הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד ואפיון של תאים בודדים מעוברים דג הזברה

14.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53877

⸱

12 במרץ 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2McAllister Heart Institute, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד תאים בודדים מעוברי דג הזברה, העשרה לתאים מעניינים, לכידת תאי דג זברה במערכות מולטיפלקס תאים בודדים מבוססות מיקרופלואידית, והערכת ביטוי גנים מתאים בודדים.

תקציר

דג הזברה (Danio rerio) הוא אורגניזם מודל רב עוצמה לחקר התפתחות בעלי חוליות. למרות שהיבטים רבים של התפתחות עוברית של דג הזברה תוארו ברמה המורפולוגית, מעט ידוע על הבסיס המולקולרי של שינויים תאיים המתרחשים עם התפתחות האורגניזם. עם ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות מיקרופלואידיקה וריבוב, ניתן כעת לאפיין ביטוי גנים בתאים בודדים. זה מאפשר לחקור הטרוגניות בין תאים בודדים של אוכלוסיות תאים ספציפיות כדי לזהות ולסווג תת-סוגים של תאים, לאפיין מצבי ביניים המתרחשים במהלך התמיינות תאים ולחקור תגובות תאיות דיפרנציאליות לגירויים. מחקר זה מתאר פרוטוקול לבידוד תאים בודדים ברי קיימא מעוברי דג זברה לבדיקות ריבוי תפוקה גבוהה. ניתן ליישם שיטה זו במהירות על כל סוג תאים עובריים של דג הזברה עם סמנים פלואורסצנטיים. ניתן להשתמש בהרחבה של שיטה זו גם בשילוב עם טכנולוגיות ריצוף תפוקה גבוהה כדי לאפיין באופן מלא את הטרנסקריפטום של תאים בודדים. כהוכחה לעיקרון, השפע היחסי של סמני התמיינות לבביים הוערך בתאים בודדים מבודדים שמקורם באבות לבביים חיוביים nkx2.5. על ידי הערכת ביטוי גנים ברמת התא הבודד ובנקודת זמן אחת, הנתונים תומכים במודל שבו אבות לבביים מתקיימים יחד עם צאצאים מתמיינים . השיטה וזרימת העבודה המתוארות כאן ישימות באופן נרחב לקהילת המחקר של דגי הזברה, ודורשות רק קו דגים טרנסגני מסומן וגישה לטכנולוגיות מיקרופלואידיקה.

מבוא

רוב המחקרים הנוכחיים של ביולוגיה מולקולרית של תא מבוססים על ממוצעי אוכלוסייה. עם זאת, אירועים ביולוגיים חשובים עשויים להיות רעולי פנים על ידי ניתוחים מבוסס אוכלוסיה המסורתיים הללו, מאחר ואנשים קטין יכול לשחק תפקידים מרכזיים בתהליכים ביולוגיים ותוצאות המחלה. הבנת ביטוי גני אוכלוסיות הטרוגניות ברמת התא הבודדה יכולה (ויש לו) להוביל לתובנות ביולוגיים וקליניים רלוונטיים 1,2. דאגה ללימודי התפתחות עובריות, בתוך אוכלוסייה גדולה יותר של תאים, ובתאים הם בדרך כלל מיוצגים כראוי, מה שהופכים אותו מאתגר כדי לזהות שינויים עדינים ביטוי גנים שבסופו של דבר ליזום החלטות גורל תא 3. באופן דומה, סוג תא בודד יכול להיות ביטוי פרופילים שונים בתגובה במיקרו-סביבה של 4. לדוגמה, תאי אנדותל תושב אותו איבר או באיברים שונים (למשל., אבי העורקים או כליות) להפגין ההטרוגניות רבה, למרות שיתוף morp משותףתכונות hological ופונקציונליות 5. בנוסף, תאים סרטניים לאכלוס אותה הגידול יכולים להיות גם משתנים פרופילים או מוטציות מולקולריים ברמת התא הבודדה 6.

במערכות מודל, transcriptomics יחידים תאים זיהה בהצלחת אוכלוסיות תאים חדשות, המאופיינת מצבי ביניים המתרחשים במהלך התמיינות תאים, וגילה תגובות הסלולר הפרש לגירויי 7,8,9. תובנות אלה היו רעולי פנים במחקרים מבוסס אוכלוסיה קונבנציונאלי. עוברי דג זברה הם מקור מתחת מנוצל מאוד של גזע, אב, ובידול תאים לחקר שאלות ההטרוגניות תא בודד ורגולציה מולקולרית של זהויות הסלולר במהלך פיתוח. פיתוח וקלות מניפולציה גנטית סטריאוטיפית שלהם מאוד, לשעבר vivo לגרום להם מערכת מודל מצוינת עבור גישה זו 10,11. באופן ספציפי, מגבלה משמעותית לפרשנות של תא בודד genנתוני דואר ביטוי הוא כי זיהוי אמין של מדינות תא ביניים רומן במהלך פיתוח דורש תזמון מאוד זהיר של אוסף רקמות 9. הדבר נחוץ כדי להבטיח כי ההטרוגניות בין תאים שנתפסו מייצג ההטרוגניות בתוך רקמה בנקודת זמן אחת ולא הטרוגניות בביטוי גנים שהציג התמיינות תאים תלוי גיל. בהשוואה לעכברים, פיתוח עובר דג זברה יכול להיות מסונכרן בדיוק על פני מספר גדול של עובר 12. בנוסף, עם גדלי מצמד גדולים, עוברי דג זברה יכולים לשמש מקור שופע של תאי גזע מולידם.

