד עבור הגנים של עניין. יש מגוון של תוכניות יעד-מציאת CRISPR באינטרנט מתאימה בשלב זה ^13,14.
   הערה: כאן אנו משתמשים מוטיב היעד GN ₂₀ GG, אבל עיצובים אחרים עשויים להיות מתאימים בהתאם למערכת יישום או וקטור בשימוש.
2. עיצוב 60-mer oligos gRNA לכלול את חלק ₁₉ GN של מוטיבי היעד מוקפים 5 'ו 3' 20-NT רצפים שנדרשים הרכבת DNA. מוטיב 60-mer הסופי הוא: 5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN ₁₉ -GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3 ".
   הערה: רגיל, desalted פריימרים לעבוד בסדר.
3. הכן את הארבע DNAs להרכבה (איור 1). ראה קובץ משלים רצפי DNA.
   1. תקציר 1 - 5 מיקרוגרם של p201N: Cas9 ¹⁰ פלסמיד עם אנזים הגבלה Spe לי ב 1x הצפת 4 ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. טור-לטהר את לעכלccording להוראות היצרן. Resuspend ב ~ 15 μl של 10 mM Tris-HCl, ולכמת ידי spectrophotometry UV.
   2. בצע לעכל שני עם אנזים ההגבלה Swa לי ב 1x הצפת 3.1 ב 25 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. בדקו 100 - 200 ng על ג'ל agarose 0.8% כדי לאשר עיכול שלם.
      הערה: פלסמיד מתעכל כראוי יהיה להקה אחת ב 14,313 BP. הערה: איון חום של האנזים dephosphorylation אינו נדרש. פלסמיד מתעכל עשוי להיות מאוחסן ב -20 ° C.
   3. PCR להגביר את truncatula Medicago (הר) DNAs האמרגן פיגום U6 מן הפלסמיד Puc gRNA הסעות ¹⁰ באמצעות פריימרים Swa I_MtU6F / MtU6R ו ScaffoldF / Spe I_ScaffoldR, בהתאמה. השתמש פולימראז באיכות גבוהה עם תנאי PCR: 95 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות; 31 מחזורים (98 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 72 ° C למשך 30 שניות); ו 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
      1. דמיינו ~ 3 aliquots μl של pr PCRoducts על ג'ל agarose 1% כדי לאשר הגברה. Amplicon MtU6 הוא 377 נ"ב ואת amplicon הפיגום הוא 106 נ"ב. טור-לטהר את מוצרי ה- PCR שנותרו על פי הוראות היצרן, לכמת ידי לספקטרופוטומטריה UV ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
   4. Resuspend הצינור כולו של oligos gRNA 100 מיקרומטר במים מעבדה כיתה. הוסף 1 μl של 100 מיקרומטר אוליגו 500 μl של 1x הצפת 2.1. מערבבים היטב. אם איגום oligos המרובה, להוסיף 1 μl של כל אוליגו 100 מיקרומטר אל צינור 1x הצפת 2.1. oligos המדולל ניתן לאחסן ב -20 ° C.
4. לתכנת Cycler תרמית להחזיק ב 50 מעלות צלזיוס, באמצעות מכסה מחומם. מערבבים 100 ננוגרם (0.011 pmol) של וקטור לינארית, 50 ng (0.2 pmol) של האמרגן MtU6, 12 ng (0.2 pmol) של הפיגום, 1 μl (0.2 pmol) של אוליגו gRNA מדולל (ים), ומים בהיקף של 5 μl. הוסף 5 μl של תמהיל מאסטר הרכבה DNA באיכות גבוהה 2x, מערבבים היטב ספין למטה. דגירת תגובה במשך 60 דקות ב50 ° C Cycler תרמית. אז במקום את התגובה על הקרח.
   הערה: ניתן להגדיל כמויות תגובה כדי להתאים תשואות DNA נמוכות.
5. Transform 2 μl של התגובה לתוך E. המוסמכת קולי תאים באמצעות טכניקות סטנדרטיות צלחת על LB בתוספת 50 מ"ג ל ^-1 kanamycin (Kan _50). לגדול-תאים מצופים ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. שמור את תגובת ההרכבה DNA הנותר ב -20 ° C.
6. מסך המושבה על ידי PCR באמצעות פריימרים StUbi3P218R ו ISceIR. לדלל aliquot של תגובת ההרכבה DNA הנותרת במים 1: 5. השתמש 1 μl כביקורת חיובית עבור מסך המושבה 1 ננוגרם של p201N המעגלי: פלסמיד Cas9 כביקורת ללא הוספה.
