הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

תקנה אפיגנטיים של לב בידול בתאי גזע עובריים ורקמות

8.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53874

⸱

3 ביוני 2016

 ,  , 
1INSERM UMR-910, Faculté de Médecine, Université Aix-Marseille, 2Institute of Physiological Chemistry, University Medical Center, Johannes Gutenberg University

במאמר זה

סיכום

תקנת כוונון עדינה של שעתוק גנים בבסיס החלטת גורל תא עוברי. בזאת, אנו מתארים מבחני immunoprecipitation הכרומטין לשמש כדי לחקור תקנה אפיגנטיים של שני בידול הלב של תאי גזע ופיתוח הלב של עוברי עכברים.

תקציר

שעתוק גנים ספציפית הוא תהליך ביולוגי מפתח העומד בבסיס החלטת גורל תא במהלך התפתחות עוברית. התהליך הביולוגי מתווך על ידי גורמי תעתוק אשר נקלטים אזורי רגולטוריים הגנומי כוללים משפר ומקדם של גני מכונן לב. DNA הוא כרוך סביב ההיסטונים כי הם נתונים שינויים כימיים. שינויים של היסטונים נוסף להוביל שעתוק גנים מודחק, מופעל או שקול, ובכך להביא לרמה אחרת של רגולצית כוונון העדינה של שעתוק גנים. תאי גזע עובריים (תאי גזע עובריים) שיסכמו בתוך גופי embryoid (כלומר, אגרגטים תא) או בתרבות 2D השלבים המוקדמים של פיתוח לב. הם מספקים חומר העיקרון מספיק immunoprecipitation הכרומטין (שבב), טכנולוגיה בשימוש נרחב לזהות אזורים רגולטוריים הגן. יתר על כן, בתאי גזע עובריים אנושיים מייצגים מודל תאים אנושי של cardiogenesis. בשלבים מאוחרים יותר של ההתפתחות, רקמות עובריות העכבר לאפשרחוקר נופים אפיגנטיים ספציפיים הדרושים לצורך קביעת זהות תא. בזאת, אנו מתארים פרוטוקולים של שבב, שבב רציף ואחריו PCR או שבב רצף באמצעות תאי גזע עובריים, גופי embryoid ואזורים עובריים ספציפיים לב. פרוטוקולים אלה מאפשרים לחקור את הרגולציה אפיגנטיים של שעתוק גני לב.

מבוא

הלב הוא האיבר הראשון להיווצר להיות פונקציונלי בעובר. הלב בנוי שושלות תאים רבות שעולות משדות הלב העובריים הראשונים ושני 1. מן הבלסטוציסט לאחר הפרית שלב א 'עד בצורת הלב, תאים עובריים יש אפוא לקבל החלטות תא גורל רבות. שעתוק גנים מוסדר באופן הזמן- ומרחב תלוי הוא תהליך ביולוגי מפתח העומד בבסיס החלטת גורל תא במהלך התפתחות עוברית. תהליך כזה מתווך על ידי גורמי שעתוק ספציפיים המחייבים אזורים רגולטוריים בתוך הגנום כולל משפר ומקדם של גני מכונן לב. DNA הוא כרוך סביב ההיסטונים כי הם נתונים שינויים כגון acetylation, מתילציה, ubiquitinylation, ו / או זרחון. שינוי היסטון מוביל שעתוק גנים מודחק, מופעל או שקול תלוי בו שאריות של היסטון ליזין היא שונות 2.

jove_content "> assay immunoprecipitation הכרומטין (שבב) הוגדר שנים 3 ו משתמשת בטכנולוגיה הנמצא בשימוש הנרחב ביותר כדי לזהות מטרות של היסטונים שונה משני או גורמי שעתוק 4. בעקבות immunoprecipitation של היסטונים או גורמי שעתוק, DNA כבול יכול להיות או מוגבר על ידי תגובת שרשרת פולימרז (PCR) או רצף. שבב שהתגברה טכנית יותר מבחני פיגור ג'ל מאתגר 5. אולם שבב אינה מעידה ישירה מחייב גורם שעתוק ל- DNA, יתרון של assay ג'ל פיגור. מצד שני, שבב בשילוב כדי רצפי DNA פתח פרספקטיבת הגנום כולו חדשה על ויסות גנים.

