מאמר שיטה

מבדק פשוט עבור הערכת גורמי הגדילה של אנדותל כלי דם

9.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53867

⸱

15 במרץ 2016

 ,  ,  ,  , 
1Tumour Angiogenesis Program, Peter MacCallum Cancer Centre

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים המבדק פשוט מבוססי תאים לזיהוי, כימות לפקח על פעילות בני משפחת פקטור הגדילה של אנדותל כלי הדם של הליגנדים. את assay משתמש קולטנים chimeric לידי ביטוי קו תא גורם תלוי לתת הערכה וכמותיות או הכמות של קולטן מחייב cross-linking ידי ליגנד.

תקציר

הניתוח של טירוזין קינאז הקולטן הליגנדים האינטראקציה שלהם מעורב ביולוגיה וסקולרית הרבה פעמים הוא מאתגר בשל הביטוי המכונן של משפחות של רצפטורים קשורים, מגוון רחב של הליגנדים המתייחסים ואת הקושי להתמודד עם תרבויות עיקריות של תאי אנדותל מיוחדים. כאן אנו מתארים מבדק לצורך זיהוי של הליגנדים לגורם צמיחה של אנדותל כלי דם קולטן 2 (VEGFR-2), מתמר מפתח של אותות המקדמים אנגיוגנזה lymphangiogenesis. CDNA קידוד היתוך של האזור (ליגנד המחייבת) תאיים של VEGFR-2 עם הטרנסממברני ואזורי cytoplasmic של הקולטן אריתרופואטין (EpoR) מתבטא הקו הסלולרי גורם תלויה Ba / F3. שורת תאים זה גדל בנוכחות interleukin-3 (IL-3) ונסיגה של תוצאות גורם זה מוות של תאים בתוך 24 שעות. הביטוי של היתוך קולטן VEGFR-2 / EpoR מספק מנגנון חלופי לקדם הישרדות בפוטנציהlly תרבות תאי Ba / F3 transfected ביציבות בנוכחות ליגנד מסוגל חייב cross-linking החלק התאי של חלבון ההיתוך (כלומר, אחד שיכול קשר צולב באזור תאיים VEGFR-2). Assay יכול להתבצע בשתי דרכים: גישה כמותית למחצה שבו כמויות קטנות של ליגנד ותאי להתיר מכך מהיר ב -24 שעות, ועל גישת כמותית המעורבת סמנים פונדקאיים של מספר תאי קיימא. Assay הוא יחסית קל לבצע, הוא היענות נלהבת הליגנדים VEGFR-2 ידוע והוא יכול להכיל מעכבי תאיים של VEGFR-2 איתות כגון נוגדנים חד שבטיים לקולטן או ליגנדים, ומלכודות ליגנד מסיסים.

מבוא

הגורם (vascular endothelial growth VEGF) המשפחה של גורמי גדילה חלבון המופרש ו קולטנים בתא השטח מאותו מקור שלהם היא קבוצה חשובה ומגוונת של הליגנדים מסיסים קולטני-מוטבע הממברנה, בהתאמה כי הפונקציה transducing אותות על פני קרום התא. הן מתפקדות בעיקר בתאי האנדותל אלא גם בתאים ממוצא אפיתל ואלה של 1,2 מערכת החיסון. מסלולי איתות עוסקת ידי קולטני VEGF המופעל ליגנד (VEGFRs) הן קריטיות פתולוגיות הגדולות, כגון ניוון וסרטן מקולרי הקשור לגיל, ותרופות מיקוד מהם נמצאים בשימוש קליני תכופים (למשל, bevacizumab נוגדן חד-שבטי שמכוונת-A VEGF) 3,4.

אחת המורכבויות של משפחת VEGF הוא המגוון של הליגנדים מסיסים הנוכחי בטבע (-A VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, חלבונים VEGF המקודדים על ידי ORF המשפחה וירוס parapox ו VEGF ארס נחשים, בתוספת אחרים מעכבisoforms של VEGF-A) 2.

