מאמר שיטה

רקמת 3D משולב תכנון הנדסי

9.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53885

⸱

6 באפריל 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Tissue Engineering and Regenerative Medicine (TERM), University Hospital Wuerzburg, 2Department of Cardiothoracic Surgery, University Hospital Wuerzburg, 3Department of Bioinformatics, University Wuerzburg, 4Translational Center Wuerzburg, Fraunhofer Institute Interfacial Engineering and Biotechnology IGB

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים מודל תלת מימדי (תלת מימדי) של סרטן ריאות המבוסס על פיגום קולגן ביולוגי כדי לחקור את הרגישות לטיפולים ממוקדי תאים לא קטנים-סרטן-ריאות (NSCLC). אנו מדגימים טכניקות קריאה שונות לקביעת מדד ההתפשטות, האפופטוזיס ומצב המעבר האפיתלי-מזנכימלי (EMT). הנתונים שנאספו משולבים במודל סיליקו לחיזוי רגישות לתרופות.

תקציר

במחקר הנוכחי, שילבנו מודל גידול במבחנת 3D ריאות עם במודל סיליקון כדי לייעל תחזיות תגובת תרופה המבוססת על רקע מוטציה ספציפי. המודל שנוצר על פיגום חזירי decellularized שמעתיק מאפיינים רקמות ספציפיות לגבי הרכב תאי מטריקס ואדריכלות כולל קרום המרתף. קבענו סטנדרט פרוטוקול המאפשר דור רקמת גידול מלאכותי תוך 14 ימים, כולל שלושה ימים של טיפול תרופתי. המאמר שלנו מספק כמה תיאורים מפורטים של 3D לקריאה החוצה טכניקות הקרנה כמו הקביעה של מכתים Ki67 מדד התפשטות, אפופטוזיס מן supernatants ידי M30-ELISA והערכת אפיתל מעבר mesenchymal (EMT), אשר הם כלים שימושיים עבור הערכה האפקטיבית תרכובות טיפוליות. נוכל להראות לעומת תרבות 2D הפחתה של התפשטות במודל הגידול 3D שלנו כי הוא relatאד למצב הקליני. למרות התפשטות נמוכה זה, המודל ניבא EGFR תגובות סמי -targeted כראוי בהתאם למצב הסמן הביולוגי, כפי שמוצג על ידי השוואה של שורות תאי סרטן הריאות HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) ו- A549 (wild-type EGFR, KRAS - מוטציה) שטופלו במעכבי קינאז-טירוזין (gefitinib TKI). כדי לחקור תגובות תרופה של תאים סרטניים מתקדמים יותר, אנו מושרה EMT על ידי טיפול ארוך טווח עם TGF-beta-1 לפי הערכת vimentin / פאן-cytokeratin מכתים immunofluorescence. A-bioreactor תזרים הועסק להתאים תרבות לתנאים פיסיולוגיים, אשר שפרו דור רקמות. יתר על כן, אנו מציגים שילוב של תגובות התרופה על טיפול gefitinib או גירוי TGF-beta-1 - אפופטוזיס, מדד התפשטות EMT - לתוך בוליאני במודל סיליקון. בנוסף, אנו מסבירים כיצד תגובות תרופה של תאים סרטניים עם רקע מוטציה ספציפי וספירהerstrategies כנגד התנגדות ניתן לחזות. אנו בטוחים כי 3D שלנו בגישה במבחנה במיוחד עם צמיחתה סיליקון מספק ערך מוסף עבור בדיקות סמים פרה-קליניות בתנאים מציאותיים יותר מאשר תרבית תאי 2D.

