מאמר שיטה

זיהוי של תנאים קריטיים לImmunostaining באפונה בכנימות עוברים: הגדלת רקמות חדירות והפחתת מכתים רקע

9.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53883

⸱

2 בפברואר 2016

 , 
1Department of Entomology, National Taiwan University, 2Institute of Biotechnology, National Taiwan University, 3Research Center for Developmental Biology and Regenerative Medicine, National Taiwan University, 4Genome and Systems Biology Degree Program, National Taiwan University and Academia Sinica

במאמר זה

סיכום

מוצג פרוטוקול של צביעה חיסונית שלמה על עוברי כנימות, בו מטופלים תנאים קריטיים להפחתת צביעת רקע והגברת חדירות הרקמות. תנאים אלה פותחו במיוחד לזיהוי יעיל של ביטוי חלבונים ברקמות העובריות של כנימות.

תקציר

Pisum Acyrthosiphon כנימת האפון, עם הגנום רצף וגמישות פנוטיפית שפע, הפך מודל מתעורר ללימודים הגנומי והתפתחותיים. כמו כנימות אחרות,. Pisum להפיץ במהירות באמצעות רבייה משריצה פרתנוגנטית, שבו עובר לפתח בתוך תאי ביצה באופנת פס ייצור בovariole. בעבר הקמנו פלטפורמה חזקה של כל הר הכלאה באתר המאפשרת זיהוי של ביטוי mRNA בעוברי הכנימה. לניתוח הביטוי של חלבון, אם כי, הוקם פרוטוקולים לimmunostaining ovarioles של כנימות משריצות מיניות לא הניב תוצאות משביעות רצון. כאן אנו מדווחים תנאים מותאמים להגדלת חדירות רקמות ולהפחית מכתים רקע, אשר שניהם היו בעיות בעת החלת גישות הוקמו. אופטימיזציות כוללות: (1) דגירה של K (1 מיקרוגרם / מיליליטר, 10 דקות) proteinase, שנמצא F החיוניאו חדירת נוגדן בעוברי אמצע וכנימה בשלב מאוחר; (2) החלפה של אלבומין בסרום סרום עז / שור הרגיל עם מגיב חסימה מסופק על ידי digoxigenin (DIG) מבוסס חיץ להגדיר ו( 3) יישום של מתנול ולא מי חמצן (H 2 O 2) להלבנת peroxidase אנדוגני; אשר הקטין באופן משמעותי את מכתים הרקע ברקמות הכנימה. תנאים אלה קריטיים מותאמים לimmunostaining יאפשר איתור יעיל של מוצרי גן בעוברים של. pisum וכנימות אחרות.

מבוא

כנימות הן חרקים hemipteran עם גופים רכים (1-10 מ"מ) קטנים. הם ניזונים צמחים על ידי מציצת לשד השיפה עם איברי פה פירסינג. בנוסף, הם מסתמכים על חיידק endosymbiotic לחייב, aphidicola Buchnera, לסנתז חומצות אמינו חיוניות שחסרות בתזונת SAP השיפה. יש כנימות היסטורית חיים מורכבות הכוללת רבייה משריצה פרתנוגנטית במהלך האביב וphotoperiods ארוך ביום הקיץ ורבייה מינית מֵטִיל בֵּיצִים מופעלת על ידי photoperiods קצר-היום שבמהלכו הם שכבו במספר מוגבל של ביצי overwintering 1,2. באביב ביצים אלה בוקעים לייצר הדור הראשון של כל הנקבה הכנימות (fundatrices), הבאות סיבובים רבים של רבייה פרתנוגנטית עד סתיו. רביית הבתולים המחזוריות בכנימות, שם חלופי שלבים מיניים ומיניים במחזור החיים השנתי, כבר נחשבו 1,2 חידוש אבולוציוני. בכנימות המשריצות פרתנוגנטית, עובר מתרחש בתוך תאי ביצה של צינוריות השחלות (ovarioles). לעומת זאת, עובר מֵטִיל בֵּיצִים מיני לפתח בביציות המופרות. מלבד פלסטיות רבייה, כנימות יכולות להציג polyphenism אגף הבין דור: בתגובה לאותות צפיפות ואיומי טורף, הנקבות מיניות unwinged יכולות viviparously לייצר צאצאים מכונפים להגירה למרחקים ארוכים. פרסום רצף הגנום של כנימת אפון Acyrthosiphon pisum חור' רצף הגנום הראשון לבסיס חרקים מאפשר hemimetabolous חקירה נוספת של פלסטיות רבייה, polyphenism אגף, ותכונות אחרות כוללים אינטראקציות חרקים צמח, vectoring הנגיפי וסימביוזה בכנימות על מולקולרי בסיס 3.