בתאי גזע עובריים (תאי גזע עובריים) שיסכמו בתוך גופי embryoid (כלומר., אגרגטים תא) או בתרבות 2D השלבים המוקדמים של פיתוח לב 6 ולספק חומר עיקרון מספיק שבב. יתר על כן, בתאי גזע עובריים אנושיים מייצגים מודל תאים אנושי של CArdiogenesis למרות הפוטנציאל קרדיוגני שלהם תלויה בחתימה אפיגנטיים שלהם 7. בשלבים מאוחרים יותר של ההתפתחות, רקמות עובריות העכבר לאפשר לחקירת נופים אפיגנטיים ספציפיים הדרושים לצורך קביעת זהות התא. עם זאת, הגנום הוא עבד באופן סוג ספציפי הזמן- ותא 8. תקנה אפיגנטיים של שעתוק הגנים יש להיחקר בתוך אזורים נקודתיים. בזאת, אנו מתארים פרוטוקולים של שבב, שבב רציף ואחריו PCR או רצף באמצעות תאי גזע עובריים, גופי embryoid ואזורים עובריים ספציפיים לב. פרוטוקולים אלה מאפשרים לחקור את הרגולציה אפיגנטיים של שעתוק גני לב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. חלבון דנ"א Cross-linking

  1. תקן ב 15 מיליליטר צינורות שנקטפו-ES תאים (2 x 10 6 תאים עבור שבב רגיל, 2 x 10 5 תאים עבור Microchip), גופי embryoid (EBS) המופקים מתאי גזע עובריים רקמות לב עובריות גזורים מן עוברי עכברי E9.5 (חדרים ועליות תעלה, בדרכי חדר יצוא) באמצעות פורמלדהיד 1% PBS עבור תאים או במאגר PB2 permeabilization עבור רקמות עובריות. מניחים את הצינורות על שייקר מסלולית במהירות של 60 סל"ד בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות בדיוק.
  2. עצור את התגובה cross-linking ידי הוספת גליצין לריכוז סופי של 125 מ"מ ו דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולית במהירות של 60 סל"ד.