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבודד תאים מעוברים דג הזברה ללכוד תאים בודדים באמצעות מעגל מיקרופלואידיקה משולבת זמינים מסחרית (IFC) מערכת שבבים autoprep עבור ניתוח ביטוי גנים qRT-PCR. פרוטוקול זה יכול להיות להעברה מיד על כל מבחני ריבוב תפוקה גבוהה כולל כלרצף transcriptome המאפשר ניתוח מקיף יותר של ההטרוגניות הסלולר 13. הוא מציע גם מספר יתרונות מבחני ביטוי גנים מסורתיים. פרוטוקול בידוד תא הבודד מניב כדאיות גבוהה לאחר FACS, אשר מקטינה את חלקם של תאים נפגעים כלולי יישומים במורד זרם. באמצעות IFC, תאים שצולמו עשויים להיות שנצפו ישירות להעריך שיעורים ללכוד ולהעריך תא בריאות מורפולוגית. בנוסף, פרוטוקול זה הוא החלים רחב לקהילת מחקר דג הזברה, המחייב רק קו דג מהונדס שכותרתו וגישה לטכנולוגיות ללכוד תאי microfluidic.

כהוכחה עקרונית, תאים בודדים נגזרו אבות לב הבודדים שנתפסו על שבב IFC, ולאחר מכן את השפע היחסי של סמני בידול לב נמדד על ידי qRT-PCR. ניתוח התבטאות גנים ברמת התא הבודדה מוכיח כי אבות לב לדור בכפיפה אחת עם differe שלהםצאצאי ntiating. התובנה שנצבר פרופיל תא בודד של אבות לב עשוי לשפוך אור על ההטרוגניות דפוסי ביטוי גנים בין ובתאים לב במהלך ההתפתחות חוליות, אשר עשויים להיות רעולי פנים בניתוחים מבוסס אוכלוסיה מסורתית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה מחייב שימוש דג זברה לחיות, מבוגר לייצר עוברים. עוברים נקצרים לאיסוף רקמות. זה חיוני כדי לקבל את אישור ועדה בוחן אתיקה המתאימה לנהל את הניסוי הזה.

1. השג עובר מבוימים

  1. היום לפני הניסוי, להכין בריא, דג זברה מבוגרת לרבייה. מניחים זכר אחד ונקבה אחת משני צדי המתרס של מחיצה ברורה בתוך אקווריום רבייה.
  2. חזור על 1.1 לקערות רבייה רבות ככל הכרחיות ליצירת עובר מספיק עבור היישום במורד הזרם. השג עובר מן הדגים הוא סוג בר דגים מהונדסים המבטאים חלבוני ניאון בסוג התא של עניין.
    הערה: מספר העוברים הדרושים יישומים במורד הזרם שלבים 2-8 תלוי השפע היחסי של תאים בעלי עניין בנקודת הזמן של עניין. אמנם זה עשוי להשתנות לפי סוג התא, 200 עוברים לייצר 2,000-5,000 תאים ממוינים כאשר גאמות של עניין מייצגים <1.0% של תאים הכולל ב 24 hpf (שעות לאחר ההפריה).
  3. למחרת בבוקר, להחליף את המים במכל גידול החיות ידי העברת דגים לאקווריום רבייה טרי להסיר את המחיצה. הטה את הטנק בזווית לעודד רבייה.
  4. איסוף עובר מבוים.
    1. כל 15 דק ', לאסוף עובר על ידי העברה למבוגרי טנק רבייה טרי להעביר את הביצים אשר נשארות מאחור דרך מסננת תה.
      הערה: עוברי דג הזברה לפתח סינכרוני כאשר שמרו על צפיפויות וטמפרטורות דומות.
    2. יש לשטוף את הביצים עם ביצת מים (0.21 גר '/ ל מלחים אוקיינוס ​​מיידי ב 1 ליטר מים מזוקקים פעמים) ולהעביר בצלחת פטרי. מעביר את צלחת פטרי חממה ולחה על 28.5 מעלות צלזיוס עם זרימת אוויר.
  5. שעתיים לאחר האוסף האחרון, מופרית מיון, עוברים רב-תאיים לתוך 10 ס"מ בצלחות פטרי ולהפחית צפיפות 50 עוברים לכל צלחת. עובר בחר מתוך אחת, 15חלון של אוסף זמן דק 'עבור יישום במורד הזרם. דגירה עוברת על 28.5 מעלות צלזיוס.
    הערה: לדוגמה, לאסוף עוברים בשעה 8:30, 8:45, 9:00, 9:15, 9:30, 9:45, 10:00 ו 10:15. השוואת פני נקודות זמן, אם את המספר הגדול ביותר של עוברים מופרים הם מהציפורניים שנאספו בשעת 9:00, ולאחר מכן להשתמש רק עובר אלה עבור יישומים במורד זרם.