בנוסף להגנום רצף, כלים לאפיון ביטוי גנים ותפקוד נדרשים לקידום כנימת האפונה כאורגניזם מודל בוגר 4. שתארנו פרוטוקולים חזקים של כל הר הכלאה באתר לאיתור ביטוי של mRNA בעוברי כנימה 5-7. התערבות RNA (RNAi) באמצעות הזרקת RNA פעמיים תקועים והאכלה שמשה במשך השתקת גנים בנימפות כנימה ומבוגרים, אבל תנאים יציבים לגן מציאה בעוברים לא דווחו 8-10 עדיין. Immunostaining, גישה מבוססת נוגדנים שיכולים לזהות ביטוי חלבון בדגימות לפני ואחרי מציאה RNAi, שבוצע בעוברי כנימת האפונה 11-13. עם זאת, גידול בשיעור של חדירות וחיסול מכתים רקע רקמה הוא עדיין לא מספק תוך שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים לimmunostaining בעוברים המשריצים מיניים של כנימת האפון. לדוגמא, מצאנו כי החדירה של נוגדן לרקמות ירידה בעוברי gastrulating (שלבי 8-10) ושעובר עם ניצני איבר מורפולוגית לזיהוי (שלבי 13-14) היו בקושי חדיר לנוגדן. בנוסף, מכתים רקע היה דמיין בviviparo מינישלנו עובר כנימת אפונה מוכתמת באמצעות נוגדנים נגד סמן germline Vasa כמו גם שנגד חלבון Engrailed / Invected הביע במגזרים העובריים 12,13. למעשה מכתים רקע עדיין היה נראה בבירור בעוברים מוכתמים עם הנוגדנים משני בלבד.

על מנת להגדיל את החדירות מבלי לפגוע שלמות רקמות כנימה, אנחנו טיטרציה זהירות ריכוז proteinase K ונקבעו תנאים אופטימליים לעיכול רקמה על עוברי כנימה. על מנת להימנע מהכתמה אינה ספציפית בכנימת האפון, חיפשנו תרכובות שיכולים לחסום ביעילות עוברים ולדכא פעילות של peroxidase אנדוגני (POD), אנזים מועסק להגברת אותות במהלך immunostaining. מגיב חסימה הניתן על ידי קבוצת חיץ מבוססת digoxigenin (DIG), ולא עז בסרום הנורמלי משמש באופן מסורתי (NGS) / אלבומין בסרום שור (BSA), צמצם באופן משמעותי מכתים רקע. יתר על כן, מתנול נמצא inhiנשך את פעילות POD אנדוגני בצורה יעילה יותר מאשר מי חמצן (H 2 O 2). פרטים בדבר תנאי כנימה ספציפית אלה לimmunostaining על עוברים יהיו מתוארים בסעיפים הבאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תרבות של כנימות

הערה:. זן המעבדה של כנימת אפון המשריצה פרתנוגנטית pisum נאסף במקור בטייוואן המרכזי וכבר גדל על צמחי מארח (sativum Pisum האפונה הגינה או פול שעועית הרחב) תחת photoperiod ארוך יום ליותר מ -300 דורות (דור אחד: ~ 10 ימים).

  1. נביטה של ​​זרעים
    1. משרים את הזרעים של צמחי מארח במים ברז למשך 3-5 ימים על RT. למלא במים טריים פעם ביום.
      הערה: לחלופין, לשים זרעים של צמחי מארח ישר לתוך אדמה לחה יכול לגרום לנביטה גם כן.
    2. לגדול זרעים נובטים 10 בסיר קטן (בקוטר סנטימטר 9 x 7 ס"מ) עם אדמה בתא הצמיחה תחת photoperiod 16 שעות אור / חושך שעה 8 ב 20 ° C.
    3. כ -10 ימים לאחר הצמיחה מתחילה, להעביר כנימות על צמחים שגובהם הוא יותר מ -8 סנטימטרים.
  2. העברת הכנימות
    1. שמור כל סיר של צמחים בתוך כוס זכוכית 1 ליטר, להעביר 8 כנימות בוגרות על צמחים באמצעות מכחול, ולאחר מכן לאטום את הכוס עם חיפוי אווירי חדירה כגון רשת גזה כדי למנוע כנימות לברוח.
    2. דגירה כנימות בתא צמיחה תחת photoperiod 16 שעות אור / חושך שעה 8 ב 20 ° C. מים בכל עציץ של צמחים אחת ליום.
    3. לקבלת הדור הבא של כנימות, לחזור צעדי 1.1.3-1.2.2 עשרה ימים לאחר העברת הכנימה העיקרית.