ליגנדים אלה אינטראקציה עם שלושה מבני משפחת טירוזין קינאז קולטן, כלומר VEGFR-1, VEGFR-2 ו VEGFR-3. קולטנים אלה באים לידי ביטוי variably על תאים מסוגים שונים, אך לעתים קרובות הם הביעו במשותף על פני השטח של תאי האנדותל המרפדים את כלי הדם הלימפה מכל הגדלים 5. VEGFR-2 יכול לחייב את יונקים הליגנדים VEGF-A 6, VEGF-C 7 ו VEGF-D 8,9 וכן ORF וירוס 10 VEGF ו- נחש ארס 11 VEGF. VEGFR-2 משחק תפקיד מרכזי בהנעת אנגיוגנזה (צמיחת כלי דם חדשים מכלי קיימים) ב ההתפתחות העוברית, ריפוי פצעים, סרטן ומחלות עיניים. בהקשרים אלה, הליגנדים כגון-A VEGF, לאגד -C ו -D ולהפעיל את הקולטן על תאי האנדותל של כלי דם דם 12-15. על תאי אנדותל הלימפה, VEGFR-2 ממלא תפקיד lymphangiogenesis, היווצרות של כלי הלימפה חדש 16. VEGFR-2 יכול גם לקדם התרחבות והרחבת העורקים הגדולים lymphatics בתאים בריאים המחלה 17. הבנה מלאה של VEGFR-2: אינטראקציות ליגנד לכן חשובה לפיתוח מעכבים לשימוש בטיפול במחלות תלויה אנגיוגנזה 18. בעוד שרוב isoforms של VEGF-A נקשר VEGFR-2, מחשוף פרוטאוליטים של VEGF-C ו- VEGF-D נדרש לשחרר שבר המורכב של תחום VEGF-ההומולוגיה שמספק זיקה גבוהה מחייבת VEGFR-2 19,20.

פתחנו מבדק לפקח ליגנדים של VEGFR-2 אשר נועד לעקוף את הצורך בתאי האנדותל עיקריים, אשר קשים מבחינה טכנית למעבר, יקרים לרכישת תרבות (הדורשים בינוני מיוחד) 21 ולהביע VEGFRs מרובה הקשורים שיתוף קולטני 22. Heterodimerization של VEGFR-2 עם קולטנים VEGF אחרים או-קולטנים שיתוף יכול לגרום מורכבות רצויות כאשר מכוון כדי הרבעהקולטן ליגנד אינטראקציות בינארי y, הערכת פעילות מיוחסת קולטן מסוים, או בהערכת ההשפעה של חומרים כימיים מעכבות. 23. המבדק שומר ניידות של הקולטן הרלוונטי בקרום התא ומאפשר הערכה של יכולתו של ליגנד לקשור קשר צולב באזור תאיים VEGFR-2.

המבדק מסתמך על יצירת קולטן chimeric בו נמצא האזור תאיים של קולטן VEGF (במקרה זה VEGFR-2) הוא קיבע את הטרנסממברני ואזורים תאיים של קולטן אריתרופואטין (EpoR), חבר של המשפחה הקולטן ציטוקינים 8,24. חלבון היתוך זו בא לידי ביטוי אז הקו הסלולרי פרו-B תלוי הגורם Ba / F3, שעליו גירוי עם ליגנד מסוגל מחייב צולבות המקשרים את התחום התאי של הקולטן גורם הפעלה של האזור מפעיל cytoplasmic, מסוגל של transducing אות הישרדות באמצעות קינאזות יאנוס (JAKs) לקדם התאהישרדות ו / או התפשטות. לעומת זאת, הביטוי של VEGFR-2 באורך מלא בסוג התא אותו, וגירוי עם ליגנד, אינו מקדם הישרדות התא ושגשוגם, המציין כי effectors איתות הפרוקסימלי של מסלול VEGFR-2 אינם זמינים סוג תא זה.

השתמשנו assay במגוון בהקשרים לחקור מחייב של הליגנדים VEGFR-2 הרומן 10,19,20,24-29. בשילוב עם assay VEGFR-3-EpoR-Ba / F3, השווינו את הפעילות היחסית של VEGF-C ו- גורמי גדילה VEGF-D לקשירה cross-linking VEGFR-2 ו VEGFR-3 30. את assay נעשה שימוש כדי לאפיין את פעילות המעכבת של נוגדנים מנטרלים חד-שבטיים כדי VEGFR-2 או VEGF-D, מלכודת VEGFR-2 מסיסים peptidomimetics מיקוד המשפחה VEGF 31. את assay שימש גם להראות את היכולת של VEGFs מן זני נגיף ORF שונים לקשור קשר צולב VEGFR-2 לפני הבדיקה בתאי האנדותל העיקרי 10,26. Assay הוא שימושי במיוחד עבור לסינון המהיר של מוטציות של VEGFs אשר ניתן להעריך במהירות לפעילות לפני שהם מוצגים בפני מבחני תא האנדותל המייגעים יותר 25 או כאשר פרוטוקולי הערכה לצמיחת טיהור גורמי 27.

