קציר סלקטיבי של לויקוציטים Marginating-ריאתי

סיכום

לויקוציטים ריאתיים-שוליים מציגים מאפיינים ייחודיים ותפקודים אימונולוגיים מובהקים בהשוואה לאוכלוסיות לויקוציטים אחרות. כאן אנו מתארים קציר סלקטיבי של תת-אוכלוסייה זו של לויקוציטים ריאתיים, על ידי זלוף מאולץ של הריאות בחולדות ועכברים. נראה כי לויקוציטים ריאתיים שוליים הם קריטיים בקביעת הרגישות למחלות המועברות בדם ולמחלות הקשורות לריאות.

תקציר

לויקוציטים שוליים-ריאתיים (MP) הם לויקוציטים הנצמדים לאנדותל הפנימי של נימי הריאה. הוכח כי לויקוציטים MP מציגים הרכב ומאפיינים ייחודיים בהשוואה ללויקוציטים של תאים חיסוניים אחרים. עדויות מצביעות על ציטוטוקסיות גבוהה יותר של תאי הרג טבעיים, ופרופיל פרו-דלקתי מובהק של אוכלוסיית MP-לויקוציטים בהשוואה לאימונוציטים במחזור או טחול. השיטה המוצגת כאן מאפשרת קציר סלקטיבי של לויקוציטים MP על ידי זלוף מאולץ של הריאות בעכברים או בחולדות. בניגוד לשיטות אחרות המשמשות למיצוי לויקוציטים ריאתיים, כגון טחינת רקמות ופירוק ביולוגי, שיטה זו מניבה אך ורק לויקוציטים מנימי הריאה, שאינם מזוהמים בתאים פרנכימליים, אינטרסטיציאליים וברונכו-מכתשית. בנוסף, טכניקת הזלוף שומרת טוב יותר על השלמות והסביבה הפיזיולוגית של לויקוציטים MP, מבלי לגרום לתגובות פיזיולוגיות עקב עיבוד רקמות. אוכלוסיית לויקוציטים MP ייחודית זו ממוקמת אסטרטגית כדי לזהות ולהגיב לתאים חריגים במחזור הדם, שכן כל התאים הממאירים במחזור והתאים הנגועים נעצרים בזמן שהם עוברים דרך נימי הריאה, ומקיימים אינטראקציה פיזית עם תאי אנדותל ולויקוציטים תושבים. לפיכך, קציר סלקטיבי של לויקוציטים MP ומחקרם בתנאים שונים עשויים לקדם את הבנתנו את המשמעות הביולוגית והקלינית שלהם, במיוחד ביחס לשליטה בתאים חריגים במחזור הדם ומחלות הקשורות לריאות.

מבוא

לויקוציטים דבקים בנימי הריאות (כלומר, marginating-ריאתי (MP) לויקוציטים) ¹ הוצג להציג רכב לויקוציטים ברור פעילות ייחודית לעומת לויקוציטים מ תאים חיסוניים אחרים (למשל, מחזור, טחול, מח עצם) ^{2- 4.} לדוגמה, MP-לויקוציטים התערוכה גבוה הרג טבעיים (NK) cytotoxicity התאים מפני תאים סרטניים שונים, לעומת מחזורי הטחול תאי NK, כמו גם RNA שליח הבדיל (mRNA) רמות הפרשה מוגברת של ציטוקינים פרו ואנטי דלקתיים. הרכב של תאים הוא מובחן גם לויקוציטים במחזור כמו שיש MP-לויקוציטים יחס גבוה יותר של חסינות אדפטיבית / מולד לעומת לויקוציטים במחזור (50% לעומת 30%, בהתאמה). מטרת השיטה המוצגת כאן היא לאפשר קצירת סלקטיבית של MP-לויקוציטים, כדי ללמוד תא החיסון חשוב וייחודי זה (אוכלוסיית תאים), וכדי elucidate השפעת מניפולציות שונות (למשל, הפעלה חיסונית) על תאים ספציפיים אלה.