2. Dissection וקיבוע של השחלות

  1. טרי להכין paraformaldehyde% 4 (PFA) ב1x שנאגרו מלוח פוספט (PBS) כחיץ הקיבעון.
  2. מלא גם אחד של צלחת מקום עם PFA (כ -500 μl), למקם את הצלחת תחת מיקרוסקופ סטריאו בהגדלה נמוכה, ולצלול כנימה בוגרת בתוך PFA לנתיחה.
  3. לנתח השחלות על ידי מחזיק את הראש והבטן עם סט אחד של מלקחיים, חיתוך פתוח הגבציפורן של הבטן, וגורר את השחלות מחלל הבטן.
  4. תקן שלושה זוגות של השחלות בצינור 1.5 מיליליטר המכיל 1 מיליליטר של PFA ב RT במשך 20 דקות.
  5. חיץ קיבעון למזוג עם טפטפת העברה (או זכוכית או חד פעמי) ולאחר מכן לשטוף השחלות עם 0.2% TritonX-100 ב 1x PBS (PBST) 3 פעמים במשך 10 דקות כל אחד. קל רועד במיקסר / הכתף (זווית סיבוב: 60 ° (F60) מהירות / סיבוב: 8 סל"ד) מומלץ לשני קיבעון וכביסה.

3. טיפול בproteinase K (PK) כדי להגדיל את החדירות של רקמות עובריים

הערה: טיפול PK מוחל על עוברים מהארכה ואילך להקה נבט (שלב 11 של פיתוח). לעוברים צעירים, בשלב זה הוא אופציונאלי.

  1. סדרתי לדלל את פתרון המניות של PK (10 מ"ג / מיליליטר) עם 1x PBS ל1 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז עבודה.
  2. דגירה השחלות עם 1 מיקרוגרם / מיליליטר של PK (כ -500 μl) במשך 10 דקות עם רעד קל.
  3. soluti למזוג PKעל ולאחר מכן לשטוף את השחלות עם 700 μl של גליצין (2 מ"ג / מיליליטר) 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
  4. לשטוף השחלות עם PBST 0.2% פעמיים במשך 10 דקות כל אחד.
  5. תקן השחלות שוב עם חיץ קיבעון במשך 15 דקות ב RT עם רעד קל.
  6. בטל supernatant ולשטוף השחלות עם PBST 0.2% פעמיים במשך 10 דקות כל אחד.

4. מתנול דגירה לפעילות דיכוי peroxidase אנדוגני (POD)

הערה: הדגירה מתנול אינה מוחלת על עוברים נתון לאפיטופים מכתים או נוגדן Phalloidin שמתנול רגיש.

  1. סדרנו ליבש השחלות עם אחוז שונה של מתנול בPBST% 0.2 (V / V: 1: 3, 1: 1, 3: 1) על ידי דוגרים השחלות בכל ריכוז של פתרון מתנול במשך 10 דקות עם תסיסה עדינה.
  2. מייבשים השחלות עם מתנול 100% עבור שעה 1 ב RT עם רעד קל.
    הערה: אפשר עדיין להשיג תוצאות משביעות רצון של מכתים מרקמות כנימה שאוחסנו במתנול 100% ב -20 ו# 176; C למשך חודש אחד.
  3. סדרנו רעננות השחלות עם אחוז שונה של מתנול בPBST% 0.2 (V / V: 3: 1, 1: 1, 1: 3) על ידי דוגרים השחלות בכל ריכוז של פתרון מתנול במשך 10 דקות עם תסיסה עדינה.