מבוא

תעשיית התרופות ניצבת בפני שיעורי תשה גבוהים של עד 95% בתחום הטיפול בסרטן בשלב הקליני גרימת עלויות עצומות 1-5. אחת הסיבות לגירעון זה היא העובדה כי כיום יעילות של תרכובות חדשות הפוטנציאל נבחנת בהקרנות בקנה מידה גדול על תרביות תאים 2D של שורות תאים סרטניים או במודלים של בעלי חיים. במודלים של בעלי החיים יש מורכבות גבוהות אבל יש הבדלים מכריעים בין עכברים ואנשים 6,7. בעשור האחרון, מודלים סרטן 3D באמצעות גישות שונות נוצרו כדי לגשר על הפער בין תרבות 2D של שורות תאים סרטניים מתחם 6,8,9 הגידול vivo. ההשפעה של סביבת 3D על התמיינות תאים וגם על איתות הוכחה במספר מחקרים שנים (למשל., על ידי מינה ביסל) 10,11. היום, מודלים 3D תרבית תאים רבים זמינים כתרביות אליפטית, הידרוג או שבבי microfluidic 12-16. למרות thesמודלי דואר לשפר מורכבים לעומת מערכות תרבות 2D קונבנציונליות, הוא בעיקר חסר microenvironment רקמות כי הוא ידוע כבעל השפעות תומכות גידול וגם יעילות תרופה משפיעה.

כדי לטפל בבעיה זו, יצרנו מודל הגידול 3D מבוסס על פיגום ביולוגי הנקרא SISmuc (קטן-המעי-submucosa + רירית) כי נגזר מְעִי צָם חזירי decellularized. ובכך, ארכיטקטורת רקמות מרכיבים חשובים של ECM כגון collagens השונה, כמו גם את מבנה הקרום במרתף נשמרות 17. תכונה ייחודית זו היא קריטית עבור דור מודל גידול של קרצינומות העולות epithelia ומהווים כ -80% של גידולים מוצקים. יתר על כן, קצב התפשטות במודל גידול רקמות מהונדסות שלנו מצטמצם לעומת שיעור גבוה באופן מלאכותי מושגת בתרבות 2D. כמו התפשטות הוא פרמטר חשוב בהערכת יעילות התרופה, בדיקות סמים מופעלת במודל שלנו יותר דומהתנאי in vivo גידולי 17.

על מנת להעריך את הפוטנציאל של המודל שלנו לחזות יעילות התרופה תלויי סמן ביולוגי כראוי, אנחנו כאן מוצגים נתונים עבור שתי שורות תאים שונות ריאות סרטן שונים במעמד -biomarker EGFR שלהם. מצב מוטציוני זו החל שייקבע באופן שיגרתי בחולי NSCLC. טיפולים ממוקדים עם TKIs כגון EGFR -inhibitor gefitinib נגד גידולים הנושאים תוצאות טובות יותר צג מוטציה ב- EGFR הפעיל בהשוואה לאלו עם כימותרפיה על בסיס פלטינה 18-21.

הקמנו כמה טכניקות לקריאה החוצה שרלוונטיות להערכת יעילות מתחמת. יתר על כן, לאחר גירוי TGF-beta-1 אנו מסוגלים לחקור פעולות מתחמות בתאי גידול שהחלו בתהליך EMT, אשר נחשב צעד חשוב שינוי ממאיר 22,23 ואשר מחובר סמים ההתנגדce 24.

מודל גידול 3D לאפשר ניטור תגובות תא ספציפי לטיפולים ממוקדים, כימותרפיה, או שילובי תרופות עם ניגודים טובים. כדי לשפר עוד יותר ולהאיץ הקרנת סמים להיתקל בהתנגדות, זה הוא השלים ידי סימולציה סיליקון. בהתבסס על כמה ניסויים, תגובת הגידול ניתן לחזות ב סיליקו לגבי התוצאות עבור מגוון רחב של תרופות ושילובים שלהם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

דו מימדי 1. (2D) תרבית תאים

  1. מסחרי להשיג קו תאים סרטניים HCC827 (DSMZ). תרבות הקו הסלולרי אדנוקרצינומה ריאות HCC827 (EGFR מוטנטי, wild-type KRAS) ב RPMI-1640 השלימו עם 20% FCS. שנה בינונית כל 2 - 3 ימים. פיצול התאים פעמיים בשבוע. תאים משמשים עד חלוף 20 הוא הגיע.
  2. מסחרית להשיג A549 קו תאים סרטניים (DSMZ). תרבות A549 שורת תאי ריאות קרצינומה (wild-type EGFR, KRAS מוטציה) ב RPMI-1640 בתוספת 10% FCS. בצעו את התרבות כאמור לעיל. תאים משמשים עד חלוף 20 הוא הגיע.
  3. בדוק את התאים באופן קבוע (כל 4 - 6 שבועות) עבור זיהומים כגון זיהומי mycoplasma.
  4. Culturing תאים A549 או HCC827 על coverslips זכוכית
    1. מקום 1 coverslip זכוכית סטרילית היטב בכל צלחת 24 גם באמצעות פינצטה.
    2. זרע 50,000 תאים סרטניים של שני שורות תאים בנפח של 500 μl בבארות עםהזכוכית coverslips, בהתאמה.
    3. תאי התרבות עד שהם מגיעים confluency של 70% בתנאי תרבות סטנדרטיים (37 ° C; 5% CO 2). במהלך תקופה זו, לשאוב את המדיום הישן בעזרת פיפטה פסטר ולהוסיף 500 μl בינוני טרי כל 2 - 3 ימים של תרבות.