את assay אנו מתארים הוא קל לביצוע, והגרסה וכמותיות מאפשרת לקביעות מהירה שלפעמים נדרשות כאשר הניטור בייצור או הטיהור של גורמי גדילה, נוגדנים או תחומי קולטן מסיסים לניסויים אחרים. קלות השימוש של assay עושות את זה אידיאלי המשלים עוד ועוד מחקרים מלאים הופיעו עם תאי אנדותל עיקריים נגזרו דם או כלי לימפה מרקמות ספציפיות או מערכות איברים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מקור IL-3 ו הכנת אחד מעמיתי המחקר-3D ממוזג בינוני

הערה: תא לוקמיה granulocytic העכבר קו אחד מעמיתי המחקר-3D הוא תרבותי כדי ליצור בינוני מותנה המכיל IL-3.

  1. תרבות, אחד מעמיתי המחקר-3D ב בינוני של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM), 10% בסרום שור העובר (FBS), 1% תוספת גלוטמין לכל החיים, 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​גנטמיצין. לחסן 5 × 10 6 תאים בשלב יומן של צמיחה לתוך 50 מ"ל של מדיום תרבות טרי בבקבוק תרבות T175 ס"מ 3 רקמות לגדול במשך כ -7 ימים או עד שהתאים עברו שלב יומן שלהם הצמיחה בכ 24 - 48 שעות (למנוע מוות של תאים מוגזם בתרבות). התקשורת אוויר הוא מסוגל להיות מאוחסן במשך שנים מרובות ב -20 ° C, ולכן אצוות של 200 - 500 מ"ל יכול להיות מיוצר בבת אחת.
  2. למזוג נוזל ותאי צלוחיות ספין ב 1000 x ז במשך 15 דקות כדי להסיר תאים ופסולת הסלולר. הסר את% 90 העליון של supernatant. סינון דרך יחידה מסננת 0.22 מיקרומטר.
  3. Aliquot בינוני מותנה, אחד מעמיתי המחקר-3D (CM) לתוך 1 מ"ל, 50 מ"ל ו -200 מ"ל כרכים לאחסון ב -20 ° C או -70 ° C. קטן aliquots שימושי להכנת assay, כרכי ביניים להכנת בינוני תרבות למעבר של שורות תאים תלויי גורם, ואת כמויות גדולות יותר עבור אחסון לטווח ארוך. IL-3 הם יציבים יחסית ב 4 ° C כך בינוני מופשר יכול להיות מאוחסן במשך כמה שבועות אם נעשה שימוש בתנאים סטריליים.
  4. לחלופין, להשתמש בעכבר רקומביננטי IL-3 ברמות של 50 ng / ml מדולל לתוך מדיום התרבות, לאחר מסונן דרך יחידת 0.22 מיקרומטר הסינון.

תרבות 2. והערכה של VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 ובקרה Ba / F3 שורות תאים

  1. שליטה תרבות תאים Ba / F3 ב DMEM, 10% FBS, 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​גנטמיצין או פניצילין / תוספת סטרפטומיצין, 1% התייצב L- גלוטמין ו -10%, אחד מעמיתי המחקר-3D-CM. תאי מעבר בשעת 1:15 דילולים על כל שלושה ימים מתאיםגדל בשלב יומן.
  2. VEGFR2-EpoR-Ba / F3 תרבות התאים DMEM, 10% FBS, 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​gentamycin, 1% התייצב L- גלוטמין ו -10%, אחד מעמיתי המחקר-3D-CM ו 1 מ"ג / מ"ל ​​G418. תאי המעבר בשעה 1:15 דילולים מתאי גדל בשלב יומן. ראה 24 לפרטים נוספים על בניית הביטוי של הקולטן chimeric.
  3. שליטה קציר Ba / F3 או VEGFR2-EpoR-Ba / תאים F3 מתרבויות יומן פאזיים באמצע. בעדינות פיפטה כדי להסיר תאים שאינם חסידים אלה מן החלק התחתון של הבקבוק. לשטוף שלוש פעמים מלוחות עכבר טוני שנאגר פוספט, 7.3 pH (PBS), (10 מיליליטר, צנטריפוגות ב g 750 x למשך 5 דקות כדי להתאושש תא גלול) להסיר המכיל בינוני IL-3.
  4. לשטוף את התאים פעם עם DMEM ותוספים, ללא אחד מעמיתי המחקר-3D-CM או IL-3 רקומביננטי, ולאחר מכן resuspend במדיום זה בריכוז של 7.4 × 10 4 תאים / מ"ל (כלומר, 1,000 תאים לכל 13.5 μl; 10,000 תאים לכל 135 μl כפי שנקבע על ידי ספירת באמצעות hemocytometer) עבורלהשתמש בגרסאות וכמותיות או כמותי של assay בהתאמה.
  5. להעריך תאים כדאיים על ידי ההרחקה הכחולה Trypan (זהירות). מערבבים כחול Trypan PBS (0.4%) 1: 1 עם אוכלוסיית תאים ולספור מינימום של 100 תאים על hemocytometer. תאים תופסים צבע נחשבים מתים או גוססים. הכדאיות של יותר מ 98% נדרש לבצע את assay.