5. נוגדן מכתים

  1. לדלל את פתרון 10x חסימה מסט החיץ מבוסס DIG (DIG-B) ל1x.
    הערה: פתרון חסימת 1x DIG-B הוא יעילה יותר להפחתת הרקע מכתים מאשר מגיב הסטנדרטי החסימה המורכבת של 5% (V / V) בסרום עז נורמלי (NGS) ו -0.5% (V / V) אלבומין בסרום שור (BSA ) בPBST 0.2%.
  2. דגירה השחלות עם פתרון 1x DIG-B החסימה ל2.5-4 שעות על RT או O / N ב 4 ° C עם רעד קל.
    הערה: לשלושה זוגות של השחלות בצינור 1.5 מיליליטר, 200 μl הוא הנפח המינימאלי לחסימת מדגם ומכתים נוגדן.
  3. למזוג supernatant ולהחליף עם פתרון 1x DIG-B חסימה טרי המכיל נוגדן ראשוני בdiluti המתאיםעל יחס. להכתים את השחלות ל4 שעות ב RT או O / N ב 4 ° C עם רעד קל.
    הערה: לניסוי המתואר כאן, השתמש בדילולים אופטימליים הבאים של נוגדנים עיקריים: (1) נוגדן ApVas1: 1: 500 לצביעת chromogenic, 01:50 למכתים immunofluorescence; (2) נוגדן אנטי-טובולין α: 1: 500; (3) נוגדנים חד שבטי 4D9: 01:25.
  4. לשטוף השחלות עם PBST 0.2% 4 פעמים במשך 15 דקות כל אחד.
  5. דגירה השחלות עם פתרון 1x DIG-B חסימה עבור שעה 1 ב RT עם רעד קל.
  6. למזוג supernatant ולהחליף עם פתרון DIG-B חסימה טרי 1x המכיל נוגדנים משני ביחס דילול מתאים. להכתים את השחלות ל4 שעות ב RT או O / N ב 4 ° C עם רעד קל.
    1. השתמש ביחסי הדילול הבאים של נוגדנים משני: (1) למכתים immunofluorescence: 1: 500 לIgG אלקסה פלואוריד 633 עיזים נגד ארנב או אלקסה פלואוריד 488 עיזים אנטי העכבר IgG; (2) לצביעה chromogenic: 1: 200 לIgG נגד ארנב העז biotinylated.
      הערה: הנוגדנים משני biotinylated מוחל לאינטראקציה עם avidin ביוטין-המורכב (ABC) בזיהוי מבוסס המצע (chromogenic), שדרכו אותות הצביעה מוגברים באופן משמעותי.
    2. עבור מכתים immunofluorescence, לבצע צביעה בחושך כי הנוגדנים משני הוא רגיש לאור.
  7. לשטוף את נוגדנים משני עם PBST 0.2% 4 פעמים במשך 10 דקות כל אחד.

6. מכתים גרעיני וF- אקטין

הערה: זו מיושמת רק למכתים immunofluorescence.

  1. כתם השחלות עם PBST 0.2% המכיל DAPI (2 ng / μl) וPhalloidin-TRITC (100 ננומטר) לשעה 2 ב RT בחושך.
  2. לשטוף השחלות עם PBST 0.2% 4 פעמים במשך 10 דקות כל אחד.
  3. דגירה השחלות עם O ההרכבה הבינוני / N ב 4 ° C עם רעד קל.

7. איתותים פיתוח

הערה: זו מיושמת רק לצביעת chromogenic.

  1. הכן של 100 μlמגיב avidin ביוטין-מורכב (ABC) לשיפור האותות על ידי הוספת 1 μl של מגיב (avidin) בμl 98 של PBST 0.2%, ערבוב ביסודיות באמצעות pipetting העדין, והוספת 1 μl של מגיב B (ביוטין מצומדות עם peroxidase חזרת ), ואחריו ערבוב מיידי. דגירה את התערובת למשך 30 דקות ב RT עם רעד קל.
  2. דגירה השחלות (כולל תאי ביצה משויך) בתערובת של חומרים כימיים ו- B במשך 30 דקות ב RT עם רעד קל.
  3. לשטוף את התערובת של חומרים כימיים ו- B עם PBST 0.2% 4 פעמים במשך 10 דקות כל אחד.
  4. העבר את השחלות שקועות בPBST לטוב על צלחת המקום עם טפטפתי פלסטיק.
  5. הכן פתרון מצע של 3,3'-diaminobenzidine (DAB): לפזר לוח DAB אחד ועוד אחד אחרת מי מכיל אוריאה מימן ב 1 מיליליטר של DDH 2 O באמצעות vortexing הנמרץ דקות 1.
    הערה: DAB, מצע מזרז של peroxidase, הוא אַב צֶבַע פופולרי עבור immunostaining. היא מייצרת brמשקע שלו ולא מסיס לאחר שמתחמצן על ידי peroxidase. ניתן לשפר אותות חלשים על ידי הוספת כלוריד ניקל לפתרון המצע (ריכוז סופי 0.05-.08%).
  6. הסר את פתרון PBST שנותר בבאר ולמלא עם פתרון מצע DAB לפיתוח אות 100 μl.
  7. צג עוצמת האותות תחת מיקרוסקופ סטריאו בהגדלה נמוכה.
  8. עצור תגובות על ידי הסרת פתרון DAB, ואחרי מילוי עם 1x PBS באופן מיידי. חזור על לשטוף פעמיים.
  9. העבר את השחלות חזרה לצינור 1.5 מיליליטר ולאחר מכן לשטוף עם 1x PBS או PBST פעמיים במשך 15 דקות כל אחד.
  10. דגירה השחלות בהרכבה בינונית מבוסס גליצרול O (70% גליצרול) / N ב 4 ° C עם רעד קל.