כדי להבין את המשמעות של אוכלוסייה ייחודית זו, חשוב לציין כי מערכת החיסון יכולה לשלוט במחזור תאים סרטניים, micrometastases, ומחלות שיורית באמצעות פונקציות vivo של חסינות בתיווך התא (CMI). יכולת זו באה לידי ביטוי למרות כישלון התקדים של מערכת החיסון על מנת לשלוט בגידול הראשוני, ונתמך על ידי מספיק ראיות vivo בחולי סרטן ומודלים של בעלי חי ^5. חשוב לציין, הממצאים הללו הם לעתים קרובות עולה בקנה אחד עם במבחנה במחקרים vivo לשעבר, אשר מדווחים כי רוב תאי הגידול עצמיים עמידים cytotoxicity ידי מחזורי לויקוציטים בדגימות דם מבני אדם ובעלי חיים (נמדד על ידי מבחני רעילות) ^6,7. אי התאמה זו ניתן לייחס לקיומה in vivo של אוכלוסיות לויקוציטים שונות, כגון שצויןאוכלוסייה לויקוציטים MP נזכרת, ו-האוכלוסייה שלה במיוחד של תאי NK מופעלים ^3. ואכן, תאים סרטניים syngeneic (MADB106), אשר נמצאו להיות עמיד במחזור לויקוציטים טחול, הוצגו להיות lysed ידי תאי MP-NK ^3,8. לפיכך, התאים MADB106 'NK עמיד' לכאורה כי גרורות לריאות של fischer344 (F344) חולדות נשלטים על ידי תאים MP-NK, אבל לא על ידי מחזורי או תאי NK הטחול, אשר בדרך כלל נלמדים נתון קלות הגישה שלהם.

מטוהרים פעילים MP-לויקוציטים אינם נגישים באמצעות שיטות קציר רמה לויקוציטים מהריאות, אשר מבוססות על שחיקה רקמת ריאה או ⁹ שפלה ביולוגית. הגישה שלנו כוללת שני יתרונות מרכזיים לעומת גישות עיבוד רקמות. ראשית, גישת זלוף סלקטיבי יבול MP-לויקוציטים, תוך הפרדה תאים אחרים שמקורן parenchymal ריאות, ביניים, ו compar broncho-מכתשיםtments. שנית, טכניקת זלוף טוב יותר שומרת על השלמות ובין ההוויה הפיזיולוגית של לויקוציטים MP, בניגוד שחיקה והעיבוד ביולוגי גישות הפוגעים בתאים, לשנות המורפולוגיה שלהם, ולגרום לייצור ושחרור של גורמים שונים כי לווסת את הפעילות חיסונית במיוחד לדכא NK cytotoxicity ^10.

הריאות הן איבר יעד מרכזי עבור גרורות סרטן ועבור מחלות זיהומיות שונות. כל התאים הממאירים במחזור התאים נגועים לעבור דרך נימי הריאות, בה הם צריכים לעוות ולתקשר עם תאי אנדותל נימים לויקוציטים תושב. בתנאים אלה, תאים במחזור יכולים להיות ממוקדים בקלות על ידי-לויקוציטים MP תושב. נראה, אם כן ביולוג יתרון יש לויקוציטים מופעלים בתא החיסון הזה, וזה חשוב ללמוד אוכלוסייה-MP הייחודית זאת בהגדרות ביולוגיות, ניסיוני, וקליניים שונים. ראוי לציין כי סאיההפעלה החיסונית stemic ידי-מכפילי ביולוגי-תגובה שונות (למשל, חומצה polyinosinic-polycytidylic (פולי לי: C) או מסוג C CPG oligodeoxynucleotides (CPG-C ODN)) הוכחו להפעיל MP-לויקוציטים יותר לויקוציטים במחזור ^{3, 8,11.}

פרוטוקול

הנהלים הקשורים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) באוניברסיטת תל-אביב.