3. Assay וכמותיות

  1. הוספת תאי שטף (1,000 תאים) כלולים 13.5 μl של מדיום IL-3 המחסר אל הבארות של צלחת microwell 72-גם ב RT. תשמרי על עצמך כדי לערבב את ההשעיה התא במהלך aliquotting כדי להבטיח שיקוע התא על ידי כוח הכבידה לא ריכוז התא הטיה. השתמש פיפטה אוטומטית P20 היטב מכויל, וטיפים autoclaved.
  2. להוסיף דוגמאות בדיקה ובקרות על בארות ב 10 נפח% (1.5 μl, מה שהופך נפח סופי של 15 μl המכיל 1,000 תאים לכל טוב) בעזרת פיפטה P20 מכויל או, עדיף, פיפטה P2. קח caמחדש על מנת להבטיח כי דגימות עולות בקנה אחד עם תנאי התרבות עבור תאי Ba / F3 מבחינת pH, מלח אחר עלול להיות ציטוטוקסיות / חומרי cytostatic. במידת האפשר, להשתמש במדיום תואם או חיץ (למשל, DMEM או PBS, בהתאמה) או לדלל במדיום או חיץ כזה. טחינה דקה עם אותו הקצה תבטיח ערבוב.
  3. לקבלת דוגמיות שליטה, כולל (i) בינוני לבד המכיל שום IL-3; (Ii), אחד מעמיתי המחקר-3BD-CM הוסיף עד בינוני לבד בווליום הסופי 10%; ו / או (iii) VEGF-A מדולל ל 100 ng / ml במדיום לבד, המכיל לא IL-3.
  4. מלאו כל בארות בשימוש של צלחת microwell עם מים סטריליים, PBS או בינוני ומניחים בצלחת בתוך מיכל humidified (עם מים ספוג ממחטת נייר) חילוף הגזים המאפשר. דגירה תאים בתוך מכולות באווירה humidified של 10% CO 2. assay זה ניתן להגדיר בנוחות 3 שעות על ידי אדם אחד אם דגימות בדיקת רכיבי תקשורת זמינות.
  5. להעריך צלחות בדרך כלל לאחר 16 שעות שלהדגירה שבה אפליה הזמן בין דגימות חיוביות ושליליות ניכר. ראה איור 3 עבור דוגמאות כיצד תאים להופיע בתרבות. לנתח צלחות באמצעות מיקרוסקופ-בניגוד שלב הפוך תקן 40 - 100 × הגדלה.
    הערה: ולס המכיל גורמי גדילה תומכים כגון IL-3 או-A VEGF יכיל תאים המופיעים עגול שקופה. וולס ללא גורמי גדילה תומכים או עם מדיום לבד צמצמיו מספרים של תאים עגולים, כמו גם תאים מתים או גוססים ופסולת הסלולר (למשל, איור 3 ג). הערכת assay ב הדגירה 24-48 שעות שלאחר הוא האופטימלי עבור רגישות.