   1. PCR להגביר את התנאים; 95 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות; 31 מחזורים (95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 58 ° C למשך 30 שניות, 72 ° C למשך 30 שניות); ו ב 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. דמיינו מוצרי ה- PCR על ג'ל 1% agarose. ודא הוספות נכונות יש להקה ב 725 נ"ב ו וקטורי שנינותמוסיף Hout (למשל, וקטור נימול) תהיה להקה 310-BP.
7. לגדול מושבות חיוביות LB Kan ₅₀ תרבויות נוזלי הלילה בשעת 37 ° C ולטהר פלסמידים פי הוראות היצרן. רצף סנגר פלסמידים עם פריימר StUbi3P218R וליישר chromatograms אמרגן MtU6, היעד, רצפי הפיגום כדי להבטיח שאין טעויות הוכנסו במהלך שיבוט.
8. בצע אבחון לעכל ידי לעכל ~ 1 מיקרוגרם של פלסמיד עם RV אקו ואני בדיר דמיינו על ג'ל 0.8% agarose. שברים (ב BP) הם: 4192, 2001, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, ו -174.
9. השתמש הרכבת DNA לבנות וקטורים עם gRNAs המרובה.
   1. כדי לבנות וקטור עם שתי קלטות gRNA, PCR להגביר את gRNA-העמדה הראשונה עם פריימרים Swa I_MtU6F / UNS1_ScaffoldR ואת gRNA שנייה עמדה עם פריימרים UNS1_MtU6F / Spe I_ScaffoldR מ -1 ng של כל אחד בהתאמהפלסמידים נבנה בשלבים 1.1 - 1.8. השתמש תנאי PCR בשלב 1.3.3. דמיינו ~ 3 aliquots μl של מוצרי ה- PCR על ג'ל agarose 1% כדי לאשר הגברה. Amplicons הם ~ 500 נ"ב.
   2. מערבבים ומערבבים כמויות שווה של מוצרי ה- PCR מטוהרים האו"ם בתוך שפופרת 200 μl (בדרך כלל 3 - 4 μl של כל אחד). להרכבה, להוסיף 1 μl בשילוב מוצרי ה- PCR, 50 ng של Swa לי ו SPE שאני לינארית p201N: Cas9, מים מעבדה כיתה 2.5 μl 2.5 μl של תמהיל מאסטר הרכבה DNA באיכות גבוהה 2x. מדגירים את Cycler תרמית 50 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
      הערה: מדריכי DNA ההרכבה ממליץ על דגירת 15 דקות עבור 2 - 3 שברים.
   3. Transform 1 - 2 μl לתוך E. המוסמכת תאי צלחת coli על LB Kan _50. לגדל תאים מצופים ב 37 מעלות צלזיוס למשך לילה. שמור את התגובה הנותרים ב -20 ° C.
   4. מסך מושבה על ידי PCR עם פריימרים StUbi3P218R ו ISceIR עם אותם התנאים כמו צעד 1.6. ג הנכונהlones תהיה amplicon 1,200 נ"ב. לגדול מושבות חיוביות LB Kan ₅₀ תרבויות נוזלי הלילה ולטהר פלסמידים.
   5. פלסמידים רצף סנגר עם StUbi3P218R פריימרים (מכסה-העמדה הראשונה gRNA) ו p201R (מכסה-העמדה השנייה gRNA). יישר chromatograms אל רצפי אמרגן, יעד, פיגום MtU6. האבחון לעכל עם RV אקו בדיר שאני אביא את שהברים הבאים (נ"ב): 4192, 2476, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, 174. שבר מודגש מכיל את gRNA השני.
10. אחרי הפגישה כל הציפיות-בקרת איכות, להפוך פלסמידים לתוך Agrobacterium rhizogenes זן ARqua1 ^15. הוסף 1 μl של הכנה פלסמיד 50 μl של תאים electrocompetent ו electroporate ב קובט 1 מ"מ עם הגדרות: 2.4 קילו וולט, 25 μF, ו -200 Ω. שחזור תאים ~ 500 μl של SOC ולנער על 28 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. פלייט על LB Kan ₅₀ גרםשורה על 28 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים. בצע מסך המושבה באמצעות באותו פריימרים ותנאי PCR כמו 1.3.3. הפוך מניות גליצרול של שיבוטים חיוביים.

2. טרנספורמציה שעירים שורש

1. לעקר זרעי עגבניות ב אקונומיקה ביתית 20% במשך 15 דקות, עם ערבוב מתמיד. במנדף זרימה למינרית, להסיר את האקונומיקה ולשטוף במי מעבדת כיתה סטריליים 3 פעמים.