8. הרכבה עוברים בכנימות

הערה: העובי של עוברי כנימה משתנה בין שלבי התפתחות. אסטרטגיות ההרכבה ובכך שונה כדי להתאים מוקדם (germaria ושלבים 0-10), אמצע (שלבים11-18), ומאוחר עוברים (שלבים 19-20), שהם הפגינו באיור 2 - D. בימוי עובריים ואחרי מיורה et al. 12

  1. העבר את השחלות יחד עם הרכבה בינונית למגש התא עם טפטפתי פלסטיק ולבחון דגימות תחת מיקרוסקופ סטריאו בהגדלה נמוכה.
  2. חותך את calyces קשור עם oviduct לרוחב באמצעות סיכות חרקים ולאחר מכן להעביר ovariole מבודד לכוס ריקה גם עם טפטפתי. מרכיבים את הנפח הסופי 50-100 μl באמצעות הרכבה בינונית.
  3. העבר את ovariole לשקופית עם טפטפתי זכוכית ולאחר מכן לנתח תאי ביצה באמצעות סיכות חרקים.
    הערה: לעוברים מבוגרים משלב 6 של פיתוח, הפרדת תאי ביצית הציעה; לgermaria ושני תאי הביצה הראשונים צעירים מן השלב 6, הפרדה היא אופציונלית.
  4. להעביר את תא ביצה גזור לשקופית נקייה באמצעות טפטפתי זכוכית.
  5. שים coverslip (גודל: 22 x 22מ"מ) מעל germaria גזור או תאי ביצה (המכיל עובר בשלבי 1-10 של פיתוח) לאט כדי למנוע בועות.
    1. תאי ביצת ההר (המכילים עוברים בשלבי 11-18 פיתוח) בשקופית עם גשר coverslip חד-צדדי ומניחים coverslip אחר (גודל: 18 x 18 מ"מ) בחלק העליון של המדגם.
    2. תאי ביצת ההר (המכילים עוברים מעל גיל 19 שלב של פיתוח) בשקופית עם גשר דו צדדי coverslip ומניחים coverslip אחר (גודל: 18 x 18 מ"מ) בחלק העליון של המדגם.
  6. למלא את החלל מתחת לcoverslip העליון עם תקשורת הרכבה כדי למנוע התייבשות המדגם.
  7. במתינות לגלגל את העובר על ידי הזזה coverslip להשיג את הכיוון הנכון להסתכלות.
  8. לאטום מסביב לקצה של coverslips (כולל coverslips הגשר) עם לק.