4. מבדק כמוני

  1. הוספת תאים שטף (10,000 תאים 135 μl) ב IL-3-לקוי בינוני עד בארות צלחת microtiter תקן 96-גם ב RT. תשמור על עצמך כדי לערבב את השעית התא במהלך aliquotting כדי להבטיח שיקוע תא על ידי כוח הכבידה אינו משפיע ceריכוז ll.
  2. להוסיף דוגמאות בדיקה ובקרות על בארות ב 10 נפח% (15 μl) בעזרת פיפטה מכויל (P20). תשמור על מנת להבטיח כי דגימות עולות בקנה אחד עם תנאי התרבות עבור תאי Ba / F3 מבחינת pH, מלח או חומרים ציטוטוקסיים אפשרי אחרים / cytostatic. במידת האפשר, להשתמש במדיום תואם או חיץ (למשל., DMEM או PBS) או לדלל במדיום או חיץ כזה. סנן לעקר בנפחים קטנים באמצעות יחידת מסנן צינור צנטריפוגות אצטט תאית 0.22 מיקרומטר הנקבוביות.
  3. דגירה את התערובת של תאים, גורמי גדילה ו / או מעכב סוכנים באווירה humidified של 10% CO 2 למשך 48 שעות. בצע את assay בתוך מיכל humidified כי יש נייר טישו ספוג מים ומאפשר-חילוף גזים. בסיום תקופת הדגירה, להעריך את assay באמצעות אחת השיטות החלופיות המפורטות להלן שהם סמנים פונדקאיים של המספר הסלולרי קיימא הבאר.
  4. # 1 אלטרנטיבי: 3 H-thymidine התאגדות
    הערה: כימות זה מיועד בפורמט צלחת 96-היטב.
    1. לאחר דגירה של צלחות assay למשך 48 שעות ב 37 ° C (150 נפח μl לכל היטב), להוסיף 3 H-thymidine בהיקף של 50 μl של המדיום assay (בינוני תרבות Ba / F3 ללא IL-3 / אחד מעמיתי המחקר-3D CM) לכל טוב בריכוז של מ"ל 20 μCi /, מתן מינון סופי של 1 μCi לכל טוב.
    2. דגירת צלחות במשך שעה 4 נוספת על 37 מעלות צלזיוס לפני תאי הקצירה באמצעות מקצרת תא. חלץ דוגמאות בודדות על ידי צבת בפילטרים נוצץ ולכמת עם מונה נצנץ נוזלי.
  5. # 2 אלטרנטיבי: פליטת אור איתור של הסלולרית ATP
    הערה: גישה זו משתמשת מגיבה ניטור ATP אשר בשילוב עם lysate תא יכול ליצור אות פליטת אור המשקפת את תאי הקיימא באוכלוסייה.
    1. Lyse תאים לחלץ ATP ולהשתמש מגיב ניטור ATP כדי ליצוראות זורח פי הוראות היצרן. קרא הארה באמצעות luminometer תואם פורמט צלחת 96-היטב.
  6. # 3 אלטרנטיבי: הפחתת אנזימתי של צבע אינדיקטור על ידי תאי קיימא
    הערה: מבחנים מבוססים Resazurin להראות קורלציה טובה כדאי תא.
    1. שלב תאים בתרבית עם הצבע המבוסס resazurin ולכמת מבחנים באמצעות קורא צלחת פלואורסצנטי פי הוראות היצרן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בחלק זה, אנו מציגים את התוצאות של ניסוי המדגימות את התכונות החיוניות של מבדק VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 (ראה איור 1 עבור עקרונות של assay). מחקרים שפורסמו אחרים מדגימים יישומים רחבים של assay עבור הליגנדים VEGFR-2 חלופיים, מולקולות VEGF מוטציה ונוגדנים חד-שבטיים מעכבים 8,10,19,24-30.

הנתונים המוצגים כאן מייצגים assay שבו המבדק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

Assay המתואר כאן מסתמך על שימוש בתאים של כדאיויות גבוהות, אשר תלויים בגורמי צמיחה. תאים ולכן צריכים להיות מתורבת בקפידה כדי לוודא שהם גורמים תלויים, ולשמר ביטוי של הקולטן chimeric. הבטיח כי המדיום הוא עשה טרי ולא מאוחסן לתקופת זמן ממושכת מדי וכי אחד מעמיתי המחקר-3D CM הוא מאוד פעיל חשוב. תאים צריכים לשטוף ביסודיות מ- IL-3 בינוני המכיל לתוך מדיום assay כדי לוודא ששום שיורית IL-3 ומזהמים את assay כאשר חושפים את תאי הליגנדים ההצלה. כפי הליגנדים יכול לבוא במספר צורות שונות, טיפול צריך...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

סטיבן א Stacker ומארק מ achen הם בעלי המניות היממה טכנולוגיות בע"מ, חברה לפיתוח תרופות על ידי מיקוד המשפחה VEGF של גורמי גדילה.