פיצול 2. תא תמוגה הכרומטין

  1. שטפו פעמיים תאים צולבים resuspended ב 10 מ"ל PBS 1x או רקמות עובריות resuspended ב 1 מ"ל PB2. צנטריפוגה XG ב 1000 למשך 5 דקות ב 4 ° C.. מחק את supernatants.
  2. הוסף מעכבי פרוטאז למאגר PB1 או PB2 (2 מיקרוגרם / מ"ל leupeptin, 1 מיקרוגרם / מ"ל Aprotinin, ו 0.1 מ"מ PMSF) (טבלה 1). Resuspend התא גלולה או רקמה עוברית משלב 2.1 ב 1 מ"ל של הצפת PB1 או PB2 בהתאמה. Pipet למעלה ולמטה ו resuspend תאים או רקמות. השתמש מזרק 1 מ"ל עם מחט 21 מד כדי homogenize תאים או רקמות. דגירה ב 4 ° C. (על גלגל) במשך 10 דקות.
  3. ספין למטה ב 3000 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C וזורקים supernatant.
  4. Resuspend גלולה ב 300 μl של מאגרי SB בהתאמה (לוח 1) השלימו עם מעכבי פרוטאז בתוך שפופרת נקיה (מוסמך RNase-, DNase-, ו pyrogen-חינם) כדי למנוע כל שפלת DNA. דגירה של 15 עד 30 דקות על קרח.
  5. Sonicate דגימות ב 4 ° C. כדי לכסח את הכרומטין באמצעות sonicator פי התוכניות המפורטות בטבלה 2 עבור כל חומר. התאם משך sonication בהתאם היישום הבא ( כלומר, PCR או רצף). גודל DNA טעון צריך להיות סביב 500 נ"ב עבור PCR ו -300 נ"ב על רצף.
  6. צנטריפוגה sonicated תא lysate למשך 10 דקות ב 6000 XG ב 4 ° C, להעביר את supernatant (הכרומטין) בצינור 1.5 מ"ל נקי וזורקים את הכדור.
  7. לדלל את הכרומטין בתמיסה (B חיץ supernatant) במשך 10 פעמים עם מים להעריך את הצפיפות האופטית באמצעות 1.5 μl ב ספקטרופוטומטר-ננו. השג את הריכוז של החלבונים מיקרוגרם / μl באמצעות הנוסחה הבאה: 1.55 x OD 280 - 0.76 x OD 260.
בַּלָם שימוש הרכב חומרים
א permeabilization PB1: 5 מ"מ צינורות pH 8; 85 מ 'M KCl; 0.5% NP40 את כל
PB2: 15 מ"מ HEPES pH 7.6, 15 mM NaCl, 4 מ"מ MgCl2 60 מ"מ KCl, 0.5% Triton X-100 רקמה עוברית
B תמוגה / Sonication SB1: 1% SDS; 10 mM EDTA; 50 mM Tris-HCl pH 8 יציאה
SB2: 50 מ"מ HEPES-KOH pH7.9; 140 מ"מ; 1 מ"מ EDTA; 0.1% deoxycholate; 0.1% SDS EBS
SB3: 15 מ"מ HEPES pH7.6, 15 מ"מ NaCl; 60 מ"מ KCl, 1 מ"מ EDTA, 0.5 מ"מ EGTA; 1% Triton-X100, 0 1% SDS, 0.5% laurylsarcosine רקמה עוברית
C חיץ שבב 150 מ"מ NaCl; 50 mM Tris-HCl pH 7.5; 5 mM EDTA; 0.5% NP40; 1% Triton-X100. את כל
D דנ"א / חלבון Elution D1: 1% SDS; 100מ"מ NaHCO 3
D2: 50 המ"מימ טריס pH 7.6 / 5 EDTA מ"מ, 15 המ"מ DTT, 2% SDS
E הכנת חרוזי DNA מחייבים E: 20% PEG 8000; 2.5 M NaCl; 10 mM Tris-HCl pH 8; 1 מ"מ EDTA

מאגרי שבב בטבלת 1..

חוֹמֶר תוכנית sonication
תאי גזע עובריים 15 מחזורים של 30 שניות על 30 שניות OFF
גופי Embryoid 30 מחזורים של 30 שניות על 30 שניות OFF
רקמות עובריות 21 מחזורים של 30 שניות על 30 שניות OFF

תוכניות טבלה 2. Sonication.

3. Immunoprecipitation ורוחץ

  1. לשטוף חרוזים 3 פעמים חלבון A-מצומדות עם חיץ C. קח 100 μl של חרוזים בצינור 1.5 מ"ל נקי ולהוסיף 1 מ"ל של חיץ C (טבלה 1). הצינור הוא הועבר לאחר מכן על גבי מגנט; להמתין דקות 1 ו לשאוב supernatant. חזור פעמים על שלב הכביסה.
  2. דגירת נוגדן שהועלה נגד היסטונים שונים או גורם שעתוק (ריכוזים המפורטים בטבלה 3) עם 20 μl של חלבון שרחץ חרוזי מצומדות 1 מיליליטר של החיץ C בתוספת מעכבי פרוטאז צינור 1.5 מיליליטר נקי. הגדר את הדגימות על כתף ב 40 סל"ד במשך שעה לפחות 2 ב 4 ° C.
  3. נוגדן-חרוזים לשטוף קומפלקסי 3 פעמים עם 1 מ"ל של חיץ C (מניפולציה המתוארים 3.1).
  4. כן 2 צינורות, אחד המכיל 150 מיקרוגרם של מתחמי הכרומטין נוגדן-חרוזי הצינור האחר המכיל 150 מיקרוגרם של הכרומטין 20 μl של חרוזי שטף; הוסף 1 מ"ל של חיץ C בתוספת מעכבי פרוטאז על צינור אחדדגירת הדגימות על גלגל מסתובב ב 40 סל"ד הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: ריכוז הכרומטין חייב להיות לפחות 300 מיקרוגרם כדי immunoprecipitate גורמות שעתוק או עבור שבב רציף.
תֶקֶן ריכוז (ng / μl) נפח (μl) ריכוז ה- DNA סה"כ (נ"ג)
א 10.0 1 10.0
B 5.00 1 5.00
C 2.50 1 2.50
D 1.25 1 1.25
E 0.625 1 0.625
F .3125 1 0.3125
G 0.156 1 0.156
H 0.0 1 0.0