2. פלייט 30 זרעים בקופסה GA-7 המכיל התקשורת ½ MS (2.22 גרם ל ^-1 מלחים MS + Gamborg ויטמינים, 10 גרם ל ^-1 סוכרוז, 3 גרם ל ^-1 מסטיק gellan, pH 5.8). לנבוט עבור ~ 2 ימים בחושך, ואז לעבור GA-7 תיבות אור. לגדל שתילים עבור ~ 4 ימים יותר באור.
3. היום לפני השינוי, מתוך פס א rhizogenes תרבויות על LB Kan ₅₀ ולגדול מוצק ב 28 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
4. יום של טרנספורמציה, בשכונת הזרימה למינרית להרכיב חומרים מעוקרים: 12 מיליליטר צינורות תרבות, 50 מ"ל צינור חרוטים, ½ נוזל MS (לא גרם gellanאממ), 200 מיקרומטר acetosyringone, נייר סינון, צלחות פטרי, מלקחיים אזמל, טפטפות וטיפים פיפטה. הוסף 25 μl של acetosyringone 50 מ"ל של ½ MS ויוצקים ~ 6 מ"ל לתוך צינור אחד תרבות.
5. השתמש טיפ 200 μl כפוף לגרד א rhizogenes תאים מהצלחת ו resuspend ב 6 מ"ל של נוזל ½ MS. הצינור וורטקס resuspend התאים לחלוטין. לאחר resuspending תאים מפני כל וקטור, למדוד את הצפיפות האופטית (OD) של 1 מיליליטר של תאים באורך גל קבוע של 600 ננומטר. ודא OD הוא בין 0.2 ו 0.4; לדלל או להוסיף עוד תאים לפי הצורך. חזור על הפעולה עבור כל מבנה.
6. הוסף ~ 2 מ"ל של נוזל ½ MS כדי בצלחת פטרי עם נייר סינון סטרילי. cotyledons בלו מן השתילים ומניחים על נייר פילטר טבול. לאחר כל cotyledons כבר נאספו, לחתוך את דיסטלי ~ 1 ס"מ הנחה של cotyledons, וכתוצאה מכך חלקים טבורית עם שני הקצוות לחתוך. להוסיף explants א פתרונות rhizogenes, לערבב, דגירה במשך 20 דקותעם היפוך מזדמן.
   הערה: כ 12 explants לכל לבנות משמשים באופן שגרתי, אם כי רבים כמו 80 explants כבר מחוסן ב 6 מ"ל של א פתרון rhizogenes.
7. במהלך א דגירת rhizogenes, להוסיף נייר סינון כדי צלחות פטרי, לבנות לכל אחד טרנספורמציה. כמו כן נקבע ½ MS תקשורת מוצקה, ללא אנטיביוטיקה, בשכונת הזרימה למינרית לייבוש.
8. סקופ cotyledons מתוך א פתרון rhizogenes עם מלקחיים ומניחים סטרילי על נייר סינון יבש. מכסים עם מכסה פטרי כדי להבטיח רקמות שלא יתייבשו תוך שתמשיך השינוי הבא. cotyledons הכתם על נייר הסינון והעברה, abaxial כלפי מעלה, כדי ½ תקשורת MS. גלישת צלחות עם הקלטת וכירורגי שיתוף לטפח בחושך בטמפרטורת החדר למשך 2 ימים.
9. לאחר שיתוף טיפוח, cotyledons העברה, abaxial כלפי מעלה, כדי ½ התקשורת MS בתוספת 300 מ"ג ל ^-1 ticarcillin / חומצה clavulanic (טים _300, כדי למנוע את צמיחת residרע"מ א rhizogenes) ו קאן ₅₀ (לבחירת צמח) ולעטוף בעזרת פלסטר. לשמור על תרבויות תחת אורות הניאון בטמפרטורת החדר עם photoperiod 16 שעות ביממה.
10. לאחר ~ 1.5 - 2 שורשים שבועות לפחות 2 ס"מ אורך הם נכרת מן cotyledons באמצעות מלקחיים סטרילית אזמל והועברו ½ MS Kan ₅₀ טים ₃₀₀ מדיה. העבר 10 עד 15 שורשי צלחת אחת. סמן את המיקום של טיפים שורש בטוש, לעטוף בעזרת פלסטר, ולשמור בחדר התרבות.