תודות

SAS ו-MGA נתמכים על ידי מענקי פרויקטים, מענק תוכנית ומלגות מחקר מהמועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי של אוסטרליה (NHMRC), ועל ידי כספים מתוכנית התמיכה בתשתיות תפעוליות המסופקות על ידי ממשלת ויקטוריה, אוסטרליה. ל-MMH יש תמיכה ממענק קרן פיטר מקאלום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תמיסת Trypan BlueSigma-AldrichT81540.4% ב-PBS משמשת 1:1 עם תרחיפי תאים למדידת תאים ברי קיימא. סכנה - עלול לגרום לסרטן
G418 סולפט (גנטיצין)Invivogenant-gn-5סוכן לבחירת תאים אוקריוטיים שעברו טרנספטציה. סכנה - עלול לגרום לתסמיני אלרגיה או אסטמה או קשיי נשימה.
3H-ThymidinePerkinElmerNET-027נוקלאוזיד רדיואקטיבי זה משולב ב-DNA כרומוזומלי במהלך המיטוזה. ערכת קרינת סכנה
Vialight Plus LonzaLT07-221זיהוי ביולומינסנט של ATP סלולרי לכימות כדאיות, באמצעות מגיב ניטור ATP
Prestoblue Cell ReagentInvitrogenA13261אינדיקטור מבוסס רסזורין של כדאיות התא. הופך לצבע אדום בסביבת ההפחתה של התא
Nunc Minitray עם משטח דלתא Nunclon (72 באר)Thermo Scientific136528צלחת מיקרוטיטר קטנה
96 באר צלחת תרבית רקמותבז, קורנינג בע"מ.
DMEM (1X)Gibco11965-92
GlutaMAX (100X)Gibco35050-061
סרום בקר עובריGibco  10099-141
קציר תאיםTomtec Life SciencesTomtec Harvester, 96 מאך 3M קציר תאים
מונה נצנוץ נוזליLKB Wallac1205LKB Wallac 1205 Betaplate נצנוץ
דלפק UniFilter-96 GF/BPerkin Elmer6005177לבן 96 בארות Barex Microplate עם מסנן GF/B של 1 ומיקרו; m נקבוביות
GentamicinGibco, Life Technologies15750-060
פניצילין/סטרפטומיציןGibco, Life Technologies15140-122
0.22 um נקבוביות תאית אצטט יחידת מסנן צינור צנטריפוגהCostar, Corning Inc.8160הם בעלי 0.22 ומיקרו; m נקבוביות CA מכילה ממברנה יחידת סינון בתוך 500 ומיקרו; l צינור מיקרוצנטריפוגה מפוליפרופילן בקיבולת.
קורא פלואורסצנטיBioTekBioTek Synergy 4 קורא מיקרו-פלטות היברידי 
353072מסנני צינור צנטריפוגה