ריכוזים לתקני לוח 3..

4. DNA Elution, היפוך חוצה הקישור proteinase K עיכול

  1. הגדר את הדגימות המתלות המגנטית. לשחזר את supernatant המכיל הכרומטין נוגדן מאוגד.
    הערה: דוגמאות אפשר להקפיא במהירות בחנקן נוזלי באותו צעד ומאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס. הכרומטין יכול לשמש מבחני immunoprecipitation אחרים עם נוגדן אחר. לשטוף כל מדגם 3 פעמים עם 1 מ"ל של חיץ C (מניפולציה שתואר קודם).
  2. Elute החלבון כבול-נוגדנים על ידי הוספת 150 μl של חיץ D1 או D2 אם שבב רציפים חייב להיעשות (טבלה 1) לחומרי שבב שטף דגירת הדגימות במשך 20 דקות ב 50 מעלות צלזיוס בתוך גוש חימום.
  3. הסר צינורות מ בלוק חימום ולשים דגימות מתלה מגנטי, לשחזר את supernatant בצינור 1.5 מ"ל נקי (מוסמך RNase-, DNase-, ו pyrogen-חינם) וזורקים את החרוזים.
  4. השתמש supernatant עבור שבב רציפי הוספת 1 עד 3 מיקרוגרם של הנוגדן השני ב 2 כרכים של החיץ C או הפוך crosslink ידי הוספת 5 M NaCl כדי לקבל ריכוז סופי של 200 מ"מ.
  5. כן מדגם קלט של הכרומטין בתוך שפופרת 1.5 מיליליטר נקי (מוסמך RNase-, DNase-, ו pyrogen-חינם) לוקח את אותה כמות של הכרומטין כמו זה של מדגם IP (150 מיקרוגרם) בנפח סופי של 150 μl של מים (מים חופשיים RNase DNase). להוסיף 5M NaCl לריכוז סופי של 200 מ"מ. דגירה דגימות לילה בשעה C 65 °.
  6. למחרת, להסיר דגימות מהגוש חימום, להוסיף 250 מ"מ EDTA כדי לקבל ריכוז סופי של 12.5 מ"מ ו proteinase K כדי לקבל ריכוז סופי של 250 מיקרוגרם / מ"ל ​​בחומר שבב ולעכל על 55 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות ב בלוק חימום.