ניתוח 9. הדמיה

  1. התערבות ההפרש לעומת זאת תצלום (DIC) תמונות של כל הר עובר עם compouND מיקרוסקופ מצויד באופטיקה דסק"ש ועדשה אובייקטיבית יבשה (10X, 20X, 40X) מחוברת למצלמה. התקן את התוכנה להעברת תמונה בין המצלמה והמחשב באמצעות הוראות יצרן.
  2. לרכוש תחזיות של העוברים שכותרתו fluorescently עם מיקרוסקופ confocal לייזר סריקה 14. עקוב אחר ההוראות של היצרן לצילום, Z-ערימה, ו3D מקרין עם תוכנת הדמיה.
    1. הפעל את השקופית הפוכה, למצוא את המדגם רכוב עם 10X אובייקטיבי, ומקיף את אזור הדגימה עם עט מבוסס משומן בסדר.
      הערה: זה עושה את זיהוי המדגם קל יותר כאשר הוא מחפש את זה דרך יעדים של מיקרוסקופ confocal.
    2. להוסיף טיפה של שמן על החלק העליון של אזור coverslip שהצד נגדי מתויג כמתואר ב9.2.1.
  3. מצא את מישור המוקד ב40X מטרת נפט טבילה ואז לשנות למטרת נפט טבילה 63X. באופן ידני להעביר את השליטה להתמקד בסדר ולעשותwn כדי ללכוד את מישור המוקד הטוב ביותר.
    הערה: להתבוננות פרטים מבניים של germaria ועוברים מוקדמים, אנו ממליצים להשתמש 40X יעדים או אלה עם הגדלה גבוהה יותר.
  4. סרוק את העובר בערוצי עירור שונים ולקבל תמונת Z- מחסנית.
    הערה: לרקמות כנימת אפון, להפחית את עוביו של כל סעיף אופטי עד 1.5 מיקרומטר או פחות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

במחקר זה, ביצענו שלם ההר-immunostaining על עוברים של כנימות מיניות אפונה (איור 1 א). נקבות אלה לייצר צאצאי רביית בתולים וviviparously. נקבת עוברים אלה מתפתחים בתוך תאי ביצה של צינוריות השחלות (ovarioles) (איור 1 ואיור 2 א). לפני מיקרוסקופיה, ovarioles גזור הן מטרות הצביעה; עם זאת, הפרדת תאי ביצה נדרש להתבוננות בעוברים תחת מיקרוסקופ (איור 2 ב - ד).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

זיהינו תנאים אופטימליים קריטיים לimmunostaining המוצלח בכנימת האפונה. Pisum, אורגניזם מודל מתעורר ללימודים הגנומי והתפתחותיים 3,15. תנאים אופטימליים להגדלת חדירות רקמות והפחתת מכתים רקע משופר העצמה וספציפיות של אותות. הם שונים מפרוטוקולים סטנדרטיים לimmunostaining במודלים של בעלי חיים אחרים בצעדים ליצירה נקבוביות בקרום תא וחסימת נוגדן שאינו ספציפי מחייב.