2. הגדרה עבור דיסוציאציה תא יחידה

  1. כ -30 דקות לפני נקודת הזמן של עניין (18 hpf) סרים עוברות מן הסיסי שלהם באופן ידני עם מלקחיים בסדר.
  2. אסוף ולתייג את המידע הבא לכל מצב: שני 2 מ"ל צינורות microcentrifuge, מסננת תא אחד 40 מיקרומטר, בצלחת תרבית תאים אחד 35 מ"מ, ושני צינורות FACS עקף עם מסננת תא 35 מיקרומטר.
  3. צ'יל החומרים הכימיים הבאים על קרח: מי ביצה המכילים מלחי אוקיינוס ​​מיידי 0.21g / L ב 1 ליטר מים מזוקקים פעמים; דה-yolking מאגר המכיל 55 מ"מ NaCl, 1.8 מ"מ KCl, ו -1.25 מ"מ NaHCO 3; ו FACS מאגר המכיל L-15 של ליבוביץ תקשורת בתוספת 5% בסרום שור עובר חום מומת.
  4. תביאו 1 מ"ל לדגימה של מגיב סלולרי דיסוציאציה 1 עד RT. Cell ההפשרה 1 מ"ל דיסוציאציה מגיב 2 לדגימה על הקרח. מביאים RT מיד לפני השימוש.

3. דיסוציאציה תא יחיד

  1. בעזרת פיפטה זכוכית הנישאת רחבה, להעביר 100-300 עובר לצינור צנטריפוגות מיקרו 2 מיליליטר נפח מינימאלי של ביצת מים.
  2. להרדים העובר על ידי החלפת מים עם 1 מיליליטר קר כקרח ביצת מי הצללת צינורית קרח למשך 20 דקות.
    זהירות! זה קריטי כדי לקבל את אישור ועדת ביקורת חית טיפול נאותה מוסדית שיטת המתת חסד זה (מצמרר על קרח ואחריו תא דיסוציאציה כמו המתת חסד משנית). המתת חסד רגיל בדרך כלל דורש כי עובריים <3 ימים לאחר הפריה הם מולבנים לאחר שהם מקוררים, אשר אינו מתאים לקבלת תאי קיימא.
  3. לשטוף את העוברים פעמיים עם מים ביצה 1 מ"ל קר כקרח. כדי לשטוף, השתמש פיפטה זכוכית נישאת רחבה להסיר ביצת מים P1000 להוסיף ביצת מים.
  4. הסר את החלמון על ידי החלפת המים העובר עם 1 מיליליטר Deyolking הצפת triturating 8-12 פעמים עם טיפ P1000, או עד החלמון נמס ורק גופות העוברים גלויות.
  5. אסוף את הרקמה על ידי צנטריפוגה XG ב 300 דקות 1. השתמש פיפטה להסיר את supernatant בעדינות מבלי לשבש את גלולת הרקמות. Re- להשעות במים 1 מ"ל ביצה.
  6. 3.5 חזור על שלב עבור סכום כולל של שלושה שוטף, אבל על שטיפה של דבר, מחדש להשעות ב 1 מ"ל תא RT דיסוציאציה מגיב 1.
  7. מדגירים מגיבים סלולארי דיסוציאציה 1 במשך 10 דקות ב RT עם צינורות בצורה אופקית. כל 2-3 דקות, בעדינות triturate עם טפטפת P1000 כדי למנוע clumping.
    הערה: ידית דגימות בעדינות במהלך שלבי טחינה דקים. מתישהו גוש יחיד, גדול יהווה בצינור מתוך סבך גופים עוברים. רצון זהלפזר בעיכול נוסף שנעזר טחינה דקה ועדינה. לא מערבולת.
  8. אסוף רקמה על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 3 דקות. הסר supernatant ו resuspend ב 1 מ"ל תא דיסוציאציה מגיב 2.
  9. דגירה של 5-15 דקות ב RT. מניחים את הצינורות בצורה אופקית. כל 2-3 דקות, בעדינות triturate למנוע clumping. כל 5 דקות, להעריך את התקדמות עיכול.
    1. כדי להעריך את ההתקדמות העיכול, לדלל 2 supernatant μl לתוך 18 μl FACS הצפת פיפטה כמו טיפה על צלחת תרבית תאים.
    2. מניחים coverslip על מדגם ולבחון תחת מיקרוסקופ בתרבית רקמה בהגדלות 10X ו 20X.
      הערה: ההכנה אמורה להופיע כמו שילוב של תאים בודדים, קבוצות קטנות, אשכולות גדולים, וגוף העובר מדי פעם בעיקר שלמים.
    3. חזותי להעריך את השיעור בהכנה כי הוא תאים בודדים ואשכולות קטנים.
      הערה: Over-עיכול יפחית כדאיות; תת עיכול יפחית תשואת תא בודדת.
  10. אסוף את הכנת התא על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות. בטל supernatant מחדש להשעות ב 1 מ"ל קר חיץ FACS.
  11. להרטיב מסננת תא 40 מיקרומטר עם FACS חוצץ. לעבור את ההשעיה התא דרך מסננת תא 40 מיקרומטר על צלחת תרבית תאים 35 מ"מ. שטוף את זמן תא המסנן אחת עם 1 מיליליטר FACS מיון חיץ.
  12. העברת זרם דרך צינור 2 מ"ל microcentrifuge. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות מחדש להשעות ב 100 μl FACS חוצץ.
  13. רוזן תשואת תא באמצעות hemocytometer. בהמשך לדלל דגימות 5x10 6 תאים לכל מיליליטר, או ריכוז אופטימלי מומלצים מכונת בחירת FACS. אופציונלי בספירת תאי התשואה על hemocytometer, תאים מתים counterstain עם trypan כחול כדי לאשר הכדאיות של התכשיר התא לפני מיון FACS.
    הערה: תכשירים כי הם גם לדלל ייקח סכום עודף של זמן כדי למיין. תכשירים כי הם גם גoncentrated נוטים להתגודד לתוך multimers והם לא טובים למיון אוכלוסייה טהורה.
  14. שמור 10-20% של כל דגימת שימוש באפליקציות כמו בלא כתם. לקבלת דוגמיות הנותרים, תאים מתים כתם על ידי הוספת חי ניאון / מת (L / D) אפליה לצבוע לתוך מדגם זה. אין לשטוף.
    הערה: כל צבע פלואורסצנטי חודרת תאים עם ממברנות וכתמי תא שנפגעו חומצות גרעין עשויות לשמש לצבוע L / D, ובלבד ספקטרום הקרינה תואם מכונת FACS של תאי תיוג בחירת fluorophore של עניין.
    1. אין לשטוף את ההכנה לאחר הוסיף לצבוע כמו כמה תאים ימותו העוברים טיהור FACS וצריכים מוצאים מהאוכלוסייה הממוינת.
  15. להרטיב את מסננת מיקרומטר תא 35 כתרים צינור FACS עם 20 חיץ μl FACS. הוספת תאים אל מסננת ולאסוף על ידי כוח הכבידה. אחסן על הקרח.