ss = "jove_title"> 5. בידוד DNA באמצעות חרוזים ה- DNA מחייבת

  1. הכנת חרוזים
    1. התחל להביא את החרוזים בטמפרטורת החדר למשך לפחות 30 דקות, מערבולת החרוזים ביסודיות מאוד. חרוזים להתיישב, כך לעבוד מהר כאשר pipetting. העברת 1 מ"ל של חרוזים בצינור 1.5 מ"ל נקי (מוסמך RNase-, DNase-, ו pyrogen-חינם).
    2. גדר על מגנט, לחכות 2 - 3 דקות עבור הפתרון להבהיר, supernatant שנזרק. הסר מגנט, להוסיף 1 מ"ל של 0.5 מ 'EDTA ומערבבים ידי vortexing קצר.
    3. חזור על שלב 5.1.2 פעמיים, וזורקים supernatant בסוף.
    4. הסר מגנט, להוסיף 1 מ"ל של חיץ E ולאט לאט resuspend את החרוזים. מעבירים את תערובת כולו (החרוזים E חיץ) לתוך 50 מ"ל של חיץ א מקום על שייקר ולתת לו ומערבלים במהירות איטית בטמפרטורת החדר למשך שעה 1.
    5. מבחן ה- DNA מחייבת חרוזים בעקבות פרוטוקול טיהור המתוארים להלן באמצעות 3 תנאי הניסוי: 50 μl של חרוזים / 50 μl של ה- DNA (1 נפח / נפח 1), 100 μl של חרוזים/ 50 μl של ה- DNA (2 כרכים / 1 נפח) 125 μl של חרוזים / 50 μl של ה- DNA (2.5 כרכים / 1 נפח). בואו להעביר DNA מטוהרים על ג'ל agarose 1.5% כדי לבדוק את גודל שברי (איור 1 א).
  2. טיהור DNA
    1. להוסיף 425 μl (2.5 כרכים) של DNA מחייב חרוזים מגנטיים לכל דגימת DNA (כ -170 μl). Resuspend לאט על ידי pipetting למעלה ולמטה (כ -10 פעמים) ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
    2. מניחים על מגנט במשך 5 דקות, ואז לשאוב supernatant וזורקים (על מגנט).
    3. להוסיף 600 μl של אתנול טרי 80% אל הצינור על מגנט, לחכות 1 דקות, לשאוב supernatant וזורק ולאחר מכן חזור על השלב הקודם שוב.
    4. תן סיבוב מהיר, במשך 5 שניות (microfuge), במקום צינור על מגנט ולהסיר את הטיפות האחרונות של אתנול. תן יבש דקות 1 ב RT
    5. Elute את ה- DNA על ידי הוספת 20 μl של מים חינם DNase RNase. סר מגנט מערבולת המדגם.
    6. דגירה של 3 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן למקם דגימות על מגנט. DNA eluted לשאוב לתוך צינור חדש (מוסמך RNase-, DNase-, ו pyrogen-חינם).
    7. הפעל את ה- DNA מן השבר קלט על ג'ל agarose 1.5% כדי לבדוק את הגודל של קטעי DNA (איור 1 ב).

6. כימות DNA באמצעות מכשיר גילוי הקרינה

  1. סדרתי לדלל בדנ"א מיקרוגרם מים 1 (1 סולם kb) לתת סך של 7 דילולים בתוספת נקודה לא-דנ"א (דילולים שנאסף בטבלה 3).
  2. הכן פתרון של צבע PCR הירוק אני, מספיק עבור כל הדגימות (דנ"א דילולים תקן מטוהרים AH): לדלל 10,000x לצבוע ירוק במאגר 1x TE.
  3. הוסף 1 μl של כל דגימות דנ"א (DNA דילולים תקן מטוהרים AH) עד 10 תמהיל צבע ירוק 1x μl ב cuvettes נימים להיקרא בתוך fluorimeter באורך גל 488 ננומטר. עבור assay לא-DNA, השתמש 1 μl של חיץ 1x TE.
  4. לִבנוֹתעקומת כיול באמצעות תוכנות גרפיקה לקבוע את הריכוזים היחסיים לטווח בדגימת DNA הנמצאת ng / μl. ה- DNA הוא אז מוכן PCR או לעשות ספריות רצף.