לimmunostaining וכלאה באתר, K ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו אסירי תודה לצ'או-טי טינג (Fly Core בטייוואן) על אספקת הנוגדן החד-שבטי 4D9, ל-Technology Commons (TechComm) של המכללה למדעי החיים NTU למיקרוסקופיה קונפוקלית, ל-Hsiao-Ling Lu על הגהה של כתב היד, ולצ'ן-יו צ'ונג על הסיוע בצילומים. CC מודה במיוחד לצ'ארלס א. קוק על מתן הצעות אסטרטגיות ועל העריכה הביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי משרד המדע והטכנולוגיה (101-2313-B-002-059-MY3 ו-104-2313-B-002-022-MY3 עבור GWL ו-CC), והאוניברסיטה הלאומית של טייוואן (NTU-CESRP 101R4602D3 עבור CC; 103R4000 עבור GWL).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
30% מימן פרקסידאז (H2O2)Sigma-Aldrich18304להלבנת פרוקסידאז אנדוגני של עוברים.
4' 6-דיאמידינו-2-פניל-אינדול דיהידרוכלוריד (DAPI)סיגמא-אולדריץ'D9542לתיוג ה-DNA הדו-גדילי. רעיל. ללבוש כפפות, לחלק לתוך חבילות קטנות ולחמם כדי למזער את החשיפה
4D9 נוגדנים חד שבטיים של עכברים אנטי-מוטבעים/מושחתיםמחקרים התפתחותיים בנק היברידומהAB_528224לתיוג מקטעי העובר המתפתחים.
ApVas1 ארנב נוגדן פוליקלונליהמעבדה שלנוN/Aלתיוג חלבון Vas1 הספציפי לקו הנבט של הכנימה בעוברים. נוגדן זה נוצר על ידי המעבדה שלנו.
סיכות חרקים של אוסטרליץENTOMORAVIAN/Aלהפרדת כל תאי ביצה מהשחלה. מידה 000, אמייל שחור. 
אלבומין בסרום בקר (BSA)סיגמא-אולדריץ'9048-46-8לחסימת קשירה לא ספציפית של נוגדנים.
המצלמה מחוברת למיקרוסקופ מורכבCanonEOS 5Dלצילום עוברי כנימות.
מגש קולורימטרי 8 תאיםKartell Labware357לפיתוח אות הצביעה של עוברי כנימות. קוטר 95 על 57 מ"מ, עומק תא 2 מ"מ.
מיקרוסקופ מורכב עם אופטיקה DICLeica MicrosystemsDMRלצילום עובר כנימות המותקן על השקופיות.
DIG Wash and Block BufferSet Sigma-Aldrich (Roche)11585762001לחסימת קשירה לא ספציפית של נוגדנים. דיללנו את תמיסת החסימה פי 10 ל-1x כמגיב חוסם.
מלקחייםIdeal-tekN/Aלדיסקציה של שחלות מכנימות. חלק יצרן מס' 5: 5 SA. 
טפטפת זכוכיתN/AN/Aלהעברת שחלות של כנימות מלוח החריץ לצינורות. 150 מ"מ אורך כולל ו-5 3/4 אינץ' אורך קצה.
גליצרולסיגמא-אולדריץ'G5516לפינוי עוברי כנימות והרכבה.
גליציןביושופN/Aלחסימת פעילות האנזים של פרוטאינאז K (PK).
עיזים נגד עכבר IgG מצומד Alexa Fluor 488InvitrogenA11017לזיהוי נוגדן ראשוני מעכבר.
עיזים נגד ארנב IgG מצומד Alexa Fluor 633InvitrogenA21072לזיהוי נוגדנים ראשוניים מארנב.
מערבל IntelliELMI ציוד מעבדהRM-2Mלשיפור התגובה היסודית של ריאגנטים עם שחלות.
מיקרוסקופיה קונפוקלית לסריקת לייזרLeica MicrosystemsSP5לצילום עובר כנימות המותקן על השקופיות עם תג פלופרנט.
מתנול בורדיק וג'קסוןAH2304להלבנת פרוקסידאז אנדוגני של עוברים.
שקופיות מיקרוסקופ 10143560 תרמו-מדעילהרכבה של עוברים. קצוות קרקע SUPERFROST, ca./env. 76 x 26 מ"מ.
כיסוי מיקרוסקופ משקפימרינפלד0101030להרכבת עוברים על המגלשות. גודל 18X18 מ"מ. עובי מס' 1 (0.13 עד 0.16 מ"מ)
משקפי כיסוי מיקרוסקופמרינפלד0101050להרכבת עוברים על המגלשות. גודל 22 x 22 מ"מ. עובי מס '1 (0.13 עד 0.16 מ"מ)
נוגדן חד שבטי נגד אלפא טובולין של עכבר (DM1A)סנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-32293לתיוג התפלגות אלפא-טובולין של תאים.
לקN/AN/Aלאיטום הכיסויים על המגלשות.
סרום עיזים רגיל (NGS)Sigma-AldrichG9023לחסימת הקישור הלא ספציפי של נוגדנים.
פרפורמלדהיד (PFA)VWRMK262159לקיבוע שחלות כנימות.
Phalloidin-TRITCSigma-AldrichP1951לתיוג התפלגות F-actin על עוברים.
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)N/AN/Aכתמיסה איזוטונית לשחלות כנימות.
טפטפת פלסטיקN/AN/Aלהעברת שחלות של כנימות מצינור למגש תאים. גודל 3 מ"ל. 
Proteinase KMerck124678ליצירת נקבוביות (ניקוב) על קרום התא והקלה על הגישה של נוגדנים.
לוחית ספוט פיירקסN/AN/Aלדיסקציה ותגובות צבע של שחלות כנימות במיקרוסקופיה. כל חלל בקוטר 22 מ"מ ו  עומק 7 מ"מ.
טבליות SIGMAFAST 3,3'-diaminobenzidine (DAB) סיגמא-אולדריץ'D4168לפיתוח אותות מצעים. נקרא גם סט טבליות מצע DAB peroxidase.
מיקרוסקופ סטריאוLeica MicrosystemsEZ4לדיסקציה ותצפית על שחלות כנימות.
Triton-X 100Sigma-AldrichT8787ליצירת נקבוביות (ניקוב) על קרום התא. 
ערכת VECTASHIELD Elite ABC (ארנב IgG)מעבדות וקטורPK-6101לשיפור האות. כולל נוגדן משני IgG נגד ארנב ביוטיניל, ריאגנטים A ו-B.
מדיום הרכבה VECTASHIELDמעבדות וקטורH1000לפינוי עוברי כנימות והרכבה.