4. FACS העשרה

  1. השתמש FACS להעשיר עבור יחיד, תאי חיים המבטאים את בסמן פלורסנטי.
    1. גדר שער להבחין בין תאים מן ההריסות על מגרש פיזור של פיזור קדימה (FSC-A) משרעת לעומת משרעת פיזור בצד (SSC-A), שניהם עם דרוג ליניארית.
      זהירות! תאי דג זברה הן בדרך כלל קטנה יותר מאשר עכבר או תאים אנושיים. הדבר בא לידי ביטוי בהפרדת בסיס תחתונה בין תאים ופסולת.
    2. מהשער שנקבע 4.1.1, להגדיר שער להעשיר עבור תאים בודדים ואינם כוללים multimers באמצעות פיזור העלילה של גובה פיזור קדימה (FSC-H) וגובה פיזור נמוך בצד (SSC-H), שניהם עם דרוג ליניארית.
      הערה: תאים עם גבוה FSC-H לא פרופורציונאלי והנמוך SSC-H הם multimers סביר ואינם נכללים מיון.
    3. ממערך שער 4.1.2, באמצעות צבע שולט יחיד, להגדיר שער לכלול תאי חיים רק באמצעות פיזור עלילה של FSA-A עם דרוג ליניארית משרעת של הערוץ המשמש לאיתור L / כתם D עם דרוג יומן. כלול L / D תאים שליליים.
    4. מהשער שנקבע 4.1.3, באמצעות צבע שולט יחיד, להגדיר שער לכלול תאי חיים רק עם קרינה חיובית באמצעות פיזור עלילה של-A FSA עם דרוג משרעת ליניארי של הערוץ המשמש לאיתור סמן תא חלבון פלואורסצנטי עם דרוג יומן . כלול תאים חיוביים.
    5. גדר כל פקדי פיצוי, ואם יש צורך, לתת דין וחשבון על התערבות בין L / D כתם ספקטרום חלבון פלואורסצנטי.
  2. היגיון מעין סט לתאים מתחלקים כל השערים להגדיר בשלב 4.1.
    1. שימוש בתאי שכותרתו כפול, ודא gating עבור מיון התא.
      הערה: תאים למיון יהיה תאים ולא פסולת, תאים בודדים ולא multimers, L / D שלילי קרינת תאים חיוביים.
  3. מיין 2,000-4,000 תאים מן האוכלוסייה עניין לתוך 5 μl של קר FACS חוצץ בצינור microcentrifuge על הקרח. כדי למזער גז ומתח על תאים במהלך מיון, השתמש לחצים הנמוכים ביותר אפשריים עבור התאמְמַיֵן.
    הערה: אגל 5 μl של חיץ FACS משמש ככרית תאי יציאת מכונת FACS. איסוף 2,000-4,000 תאים ישירות לתוך FACS חוצץ מבטל את הצורך צנטריפוגה לפני הטעינה על שבבי IFC. מומלץ להשתמש באסטרטגיה זו משום צנטריפוגה יכול להוביל להיווצרות של multimers אם תאים לדבוק זה בזה גלולה.
  4. להעריך את הניתוח הכדאי שלאחר המיון.
    1. ההעברה 1 μl מסודר תאים לצינור FACS טרי עם 100 μl FACS מיון חיץ 1: 1,000 דילול של כתם L / D. להעביר את התאים באמצעות סדרן FACS עם האסטרטגיה gating בשלב 4.1. השתמש שיעור L / D משלילי לחיובי להעריך כדאיות של תאים ממוינים.