7. PCR

  1. מבחר פריימרים
    1. פריימרים תכנון עניין לחקור את האזורים הגנומי של עניין. פריימרים עיצוב להגביר אזורים משפר גנים באמצעות דפדפן הגנום UCSC. משפרים הם חזו נוספים באמצעות H3K4me1 או p300 שבב seq 9 נתונים זמינים בערכת נתוני GEO.
  2. PCR
    1. הפעלה PCR תגובות עבור 45 מחזורים (8 שניות 95 מעלות צלזיוס, 8 שניות 60 ° C, 8 שניות 72 ° C) להשתמש thermocycler PCR בזמן אמת 25 μl תערובת צבע ירוק, 2 ng DNA, ו -0.5 μl תערובת פריימר (20 מיקרומטר פתרון המניות) 10.
  3. ניתוח של העשרה
    1. חישוב העשרה מוחלטת והניחה שלכל היותר 1% של הנוקלאוזום היו immunoprecipitated 11.
    2. consideהאות R גנומי כמו מועשר אם 10 דגימות ng IP להראות העשרה יותר בהשוואה ל 0.1 ng של DNA קלט.
    3. אין מהיר תוצאות כמו גידול של פי העשרה על אזור שאינו מועשר לאחר נורמליזציה לכניסת וכוונון עם מדגם השליטה הלא ספציפית.
    4. קחו למשל את ה- DNA קלט על דילול 100 (גורם לדילול או DF).
    5. לנרמל את קלט באמצעות המשוואה הבאה 2 -ΔCt x 100%, כאשר -ΔCt = Ct [IP] - Ct [קלט x DF].
    6. התאם שליטה באמצעות המשוואה הבאה (ΔCt [IP] -ΔCt [NS]) שבו NS הוא מדגם שאינם ספציפיים (לא נוגדן ה- IP, או IgG IP).
    7. חשב את ההעשרה פי המדגם כפי 2 -ΔΔCt. קובץ כולל את כל השלבים של חישובים עם נוסחאות בה רק מדגם PCR ניתן להזין יקל על ניתוח של התוצאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1 א הממחיש ראשון בהכנת חרוזי בקרת איכות-DNA מחייבת שימוש ב- DNA בגדלים שונים (סולם 1 kb). 0ne, 2 ו 2.5 כרכים (1 עד 3) חרוזים התווספו בכרך אחד של המדגם כדי לטהר שברי DNA בגודל מולקולרי גבוהים ונמוכים.

איורים 1 B, C, D הם דוגמאות אופייניות של ג'לים דנ"א DNA sonicated כולו מופק בתאי עכבר ES, גופי embryoi...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אפיגנטיקה הפך תחום חשוב של מחקר בביולוגיה התפתחותית. איך תכנית גנטית מופעלת בתאים עובריים כדי לאפשר לתאי רכישת זהות ספציפית בתוך שושלת עוברית כבר במשך זמן רב שאלת מפתח עבור ביולוגים התפתחותיים.

שבב נעשה שימוש נרחב בתוך בשנים האחרונות ומשולב כדי רצפי DNA בעקבות שיפור ברזולוציה של רצף. זה הפך טכניקה רבה עצמה כדי לחקור בגנום רחב באופן תלוי בנוף אפיגנטיים של תאים או רקמות עובריות מבוגרות ספציפיות. מאגרי assay השבב ות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים מודים לסוכנויות המימון, לתוכנית הקהילה האירופית של IMI StemBANCC, לקרן לדוק (SHAPEHEART) ולסוכנות הלאומית למחקר (Genopath)