1. עכברוש פרוטוקול

1. תכשירים
   1. מסדרים 2 פרפר 21 מחטים G. לחלופין, להכין 2 מחטים בוטות פיפיות פרפר 21 G על ידי הגשת הקצה החד של המחט.
   2. לעקר כלים כירורגיים: 2 זוגות מספריים, מלקחיים קהי פיפיות, hemostat, מלקחי שן-רקמות מעוקרות ידי חיטוי ב 121 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לפחות על כוח משיכת הגדרה (יבשה).
   3. הכן heparinized PBS (30 יחידות / מ"ל) על ידי הוספת 30 יחידות של הפרין לכל מ"ל של בופר פוספט פתרון (1x PBS). השתמש ב RT. 35 מיליליטר הוא הנפח המינימאלי הדרוש לכל בעלי חיים.
   4. להזרים heparinized PBS לתוך קווי משאבת peristaltic ואת מחטי הפרפר כדי למנוע בועות אוויר.
2. זלוף של הריאות והגבייה-לויקוציטים MP
   1. להרדימו ממנת יתר של isoflurane 8%. אשר המתת חסד על ידי הפסקת נשימה ניטור.
   2. לאחר הפסקת נשימה, לפתוח לאלתר את החללים הצפק ובחזה באמצעות מספרי סטרילית מלקחי שן-רקמה. לבצע חתך בבטן קו האמצע לאורך הבטן עד לתהליך xiphoid.
   3. הרם את החזה באמצעות המלקחיים, חיתוך כלוב צלעות בזהירות משני הצדדים, ללא ניקוב כל איבר פנימי או כלי דם גדולים. קלאמפ hemostat על עצם החזה, rostrally לקפל את בית החזה כדי לחשוף את מורכבות לב-ריאה.
   4. הכנס מחט פרפר לתוך החדר ימני של הלב, ובתוך כ דק לאסוף את הנפח המקסימאלי של דם לתוך מזרק (~ 6 מיליליטר מבעל חי 250 גרם).
   5. הצמד את הווריד הנבוב עם hemostat להימנע זלוף לאחור של הכבד (ראה דיון).
   6. החזק את מחט פרפר בתוך החדר הימני תוך החלפת מזרק המכיל את הדם עם צינור יצוא של pמשאבת eristaltic.
   7. הכנס מחט פרפר שני מחובר מזרק קציר 5 מ"ל לתוך החדר השמאלי, הימנעות חדירה של מחיצת האף interventricular.
   8. הפעל את המשאבה peristaltic במהירות של כ 5 מ"ל / דקה בעדינות לאסוף לתוך המזרק מיליליטר הראשון של perfusate כי הם מזוהמים עם דם. המשך עד שהצבע perfusate פונה מכהה אדום חיוור. (מחק את perfuste דם מזוהם).
   9. ללא הפסקת המשאבה peristaltic, במהירות להחליף את המזרק קציר 5 מ"ל עם מזרק קציר 20 מ"ל ולאסוף 20 מ"ל של perfusate ריאות העסקת מהירות גבוהה יותר של זלוף (עד 7 mL / min). לפקח באופן רציף את זרימת perfusate לתוך מזרק האיסוף, תוך הימנעות היווצרות ואקום.
   10. להפסיק את הזרימה של המשאבה peristaltic.
3. הפקה לויקוציטים
   1. צנטריפוגה perfusate במשך 10 דקות ב g 400 ×.
   2. לשאוב את הנוזל.
   3. הוסף 10 מ"ל PBS או בינוני, צנטריפוגות ב 400 XG במשך 10 דקות, לשאוב את הנוזל. חזור על פעולה זו פעמיים. שימוש PBS או בינוני תלוי בשימוש הסוגר של המדגם.
   4. הוסף 20 מ"ל PBS או בינוני, צנטריפוגות ב 400 XG במשך 10 דקות, לשאוב את הנוזל.
   5. מחדש את התאים לריכוז הרצוי, מבוסס על השימוש במדגם (FACS, PCR, וכו ').