5. תאי עומס על מיקרופלואידיקה צ'יפ

  1. באמצעות hemocytometer, למדוד גם את הריכוז וגודל תאים ממוינים.
    1. לדלל תאים ממוינים לפחות 10 μl. לדלל aliquot של 5 μ; תאי L עם 5 μl trypan כחולים. עומס על hemocytometer ולהחיל coverslip.
    2. איסוף תמונות שדה בהיר של כל התאים 4 x 4 רשתות של hemocytometer. ספירת תאים חיים ולחשב תאים / מ"ל ​​חי. תאים חיים אינם תופסים trypan כחול.
      הערה: השתמש בכל תוכנה לניתוח תמונה רגילה למדוד את הקוטר של כל תאי החיים. חשבת את הסטייה הממוצעת ורמת גודל התא, ובחר צלחת IFC מתאימה בטווח גודל תא של עניין. אם טווח תאי גודל בפישוק מגוון גודל תא צלחת IFC, השתמש הצלחות מרובות כדי ללכוד המגוון הרחב של תאים בעלי עניין.
  2. תאי עומס על צלחת IFC פי הוראות היצרן (ראה חומרים).
    1. לדלל התאים 1x10 6 תאים / מ"ל ולבצע אופטימיזציה הציפה לפי הוראות היצרן.
      הערה: אופטימיזציה חוק ארכימדס מבטיחה כי התאים לא לשקוע לקרקעית ולא לצוף למעלה של wel טעינהl לטעינה אופטימלית על שבב IFC. יחס חיץ תאים עשויים להשתנות לפי סוג התא, אך בדרך כלל נע 6: 4-7: 3 של תאים: חיץ.
    2. הוספת תאים לצלחת דרוכה-IFC. צלחת טען לתוך מכונת fluidics תואמת, ולהפעיל תסריט טעינת תא לדחוף תאים דרך מעגל מיקרופלואידיקה ולתוך נתיבים ללכוד.
  3. ודא תאים ונתקעו אתרים ללכוד בצלחת IFC.
    1. הסר את צלחת IFC ממכונה fluidics. הר צלחת IFC על מיקרוסקופ מצויד מתאם צלחת.
    2. אסוף תמונות של שדה קרינה בהירים עבור כל אתר לכיד בהגדלה 10X.
      הערה: פעמים ללכוד Brightfield עשויים לנוע בין 10-50 מילישניות, תלוי בעוצמת המנורה. פעמים לכידות קרינה עשויות לנוע בין 250-750 מילישניות, תלויים בהיר fluorophore. הימנע overexposing תאים כדי למנוע נזקי.

6. סינתזה cDNA

  1. בצע תמוגה התא באתרו פי שאניצלחת FC הוראות היצרן.
    1. הוספת מאגרים תמוגה לבארות בצלחת IFC. צלחת לטעון על מכונת fluidics התואם תסריט תמוגה תא בטווח לפי הוראות יצרן.
  2. בצע שעתוק לאחור על פי הוראות יצרן צלחת IFC.
    1. הוספת ריאגנטים שעתוק לאחור לצלחת IFC. צלחת לטעון על מכונת fluidics תואם. הפעל סקריפט שעתוק לאחור. תנאי אופניים לדוגמא: 1 מחזור של 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 1 מחזור ב 42 מעלות צלזיוס במשך שעה 1., ולאחר מכן 1 מחזור ב 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  3. בצע-הגברה מראש עם בדיקות גן ספציפי על פי הוראות יצרן צלחת IFC.
    הערה: בשל לפרט יותר שלהם עם מספרים נמוכים להעתיק, להשתמש בדיקות fluorogenic שהכותרת ולא בדיקות מותאמות לשימוש עם צבעי intercalator.
    1. פריימרים ברכה לדלל לכל 180 ננומטר סופי. להוסיף פריימרים ונקווה לצלחת IFC. צלחת טען על fluidi תואםמכונת cs. תסריט preamplification לרוץ.
  4. בצע-הגברה מראש עם תנאי המחזור הבאים: 1 מחזור ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואז 18 מחזורים עם denaturing ב 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ואז חישול וסיומת ב 60 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות. חנות מראש מוגבר cDNA ב 4 ° C עד הקציר. קציר cDNA מהצלחת microfluidic בהתאם להוראות וחנות של היצרן ב -20C עד השימוש.