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פורמלדהיד SigmaF8775קיבוע תאים 
גליציןסיגמאG8898עצירת קישורים צולבת
אפרוטיניןפלוקה10820מעכב פרוטאזות
לופפטין המיסולפטסיגמאL2882מעכב פרוטאזות
PMSFSigmaP7626מעכב פרוטאזות
חלבון A חרוזים מגנטיים Life technologies10001DImmunoprecipitation
חרוזים מגנטיים SPRIThermo Scientific15002-01טיהור DNA
Proteinase KLife technologies25530-015עיכול חלבונים 
תקן DNA BR Q32850טכנולוגיות חיים 
בדיקות מולקולריותירוקות של SyberS-11484כימות DNA
מאגר TE InvitrogenP7589כימות DNA
PBX 1xטכנולוגיות חיים14190-094שטיפת
DNase מים ללא RNaseטכנולוגיות חיים10977-035דילול
צינור אקסיגןAxygenMCT-175-CChIP purifiction
<חזק>נוגדן  <חזק>חברה<חזק>התייחסות<חזק>ChIP ריכוז
H3K27acAbcamab47293 ומיקרו; g עבור ESC ו-EBs, 1 ומיקרו; g לרקמות
H3K4me1DiagenodeC15410194 (pAb-194-050)3 ומיקרו; g עבור ESC ו-EBs, 1 ומיקרו; g לרקמות
H3K36me3DiagenodeC15410058 (pAb-058-050)3 ומיקרו; g עבור ESC ו-EBs, 1 ומיקרו; g לרקמות
H3K9me2DiagenodeC15410060 (pAb-060-050)3 ומיקרו; g עבור ESC ו-EBs, 1 ומיקרו; g לרקמות
H3K4me3DiagenodeC15410030 (pAb-030-050)3 ומיקרו; g עבור ESC ו-EBs, 1 ומיקרו; g לרקמות
H3K27me3DiagenodeC15410069 (pAb-069-050)3 ומיקרו; g עבור ESC ו-EBs, 1 ומיקרו; g לרקמות
טווח כיול

מקורות

  1. Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).
  2. Chen, T., Dent, S. Y. Chromatin modifiers and remodellers: regulators of cellular differentiation. Nat Rev Genet. 15, 93-106 (2014).
  3. Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).
  4. Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).
  5. Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. The gel retardation assay. Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).
  6. Van Vliet, P., Wu, S. M., Zaffran, S., Puceat, M. Early cardiac development: a view from stem cells to embryos. Cardiovasc Res. 96, 352-362 (2012).
  7. Leschik, J., Caron, L., Yang, H., Cowan, C., Puceat, M. A view of bivalent epigenetic marks in two human embryonic stem cell lines reveals a different cardiogenic potential. Stem Cells Dev. 24, 384-392 (2015).
  8. Bonn, S., Zinzen, R. P., Girardot, C., Gustafson, E. H., Perez-Gonzalez, A., Delhomme, N., Ghavi-Helm, Y., Wilczynski, B., Riddell, A., Furlong, E. E. Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development. Nat Genet. 44, 148-156 (2012).
  9. Kim, T. K., Shiekhattar, R. Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters. Cell. 162, 948-959 (2015).
  10. Abboud, N., Moore-Morris, T., Hiriart, E., Yang, H., Bezerra, H., Gualazzi, M. G., Stefanovic, S., Guenantin, A. C., Evans, S. M., Puceat, M. A cohesin-OCT4 complex mediates Sox enhancers to prime an early embryonic lineage. Nat Commun. 6, 6749(2015).
  11. Dahl, J. A., Collas, P. Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells. Stem Cells. 25, 1037-1046 (2007).
  12. Bernstein, B. E., Mikkelsen, T. S., Xie, X., Kamal, M., Huebert, D. J., Cuff, J., Fry, B., Meissner, A., Wernig, M., Plath, K., et al. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell. 125, 315-326 (2006).
  13. Wamstad, J. A., Alexander, J. M., Truty, R. M., Shrikumar, A., Li, F., Eilertson, K. E., Ding, H., Wylie, J. N., Pico, A. R., Capra, J. A., et al. Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage. Cell. 151, 206-220 (2012).
  14. Stergachis, A. B., Neph, S., Reynolds, A., Humbert, R., Miller, B., Paige, S. L., Vernot, B., Cheng, J. B., Thurman, R. E., Sandstrom, R., et al. Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes. Cell. 154, 888-903 (2013).
  15. Brind'Amour, J., Liu, S., Hudson, M., Chen, C., Karimi, M. M., Lorincz, M. C. An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nat Commun. 6, 6033(2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ChIPDNAProtein A
תקנה אפיגנטיים של לב בידול בתאי גזע עובריים ורקמות
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.