2. עכבר פרוטוקול

1. תכשירים
   1. מסדרים 2 פרפר 25 מחטים G. לחלופין, להכין 2 מחטים בוטות פיפיות פרפר 25 G על ידי הגשת הקצה החד של המחט.
   2. לעקר כלים כירורגיים: 2 זוגות מספריים, מלקחיים קהי פיפיות, hemostat, מלקחי שן-רקמות מעוקרות ידי חיטוי ב 121 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לפחות על כוח משיכת הגדרה (יבשה).
   3. הכן heparinized PBS (30 יחידות / מ"ל) על ידי הוספת 30 יחידות של הפרין לכל מ"ל של תמיסת 1x PBS. השתמש ב RT. 25 מיליליטר הוא הנפח המינימאלי הדרוש לכל בעלי חיים.
   4. streאני heparinized PBS לתוך קווי משאבת peristaltic ואת מחטי הפרפר כדי למנוע בועות אוויר.
2. זלוף של הריאות והגבייה-לויקוציטים MP
   1. להרדימו ממנת יתר של isoflurane 8%. אשר המתת חסד על ידי הפסקת נשימה ניטור.
   2. לאחר הפסקת נשימה, לפתוח לאלתר את החללים הצפק ובחזה באמצעות מספרי סטרילית מלקחי שן-רקמה. לבצע חתך בבטן קו האמצע לאורך הבטן עד לתהליך xiphoid.
   3. הרם את החזה באמצעות המלקחיים, חיתוך כלוב צלעות בזהירות משני הצדדים, ללא ניקוב כל איבר פנימי או כלי דם גדולים. קלאמפ hemostat על עצם החזה, rostrally לקפל את בית החזה כדי לחשוף את מורכבות לב-ריאה.
   4. הצמד את הווריד הנבוב עם hemostat להימנע זלוף לאחור של הכבד (ראה דיון).
   5. הכנס מחט פרפר המחובר לצינור היצוא של משאבת peristaltic לתוך ven התקיןtricle של הלב, וכן מחט פרפר שני מחובר מזרק קציר 2 מ"ל לתוך החדר השמאלי של הלב, avoidingpenetration של מחיצת האף interventricular.
   6. הפעל את המשאבה למהירות של כ 2 מ"ל / דקה לאסוף את מיליליטר הראשון של perfusate דם מזוהמים לתוך המזרק קציר עד perfusate פונה מכהה אדום חיוור (מחק את perfuste דם מזוהם).
   7. ללא הפסקת המשאבה peristaltic, במהירות להחליף את המזרק קציר 2 מ"ל עם מזרק קציר 10 מ"ל ולאסוף 10 מ"ל של perfusate ריאות העסקת מהירות גבוהה יותר של זלוף (עד 4 מ"ל / דק '). לפקח באופן רציף את זרימת perfusate לתוך מזרק האיסוף, תוך הימנעות היווצרות ואקום.
   8. להפסיק את הזרימה של המשאבה peristaltic.
3. הפקה לויקוציטים
   1. צנטריפוגה perfusate במשך 10 דקות ב g 400 ×.
   2. לשאוב את הנוזל.
   3. הוסף 10 מ"ל PBS או בינוני, צנטריפוגות ב 400XG במשך 10 דקות, לשאוב את הנוזל. חזור על פעולה זו שלוש פעמים. שימוש PBS או בינוני תלוי בשימוש הסוגר של המדגם.
   4. הוסף 10 מ"ל PBS או בינוני, צנטריפוגות ב 400 XG במשך 10 דקות, לשאוב את הנוזל.
   5. מחדש את התאים לריכוז הרצוי, מבוסס על השימוש במדגם (FACS, PCR, וכו ').

תוצאות

תערוכת MP-תא קומפוזיצית משנה לויקוציטים שונה לעומת מחזורים לויקוציטים. באמצעות ניתוח תזרים cytometry, תת-אוכלוסיות לויקוציטים זוהו לכמת ולאפיין את הרכב של שני מחזורי לויקוציטים MP. גרנולוציטים ו לימפוציטים זוהו מבוסס על מחליקי קדימה והצד. בתוך לימפוציטים, NKRP-1 תאים ^בהירים זוהו תאי NK, CD3 ⁺ כתאי T, RM1 ⁺ כמו מונוציטים, ו CD4 ⁺ / CD8 ⁺ / CD25 ⁺ שימשו לזיהוי תת-אוכלוסיות של תאי T. im...

דיון

השיטה המוצגת כאן מאפשרת קצירת סלקטיבית ולומדים של האוכלוסייה הייחודית של לויקוציטים MP. לעומת מחזורי או לויקוציטים טחול, אוכלוסיית MP מאופיינת רכב מובהק של תת-אוכלוסיות לויקוציטים, רמות הפעלה גבוהות, שחרור גבוה של ציטוקינים שונים, ורמות גבוהות יותר של mRNA תומך ציטוקינים אנטי דלקתי ^2,3. באופן ספציפי, אנחנו הראינו כי תאי MP-NK הם יותר ציטוטוקסיות מאשר תאי NK דם נגד תאי יעד שונים ^3,4, ולהביע רמות גבוהות יותר של-γ אינטרפרון. בסך הכל, התוצאות שלנו מראות כי לויקוצ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
			פריסטלטית אוטוקלוד
מחט פרפר	OMG		26 גרם
מחט פרפר	OMG		21 גרם * 3/4 אינץ'
תמיסת		מזרק תמונה	1 מ"ל
תמיסת		מזרק	2.5 מ"ל
תמיסת		מזרק	פיק 5 מ"ל
מזרק	תמיסת		10 מ"ל
מזרק	תמיסת		25 מ"ל
מלקחיים
מספריים
המוסטט
מלקחיים
הפרין נתרן חזיר רירית (ללא חומרים משמרים)	סיגמא אולדריץ'

משאבה תמונה פיק פיק קהים שולייםרקמות