7. cDNA בחר תאים בודדים עבור יחיד יעד qRT-PCR

  1. לדלל cDNA ב -25 מגיב דילול μl פי הוראות היצרן.
    הערה: תשואה סופית משוערת היא 28 μl של cDNA מראש מוגבר לכל תא. שמורת aliquot של diluent לשימוש כשלט ללא תבנית qRT-PCR.
    1. בהתייחסו בשדה בהיר ותמונות ניאון רשמו בשלב 5.3.2, להבקיע כל אתר ללכוד. באופן ידני לספור ולהקליט את מספר התאים. להעריך ולהקליט אם כל תא הוא שפעתorescent.
      הערה: כל אתר מסוים עשוי להכיל 0, 1, או> 1 התא, שם> תא 1 כולל אתרים ללכוד המכילים מספר תאים ו / או פסולת בלתי מזוהה. אם התמונות הן באיכות מספקת, ערך פיקסל עשוי גם להיות מוקצה לכמת את עוצמת האות פלואורסצנטי.
  2. דגימות בחרו לניתוח qRT-PCR.
    1. בחר דוגמאות cDNA מאתר ללכוד שזוהו בשלב 7.2 המכילים תא 1 מדויק עם קרינה חיובית. בריכה 1 aliquots μl של cDNA מכל מדגם.
      הערה: זהו "הפול" בקרה חיובית משמש כדי לקבוע אם הגנים של עניין באים לידי ביטוי בכל אחד מן התאים שנבחרו.
    2. בחר cDNA מלפחות אתר ללכוד אחד שמכיל בדיוק 0 תאים כביקורת שלילית. השתמש diluent משלב 7.1.2 כביקורת ללא תבנית.
  3. הפעל assay qRT-PCR.
    1. השתמש בדיקות יחידות המשמשות הגברה מראש בשלב 6.4.1. טען את כל דגימות triplicatדואר. תנאי רכיבה על אופניים לתגובה 10 μl על צלחת גם 384: 1 מחזור 50 ° C 2 דקות, 1 מחזור 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 40 מחזורים עם denaturing על 95 מעלות צלזיוס 15 שניות ואז חישול והסיומת ב 60 מעלות צלזיוס למשך 1 דקות.