מקורות

  1. Blackman, R. L. Reproduction, cytogenetics and development. Aphids: their biology, natural enemies. Minks, A. K., Harrewijn, P. , Elsevier Press. Amsterdam. 163-195 (1987).
  2. Davis, G. K. Cyclical parthenogenesis and viviparity in aphids as evolutionary novelties. J. Exp. Zool. 318, 448-459 (2012).
  3. The International Aphid Genomics Consortium. Genome sequence of the pea aphid Acyrthosiphon pisum. PLoS Biol. 8 (2), e1000313(2010).
  4. Abzhanov, A., et al. Are we there yet? Tracking the development of new model systems. Trends Genet. 24 (7), 353-360 (2008).
  5. Chang, C., et al. Apvasa marks germ-cell migration in the parthenogenetic pea aphid Acyrthosiphon pisum (Hemiptera: Aphidoidea)). Dev. Genes Evol. 217 (4), 275-287 (2007).
  6. Chang, C., et al. Whole-mount identification of gene transcripts in aphids: Protocols and evaluation of probe accessibility. Arch. Insect Biochem. 68 (4), 186-196 (2008).
  7. Chung, C. Y., Cook, C. E., Lin, G. W., Huang, T. Y., Chang, C. Reliable protocols for whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) in the pea aphid Acyrthosiphon pisum: a comprehensive survey and analysis. Insect Sci. 21 (3), 265-277 (2014).
  8. Mutti, N. S., Park, Y., Reese, J. C., Reeck, G. R. RNAi knockdown of a salivary transcript leading to lethality in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum. J. Insect Sci. 6, 38(2006).
  9. Jaubert-Possamai, S., et al. Gene knockdown by RNAi in the pea aphid Acyrthosiphon pisum. BMC Biotechnol. 7, 63(2007).
  10. Sapountzis, P., et al. New insight into the RNA interference response against cathepsin-L gene in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum: Molting or gut phenotypes specifically induced by injection or feeding treatments. Insect Biochem. Mol. Biol. 51, 20-32 (2014).
  11. Braendle, C., et al. Developmental origin and evolution of bacteriocytes in the aphid-Buchnera symbiosis. PLoS Biol. 1 (1), e21(2003).
  12. Miura, T., et al. A comparison of parthenogenetic and sexual embryogenesis of the pea aphid Acyrthosiphon pisum (Hemiptera: Aphidoidea). J. Exp. Zool. 295 (1), 59-81 (2003).
  13. Chang, C., Lee, W. C., Cook, C. E., Lin, G. W., Chang, T. Germ-plasm specification and germline development in the parthenogenetic pea aphid Acyrthosiphon pisum: Vasa and Nanos as markers. Int. J. Dev. Biol. 50 (4), 413-421 (2006).
  14. Koshy, A. A., Cabral, C. M. 3-D imaging and analysis of neurons infected in vivo with Toxoplasma gondii. J. Vis. Exp. (94), e52237(2014).
  15. Brisson, J. A., Stern, D. L. The pea aphid, Acyrthosiphon pisum: an emerging genomic model system for ecological, developmental and evolutionary studies. Bioessays. 28 (7), 747-755 (2006).
  16. Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
  17. Harland, R. M. In-situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Method. Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
  18. Wolff, C., Sommer, R., Schroder, R., Glaser, G., Tautz, D. Conserved and divergent expression aspects of the Drosophila segmentation gene hunchback in the short germ band embryo of the flour beetle Tribolium. Development. 121 (12), 4227-4236 (1995).
  19. Jowett, T. Double in situ hybridization techniques in zebrafish. Methods. 23 (4), 345-358 (2001).
  20. Lin, G. W., Cook, C. E., Miura, T., Chang, C. Posterior localization of ApVas1 positions the preformed germ plasm in the sexual oviparous pea aphid Acyrthosiphon pisum. Evodevo. 5, 18(2014).
  21. Straus, W. Inhibition of peroxidase by methanol and by methanol-nitroferricyanide for use in immunoperoxidase procedures. J. Histochem. Cytochem. 19 (11), 682-688 (1971).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Proteinase KDIGOvariole

מאמרים קשורים