פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד תאים בודדים מעוברי דג הזברה, העשרה לתאים מעניינים, לכידת תאי דג זברה במערכות מולטיפלקס תאים בודדים מבוססות מיקרופלואידית, והערכת ביטוי גנים מתאים בודדים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
דג הזברה (Danio rerio) הוא אורגניזם מודל רב עוצמה לחקר התפתחות בעלי חוליות. למרות שהיבטים רבים של התפתחות עוברית של דג הזברה תוארו ברמה המורפולוגית, מעט ידוע על הבסיס המולקולרי של שינויים תאיים המתרחשים עם התפתחות האורגניזם. עם ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות מיקרופלואידיקה וריבוב, ניתן כעת לאפיין ביטוי גנים בתאים בודדים. זה מאפשר לחקור הטרוגניות בין תאים בודדים של אוכלוסיות תאים ספציפיות כדי לזהות ולסווג תת-סוגים של תאים, לאפיין מצבי ביניים המתרחשים במהלך התמיינות תאים ולחקור תגובות תאיות דיפרנציאליות לגירויים. מחקר זה מתאר פרוטוקול לבידוד תאים בודדים ברי קיימא מעוברי דג זברה לבדיקות ריבוי תפוקה גבוהה. ניתן ליישם שיטה זו במהירות על כל סוג תאים עובריים של דג הזברה עם סמנים פלואורסצנטיים. ניתן להשתמש בהרחבה של שיטה זו גם בשילוב עם טכנולוגיות ריצוף תפוקה גבוהה כדי לאפיין באופן מלא את הטרנסקריפטום של תאים בודדים. כהוכחה לעיקרון, השפע היחסי של סמני התמיינות לבביים הוערך בתאים בודדים מבודדים שמקורם באבות לבביים חיוביים nkx2.5. על ידי הערכת ביטוי גנים ברמת התא הבודד ובנקודת זמן אחת, הנתונים תומכים במודל שבו אבות לבביים מתקיימים יחד עם צאצאים מתמיינים . השיטה וזרימת העבודה המתוארות כאן ישימות באופן נרחב לקהילת המחקר של דגי הזברה, ודורשות רק קו דגים טרנסגני מסומן וגישה לטכנולוגיות מיקרופלואידיקה.
מבוא
רוב המחקרים הנוכחיים של ביולוגיה מולקולרית של תא מבוססים על ממוצעי אוכלוסייה. עם זאת, אירועים ביולוגיים חשובים עשויים להיות רעולי פנים על ידי ניתוחים מבוסס אוכלוסיה המסורתיים הללו, מאחר ואנשים קטין יכול לשחק תפקידים מרכזיים בתהליכים ביולוגיים ותוצאות המחלה. הבנת ביטוי גני אוכלוסיות הטרוגניות ברמת התא הבודדה יכולה (ויש לו) להוביל לתובנות ביולוגיים וקליניים רלוונטיים 1,2. דאגה ללימודי התפתחות עובריות, בתוך אוכלוסייה גדולה יותר של תאים, ובתאים הם בדרך כלל מיוצגים כראוי, מה שהופכים אותו מאתגר כדי לזהות שינויים עדינים ביטוי גנים שבסופו של דבר ליזום החלטות גורל תא 3. באופן דומה, סוג תא בודד יכול להיות ביטוי פרופ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
פרוטוקול זה מחייב שימוש דג זברה לחיות, מבוגר לייצר עוברים. עוברים נקצרים לאיסוף רקמות. זה חיוני כדי לקבל את אישור ועדה בוחן אתיקה המתאימה לנהל את הניסוי הזה.
1. השג עובר מבוימים
- היום לפני הניסוי, להכין בריא, דג זברה מבוגרת לרבייה. מניחים זכר אחד ונקבה אחת משני צדי המתרס של מחיצה ברורה בתוך אקווריום רבייה.
- חזור על 1.1 לקערות רבייה רבות ככל הכרחיות ליצירת עובר מספיק עבור היישום במורד הזרם. השג עובר מן הדגים הוא סוג בר דגים ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כהוכחה עקרונית, ביטוי גנים הוערך לחקור דינמיקת בידול במהלך התפתחות של לב. בשנת דג זברה, אבות לב נובעים אוכלוסיית mesodermal של תאי נודדים אל mesoderm הצלחת לרוחב הקדמי שבו הם פתיל כדי ליצור את צינור הלב ליניארי. לפני היתוך, אבות לב מתחילים לבטא את nkx2.5 גורם שעתוק (NK2 homeobox 5), אשר נחשב סמן ספציפי המוקדם של אבות לב 16,17. הנה, דג מהונדס BAC שתואר לעיל Tg (nkx2.5: ZsYellow) 18, מקוצר nkx2.5: .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השיטה המתוארת במסמך זה השתמש ביטוי של חלבון פלואורסצנטי תחת השליטה של מקדם ספציפי תאים מהסוג להעשיר אוכלוסייה של ובתאים לב מעוברי דג זברה לשימוש במערכת ללכוד microfluidic בסיוע תא בודד להעריך ביטוי של תת-קבוצה של גני לב יחיד תאים. ובלבד יכולות עירור ופליטה לייזר FACS עולים בקנה אחד עם fluorophore (ים) של בחירה, שיטה זו יכולה לשמש לכל קו כתב ניאון. קווי כתב דג זברה רבים כבר קיים, ודגים מהונדסים נושאת לכתבי רומן יכולים להיוצר קטן כמו 3 חודשים. בנוסף, זרימת עבודה זו יכולה להתאים לי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