ניתוח 8. נתונים

  1. אמת מוצרי qRT-PCR על ידי ג'ל אלקטרופורזה סטנדרטית. אשר המוצר היא להקה אחת ב משקל מולקולרי צפוי (משתנה עבור כל בדיקה).
    הערה: אם בדיקה מייצרת להקות מרובות או להקה יחידה בגודל הולם, אז סגולי מוטל בספק, וזה כולל את הגן מניתוח.
  2. בדוק את כל קימורי הגברת החשבון עבור בתופעות חריגות 14. חשב את הערך CT הממוצע עבור כל שילוב מדגם / גן 15.
    הערה: ערכי CT עבור בקרות חיוביות בדרך כלל נעים בין 10-30. ערכי CT עבור פקדים שליליים בדרך כלל נעים בין 35-40 (לא הגברה). ערכי CT 30-35 נחשבים ביטוי נמוך מאודוצריך לפרש בזהירות 14.
  3. נתונים דווח
    1. אם דגימות ליפול CT = 10-30, הנתונים עשויים להיות כמו כן דווח כי שינוי לקפל יחסית שפע תמליל מדגם שליטה.
      הערה: מקפלים שינוי שווה 2 ^ (- ΔΔCT) שבו ΔCT הוא ביחס גן משק על ידי הפחתת CT הממוצע של המדגם מן גן משק ו ΔΔCT הוא ההבדלים ΔCT בין המדגם לבין כביקורת חיובית 15.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כהוכחה עקרונית, ביטוי גנים הוערך לחקור דינמיקת בידול במהלך התפתחות של לב. בשנת דג זברה, אבות לב נובעים אוכלוסיית mesodermal של תאי נודדים אל mesoderm הצלחת לרוחב הקדמי שבו הם פתיל כדי ליצור את צינור הלב ליניארי. לפני היתוך, אבות לב מתחילים לבטא את nkx2.5 גורם שעתוק (NK2 homeobox 5), אשר נחשב סמן ספציפי המוקדם של אבות לב 16,17. הנה, דג מהונדס BAC שתואר לעיל Tg (nkx2.5: ZsYellow) 18, מקוצר nkx2.5: ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השיטה המתוארת במסמך זה השתמש ביטוי של חלבון פלואורסצנטי תחת השליטה של ​​מקדם ספציפי תאים מהסוג להעשיר אוכלוסייה של ובתאים לב מעוברי דג זברה לשימוש במערכת ללכוד microfluidic בסיוע תא בודד להעריך ביטוי של תת-קבוצה של גני לב יחיד תאים. ובלבד יכולות עירור ופליטה לייזר FACS עולים בקנה אחד עם fluorophore (ים) של בחירה, שיטה זו יכולה לשמש לכל קו כתב ניאון. קווי כתב דג זברה רבים כבר קיים, ודגים מהונדסים נושאת לכתבי רומן יכולים להיוצר קטן כמו 3 חודשים. בנוסף, זרימת עבודה זו יכולה להתאים לי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים לד"ר סי ג'פרי ברנס על מלאי הדגים. המחברים אסירי תודה למתקן הליבה של ציטומטריית הזרימה של UNC, ליבת UNC-CGIBD AAC על המשאבים המאפשרים פרויקט זה, ולמתקן ZAC לטיפול בבעלי חיים. L.S. נתמך על ידי מענק NIH T32 HL069768-13 (PI, Nobuyo Maeda). N.F. נתמך על ידי מלגת מחקר לתארים מתקדמים של NSF NSF-DGE-1144081. מחקר זה נתמך על ידי מענק NIH P30DK034987 (ל-UNC Advanced Analytics Core), מענק פיתוח מדענים של איגוד הלב האמריקאי 13SDG17060010 ומענק הקרן הרפואית אליסון AG-NS-1064-13 (לד"ר קיאן), ומענק NIH R00 HL109079 (לד"ר ליו).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>אספקה
דומונט #5 מלקחייםFine Science Tools11254-20להסרת הכוריון מעוברים
צינור מיקרוצנטריפוגה 2 מ"לGeneMateC-3261-1
40 מסננת תאים אוםביובייסיקSP104151
צלחת תרבית 35 מ"מפלקון351008
צינורות FACS עם מסננת תאים 35 אוםFalcon352235
P1000 וטיפיםRainin17005089
P20 וטיפיםRainin
IFCFluidigm100-6117גרסה 100-6117 E1 שימש בניסוי מייצג
פיפטת זכוכית פסטור רחב נשאVWR14673-010עבור העברת עוברים
דג זברה בוגר מסוג ברN/Aהשתמשנו בקו AB דג
זברה טרנסגני בוגרN/Aהשתמשנו ב-Tg(nkx2.5:ZsYellow)
שםחברהמספר קטלוגיהערות
ריאגנטים לדיסוציאציה של תאים
מים מזוקקים כפוליםN/A
אינסטנט אוקיינוס מלח יםאינסטנט אוקיינוסSS15-10
NaClFisherScientificS271-3מכינים מלאי במים ומשתמשים למאגר הסרת חלמון
KClSigma AldrichP5405מכינים מלאי במים ומשתמשים למאגר הסרת חלמון
NaHCO3Sigma AldrichS6014מייצרים מלאי במים ומשתמשים בו למאגר הסרת חלמון
L-15Gibco21083-027
FBSFisherScientific03-600-511השבתת חום; כל מותג של FBS צריך להיות בסדר
מגיב דיסוציאציה של תאים 1 -TrypLELife Technologies12605-010יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
מגיב דיסוציאציה תאים 2 - FACSmaxGenlantisT200100 Store -20; להפשיר על קרח; להביא לטמפרטורת החדר לפני השימוש
בפרונאז (אופציונלי)SigmaP5147
צבע L / D - Sytox BlueLife TechnologiesS34857כל כתם חי / מת המתאים לזרימה ציטומטריה יעבוד
Trypan BlueGibco15250-061
<חזק>שם< / חזק> CompanyCatalog NumberComments
Reagents for ifc plate and qRT-PCR
בדיקות ספציפיותבדיקות ישתנו בהתאם לניסוי
TaqMan Probe ef1aLife TechnologiesDr03432748_m1
TaqMan Probe gata4Life TechnologiesDr03443262_g1
TaqMan Probe nk2-5Life TechnologiesDr03074126_m1
TaqMan Probe myl7Life TechnologiesDr03105700_m1
TaqMan Probe vmhcLife TechnologiesDr03431136_m1
TaqMan Probe isl1Life TechnologiesDr03425734_m1
TaqMan Gene Expression Master MixLife Technologies4369016
ריאגנטים הרשומים בפרוטוקול
C1 Reagent KitFluidigm100-5319ריאגנטים להעמסת תאים על צלחת IFC
Ambion Single Cell-to-CTTMLife Technologies4458237ריאגנטים לשעתוק הפוך ושלבי הגברה מוקדמת
ביולוגיה מולקולרית איכותמים קורנינג46-000CM
C1 IFC עבור PreAmp (5-10 um)Fluidigm100-5757צלחת IFC לתאים קטנים
<חזק>שם<חזק>חברה><חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות
><חזק>ציוד
מכונת הכנה אוטומטית C1Fluidigm100-5477לשימוש בצלחת IFC
המוציטומטר Z359629 סיגמא אולדריץ'לספירת תאים והערכת גודל התא
מיקרוסקופלהסרת עוברים מכוריון
מיקרוסקופלהערכת עיכול תא בודד
מכונתלבידוד תאים מעניינים
פרוטוקול יצרן שבבי 17005091 לגן יצרן IFC ניתוח , תרבית רקמה FACS