11. אחרי שבוע אחד, שורשי טרנספורמציה נראים הגוברים על התקשורת סלקטיבית. בציר subsample של שורשי טרנספורמציה להפקת DNA בשיטת DNA שאיבת המועדפת. הערה: צלחות עם cotyledons יכולות להישמר במשך 2 - 3 יבולים שבועיים, ולאחר מכן הם השורשים לצמוח לתוך בלגן סבוך וקשים לבודד. יכול להישמר רקמות השורש ללא שנקטפו ללא הגבלת זמן. מגוון של מבחנים יכול להתבצע על דגימת DNA המבודדתים כדי לקבוע תדירות מוטציה בדנ"א וסוג. תוצאות מכמה מבחנים כאלה מתוארות להלן.

Results

בניית וקטור CRISPR עם הרכבת DNA בדרך כלל מייצרת עשרות עד מאה שיבוטים עצמאיים. הקרנת מושבה על ידי PCR בקלות מזהה שיבוטים נכונים ויכולה להבחין בין פלסמידים עם ובלי הוסיף (איור 2 א) וזה שימושי לפתרון בעיות. בדרך כלל, כל השיבוטים מכילים אינסרט לבין משתמש יכול לבחור לדלג על שלבי הקרנת מושבה לגמרי. מעכל אבחון (איור 2 ב) ו רצף סנגר משמשים לבקרת איכות. כאשר טעויות מתרחשות, הם בדרך כלל הם נצפו באזורי DNA החופפים, כלומר,...

Discussion

מכיוון שהרכבת DNA משמשת לשילוב מחדש של רצפי DNA חופפים, ניתן ליישם שיטת שיבוט זו על כל מבנה וקטור CRISPR. רוב תוכניות השיבוט של CRISPR משתמשות בסינתזה גנטית של ה-gRNA, אנזימי הגבלה מסוג IIS^17,18, או PCR¹⁹ עם הרחבה חופפת. לכל אחת מהטכניקות הללו יש יתרונות וחסרונות מובנים, אך הן בדרך כלל דורשות שלבי שיבוט מעשיים מרובים. היתרון העיקרי של שיטת השיבוט המוצגת כאן הוא שהתהליך כולו מתרחש בתגובה אחת של שעה וניתן לאגד אוליגוס gRNA כדי לייעל עוד יותר את הליך השיבוט. יתר על כן, מנגנון הרכבת ה-DNA אינו תלוי באנז...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NEBuilder® (תערובת הרכבת DNA HiFi)	ניו אינגלנד Biolabs	E5520
p201N:Cas9	Addgene	59175	הפלסמיד p201H:Cas9 (59176) תואם גם לחפיפות ולאנזימים המדווחים.
pUC gRNA Shuttle	Addgene	47024
SwaI	ניו אינגלנד Biolabs	R0604S
SpeI	ניו אינגלנד Biolabs	R0133S
Zymo נקי ורכז-5 טיהור עמודות	Zymo Research	D4003
NEB Buffer 2.1	New England Biolabs	B7202S
NEB CutSmart (מאגר 4)	ניו אינגלנד Biolabs	B7204S
NEB Buffer 3.1	ניו אינגלנד Biolabs	B7203S
EconoSpin מיני טור ספין (הכנת פלסמיד)	Epoch Life Sciences	1910-050/250
EcoRV-HF®	ניו אינגלנד ביולאבס	R3195S
StyI-HF®	ניו אינגלנד Biolabs	R3500S
מלחי MS + ויטמינים גמבורג	Phytotechnology Laboratories	M404
Phytagel™ (מסטיק גלאן)	Sigma Aldrich	P8169
GA-7 קופסאות	Sigma Aldrich	V8505
Micropore™ סרט כירורגי	3M	1535-0
Timentin® (טיקרצילין/חומצה קלבולנית)	שונות	0029-6571-26
פריימרים 5' → 3'SwaI_MtU6F
	GATATTAATCTCTTCGATGA AATTTATGCCTATCTTATAT GATCAATGAGG
MtU6R	AAGCCTACTGGTTCGCTTG AAG
פיגומיF	GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTT
SpeI_Scaffold R	GTCATGAATTGTAATACGACTC AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG
StUbi3P218R	ACATGCACCTAATTTCACTA GATGT
ISceIR	GTGATCGATTACCCTGTTAT CCCTAG	לא ניתן להשתמש בריצוף סנגר מכיוון שיש אתר קשירה שני על UNS1_Scaffold הפלסמיד
R	GAGAATGGATGCGAGTAATGAA AAAAAGCACCGACTCGGTG
UNS1_MtU6 F	CATTACTCGCATCCATTCTCATCAT GCCTATCTTATATGATCAATGAGG
p201R	CGCGCCGAATTCTAGTGATCG
רצפים מודגשים מציינים חפיפות של 20-nt עם p201N:Cas9 ליניארי.