אנו מודים לד"ר סי ג'פרי ברנס על מלאי הדגים. המחברים אסירי תודה למתקן הליבה של ציטומטריית הזרימה של UNC, ליבת UNC-CGIBD AAC על המשאבים המאפשרים פרויקט זה, ולמתקן ZAC לטיפול בבעלי חיים. L.S. נתמך על ידי מענק NIH T32 HL069768-13 (PI, Nobuyo Maeda). N.F. נתמך על ידי מלגת מחקר לתארים מתקדמים של NSF NSF-DGE-1144081. מחקר זה נתמך על ידי מענק NIH P30DK034987 (ל-UNC Advanced Analytics Core), מענק פיתוח מדענים של איגוד הלב האמריקאי 13SDG17060010 ומענק הקרן הרפואית אליסון AG-NS-1064-13 (לד"ר קיאן), ומענק NIH R00 HL109079 (לד"ר ליו).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>אספקה | |||
| דומונט #5 מלקחיים | Fine Science Tools | 11254-20 | להסרת הכוריון מעוברים |
| צינור מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל | GeneMate | C-3261-1 | |
| 40 מסננת תאים אום | ביובייסיק | SP104151 | |
| צלחת תרבית 35 מ"מ | פלקון | 351008 | |
| צינורות FACS עם מסננת תאים 35 אום | Falcon | 352235 | |
| P1000 וטיפים | Rainin | 17005089 | |
| P20 וטיפים | Rainin | ||
| IFC | Fluidigm | 100-6117 | גרסה 100-6117 E1 שימש בניסוי מייצג |
| פיפטת זכוכית פסטור רחב נשא | VWR | 14673-010 | עבור העברת עוברים |
| דג זברה בוגר מסוג בר | N/A | השתמשנו בקו AB דג | |
| זברה טרנסגני בוגר | N/A | השתמשנו ב-Tg(nkx2.5:ZsYellow) | |
| שם | חברה | מספר קטלוגי | הערות |
| ריאגנטים לדיסוציאציה של תאים | |||
| מים מזוקקים כפולים | N/A | ||
| אינסטנט אוקיינוס מלח ים | אינסטנט אוקיינוס | SS15-10 | |
| NaCl | FisherScientific | S271-3 | מכינים מלאי במים ומשתמשים למאגר הסרת חלמון |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405 | מכינים מלאי במים ומשתמשים למאגר הסרת חלמון |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6014 | מייצרים מלאי במים ומשתמשים בו למאגר הסרת חלמון |
| L-15 | Gibco | 21083-027 | |
| FBS | FisherScientific | 03-600-511 | השבתת חום; כל מותג של FBS צריך להיות בסדר |
| מגיב דיסוציאציה של תאים 1 -TrypLE | Life Technologies | 12605-010 | יש לאחסן בטמפרטורת החדר. |
| מגיב דיסוציאציה תאים 2 - FACSmax | Genlantis | T200100 Store -20; להפשיר על קרח; להביא לטמפרטורת החדר לפני השימוש | |
| בפרונאז (אופציונלי) | Sigma | P5147 | |
| צבע L / D - Sytox Blue | Life Technologies | S34857 | כל כתם חי / מת המתאים לזרימה ציטומטריה יעבוד |
| Trypan Blue | Gibco | 15250-061 | |
| <חזק>שם< / חזק> | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for ifc plate and qRT-PCR | |||
| בדיקות ספציפיות | בדיקות ישתנו בהתאם לניסוי | ||
| TaqMan Probe ef1a | Life Technologies | Dr03432748_m1 | |
| TaqMan Probe gata4 | Life Technologies | Dr03443262_g1 | |
| TaqMan Probe nk2-5 | Life Technologies | Dr03074126_m1 | |
| TaqMan Probe myl7 | Life Technologies | Dr03105700_m1 | |
| TaqMan Probe vmhc | Life Technologies | Dr03431136_m1 | |
| TaqMan Probe isl1 | Life Technologies | Dr03425734_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Life Technologies | 4369016 | |
| ריאגנטים הרשומים בפרוטוקול | |||
| C1 Reagent Kit | Fluidigm | 100-5319 | ריאגנטים להעמסת תאים על צלחת IFC |
| Ambion Single Cell-to-CTTM | Life Technologies | 4458237 | ריאגנטים לשעתוק הפוך ושלבי הגברה מוקדמת |
| ביולוגיה מולקולרית איכות | מים קורנינג | 46-000CM | |
| C1 IFC עבור PreAmp (5-10 um) | Fluidigm | 100-5757 | צלחת IFC לתאים קטנים |
| <חזק>שם | <חזק>חברה | ><חזק>מספר קטלוגי | <חזק>הערות |
| ><חזק>ציוד | |||
| מכונת הכנה אוטומטית C1 | Fluidigm | 100-5477 | לשימוש בצלחת IFC |
| המוציטומטר | Z359629 סיגמא אולדריץ' | לספירת תאים והערכת גודל התא | |
| מיקרוסקופ | להסרת עוברים מכוריון | ||
| מיקרוסקופ | להערכת עיכול תא בודד | ||
| מכונת | לבידוד תאים מעניינים |
מקורות
- Speicher, M. R. Single-cell analysis: toward the clinic. Genome medicine. 5, (2013).
- Macaulay, I. C., Voet, T. Single cell genomics: advances and future perspectives. PLoS genetics. 10, e1004126(2014).
- Marco, E., et al. Bifurcation analysis of single-cell gene express....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