מקורות

  1. Speicher, M. R. Single-cell analysis: toward the clinic. Genome medicine. 5, (2013).
  2. Macaulay, I. C., Voet, T. Single cell genomics: advances and future perspectives. PLoS genetics. 10, e1004126(2014).
  3. Marco, E., et al. Bifurcation analysis of single-cell gene expression data reveals epigenetic landscape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 5643-5650 (2014).
  4. Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Current opinion in biotechnology. 23, 110-119 (2012).
  5. Garlanda, C., Dejana, E. Heterogeneity of endothelial cells. Specific markers. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 17, 1193-1202 (1997).
  6. Diaz-Cano, S. J. Tumor heterogeneity: mechanisms and bases for a reliable application of molecular marker design. International journal of molecular sciences. 13, 1951-2011 (2012).
  7. Guo, G., et al. Mapping cellular hierarchy by single-cell analysis of the cell surface repertoire. Cell stem cell. 13, 492-505 (2013).
  8. Guo, G., et al. Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst. Developmental cell. 18, 675-685 (2010).
  9. Treutlein, B., et al. Reconstructing lineage hierarchies of the distal lung epithelium using single-cell RNA-seq. Nature. 509, 371-375 (2014).
  10. Kimmel, C. B. Genetics and early development of zebrafish. Trends in genetics : TIG. 5, 283-288 (1989).
  11. Liu, J., Stainier, D. Y. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circulation research. 110, 870-874 (2012).
  12. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 203, 253-310 (1995).
  13. Zhao, S., Fung-Leung, W. P., Bittner, A., Ngo, K., Liu, X. Comparison of RNA-Seq and microarray in transcriptome profiling of activated T cells. PloS one. 9, e78644(2014).
  14. McCall, M. N., McMurray, H. R., Land, H., Almudevar, A. On non-detects in qPCR data. Bioinformatics. 30, 2310-2316 (2014).
  15. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature. 3, 1101-1108 (2008).
  16. Lyons, I., et al. Myogenic and morphogenetic defects in the heart tubes of murine embryos lacking the homeo box gene Nkx2-5. Genes & development. 9, 1654-1666 (1995).
  17. Chen, J. N., Fishman, M. C. Zebrafish tinman homolog demarcates the heart field and initiates myocardial differentiation. Development. 122, 3809-3816 (1996).
  18. Zhou, Y., et al. Latent TGF-beta binding protein 3 identifies a second heart field in zebrafish. Nature. 474, 645-648 (2011).
  19. Paffett-Lugassy, N., et al. Heart field origin of great vessel precursors relies on nkx2.5-mediated vasculogenesis. Nature cell biology. 15, 1362-1369 (2013).
  20. McCurley, A. T., Callard, G. V. Characterization of housekeeping genes in zebrafish: male-female differences and effects of tissue type, developmental stage and chemical treatment. BMC molecular biology. 9, 102(2008).
  21. Tang, R., Dodd, A., Lai, D., McNabb, W. C., Love, D. R. Validation of zebrafish (Danio rerio) reference genes for quantitative real-time RT-PCR normalization. Acta biochimica et biophysica Sinica. 39, 384-390 (2007).
  22. Serbedzija, G. N., Chen, J. N., Fishman, M. C. Regulation in the heart field of zebrafish. Development. 125, 1095-1101 (1998).
  23. de Pater, E., et al. Distinct phases of cardiomyocyte differentiation regulate growth of the zebrafish heart. Development. 136, 1633-1641 (2009).
  24. Hami, D., Grimes, A. C., Tsai, H. J., Kirby, M. L. Zebrafish cardiac development requires a conserved secondary heart field. Development. 138, 2389-2398 (2011).
  25. Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish. Developmental biology. 214, 23-37 (1999).
  26. Molina, N., et al. Stimulus-induced modulation of transcriptional bursting in a single mammalian gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 20563-20568 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

FACSQRT PCR
בידוד ואפיון של תאים בודדים מעוברים דג הזברה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.