מקורות

  1. Ferrara, N., Gerber, H. P., LeCouter, J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med. 9, 669-676 (2003).
  2. Achen, M. G., Stacker, S. A. Vascular endothelial growth factor-D:signalling mechanisms, biology and clinical relevance. Growth Factors. 5, 283-296 (2012).
  3. Ferrara, N., Mass, R. D., Campa, C., Kim, R. Targeting VEGF-A to treat cancer and age-related macular degeneration. Annu Rev Med. 58, 491-504 (2007).
  4. Ferrara, N., Hillan, K. J., Gerber, H. P., Novotny, W. Discovery and development of bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer. Nat Rev Drug Discov. 3, 391-400 (2004).
  5. Korpelainen, E. I., Alitalo, K. Signaling angiogenesis and lymphangiogenesis. Curr Opin Cell Biol. 10, 159-164 (1998).
  6. Senger, D. R., et al. Tumour cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascities fluid. Science. 219, 983-985 (1983).
  7. Joukov, V., et al. A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt-4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases. EMBO J. 15, 290-298 (1996).
  8. Achen, M. G., et al. Vascular endothelial growth factor D (VEGF-D) is a ligand for the tyrosine kinases VEGF receptor 2 (Flk1) and VEGF receptor 3 (Flt4). Proc Natl Acad Sci USA. 95, 548-553 (1998).
  9. Leppanen, V. M., et al. Structural determinants of vascular endothelial growth factor-D receptor binding and specificity. Blood. 117, 1507-1515 (2011).
  10. Wise, L. M., et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF)-like protein from orf virus NZ2 binds to VEGFR2 and neuropilin-1. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 3071-3076 (1999).
  11. Yamazaki, Y., Takani, K., Atoda, H., Morita, T. Snake venom vascular endothelial growth factors (VEGFs) exhibit potent activity through their specific recognition of KDR (VEGF receptor 2). J Biol Chem. 278, 51985-51988 (2003).
  12. Stacker, S. A., Achen, M. G., Jussila, L., Baldwin, M. E., Alitalo, K. Lymphangiogenesis and cancer metastasis. Nat Rev Cancer. 2, 573-583 (2002).
  13. Stacker, S. A., et al. VEGF-D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics. Nat Med. 7, 186-191 (2001).
  14. Skobe, M., et al. Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis. Nat Med. 7, 192-198 (2001).
  15. Mandriota, S. J., et al. Vascular endothelial growth factor-C-mediated lymphangiogenesis promotes tumour metastasis. EMBO J. 20, 672-682 (2001).
  16. Stacker, S. A., et al. Lymphangiogenesis and lymphatic vessel remodelling in cancer. Nat Rev Cancer. 14, 159-172 (2014).
  17. Karnezis, T., et al. VEGF-D promotes tumor metastasis by regulating prostaglandins produced by the collecting lymphatic endothelium. Cancer Cell. 21, 181-195 (2012).
  18. Folkman, J. Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 6, 273-286 (2007).
  19. Stacker, S. A., et al. Biosynthesis of vascular endothelial growth factor-D involves proteolytic processing which generates non-covalent homodimers. J Biol Chem. 274, 32127-32136 (1999).
  20. McColl, B. K., et al. Plasmin activates the lymphangiogenic growth factors VEGF-C and VEGF-D. J Exp Med. 198, 863-868 (2003).
  21. Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52, 2745-2756 (1973).
  22. Shibuya, M., Claesson-Welsh, L. Signal transduction by VEGF receptors in regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis. Exp Cell Res. 312, 549-560 (2006).
  23. Pacifici, R. E., Thomason, A. R. Hybrid tyrosine kinase/cytokine receptors transmit mitogenic signals in response to ligand. J Biol Chem. 269, 1571-1574 (1994).
  24. Stacker, S. A., et al. A mutant form of vascular endothelial growth factor (VEGF) that lacks VEGF receptor-2 activation retains the ability to induce vascular permeability. J Biol Chem. 274, 34884-34892 (1999).
  25. Davydova, N., Roufail, S., Streltsov, V. A., Stacker, S. A., Achen, M. G. The VD1 neutralizing antibody to vascular endothelial growth factor-D: binding epitope and relationship to receptor binding. J Mol Biol. 407, 581-593 (2011).
  26. Wise, L. M., et al. Viral vascular endothelial growth factors vary extensively in amino acid sequence, receptor-binding specificities, and the ability to induce vascular permeability yet are uniformly active mitogens. J Biol Chem. 278, 38004-38014 (2003).
  27. Davydova, N., et al. Preparation of human vascular endothelial growth factor-D for structural and preclinical therapeutic studies. Protein Expr. Purif. 82, 232-239 (2012).
  28. Baldwin, M. E., et al. Multiple forms of mouse vascular endothelial growth factor-D are generated by RNA splicing and proteolysis. J. Biol. Chem. 276, 44307-44314 (2001).
  29. Baldwin, M. E., et al. The specificity of receptor binding by vascular endothelial growth factor-D is different in mouse and man. J. Biol. Chem. 276, 19166-19171 (2001).
  30. Makinen, T., et al. Isolated lymphatic endothelial cells transduce growth, survival and migratory signals via the VEGF-C/D receptor VEGFR-3. EMBOJ. 20, 4762-4773 (2001).
  31. Achen, M. G., et al. Monoclonal antibodies to vascular endothelial growth factor-D block its interactions with both VEGF receptor-2 and VEGF receptor-3. Eur J Biochem. 267, 2505-2515 (2000).
  32. Bamford, S., et al. The COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) database and website. Br J Cancer. 91, 355-358 (2004).
  33. Pleasance, E. D., et al. A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome. Nature. 463, 191-196 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

VEGFR 2Ba F3IL 3Trypan Blue

מאמרים קשורים