2. דור של מערכות בדיקת גידול על פיגום קולגן ביולוגי

  1. תנאי תרבות סטטי
    1. צור את קטן המעי-submucosa + רירית decellularized (SISmuc) ולתקן אותה בין שתי טבעות מתכת, כתרי תא שנקראו, כמתואר בפרסום קודם 25.
    2. זרע 100,000 תאים מהאחד HCC827 או תאי A549 בנפח כולל של 500 μl על הצד של לומן לשעבר של המעי קבוע כתרי תא.
    3. אפשר תאים סרטניים לדבוק עבור שעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. הוסף 1 מ"ל בינוני בתוך הכתר התא 1 מ"ל בחוץ.
    4. תרבות הגידולמודל בתנאים סטטי על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 בחממה במשך 14 ימים. שנה בינונית תרבות כל 2 - 3 ימים. לכן, לשאוב את המדיום בעזרת פיפטה פסטר פיפטה 1 מ"ל טרי RPMI עם כמות מתאימה של FCS (A549: 10%, HCC827: 20%) בתוך הכתר התא 1.5 מ"ל של אותו מדיום בחוץ.
  2. תנאי התרבות דינמי
    1. הגדר את מערכת בדיקת גידול עם מטריקס decellularized בתוך כתרי תא זריעת תאים כמתואר לפי סעיף קטן 2.1.1 כדי 2.1.3.
    2. תרבות מודל הגידול בתנאים סטטיים 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 בחממה במשך 3 ימים.
    3. להרכיב את bioreactor autoclaved והכנס את SISmuc זרע כפי שפורסם בעבר 25.
    4. פיפטה 45 מ"ל RPMI עם כמות מתאימה של FCS (A549: 10%, HCC827: 20%) לתוך הבקבוק וחברו את המכשיר דגימה ללא מחט למערכת צינורות בין bioreactor ואתבקבוק בינוני.
    5. מניחים את bioreactor בחממה, לחבר אותו המשאבה ותרבות המודל הגידול במשך 14 ימים נוספים עם זרימה בינונית קבועה (3 מ"ל / דקה) על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
    6. שינוי מדיום התרבות השלם לאחר 7 ימים. בשביל זה, להעביר את bioreactor מן החממה מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית. לשאוב את המדיום בבקבוק התקשורת בעזרת פיפטה פסטר. הרם את bioreactor בעוד aspirating להיפטר המדיום במערכת צינורות. בינוני טרי 45 מ"ל פיפטה לתוך הבקבוק. מניחים את bioreactor בחזרה לתוך החממה ולחבר אותו המשאבה.

טיפול 3. דגם גידול סטטי עם gefitinib

  1. תרבות מודל הגידול כמתואר בסעיף 2.1.
  2. באותו יום 11 של תרבות, להכין RPMI / FCS עם 1 gefitinib מיקרומטר (2.5 מ"ל לכל כתר התא). לשאוב את המדיום הישן מבארות בעזרת פיפטה פסטר להוסיף 1 מ"ל של gefitinib RPMI / FCS / מוכן בתוך tהוא כתר תא 1.5 מיליליטר של אותו המדיום בחוץ.
    הערה: פתרון gefitinib המניות המופשרת יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך שבוע אחד.
  3. שינוי המדיום ביום 13 כמתואר לפי סעיף קטן 3.2.

גירוי 4. של דגם גידול סטטי עם בטא TGF-1 עבור אינדוקציה EMT

  1. תרבות מודל הגידול כמתואר בסעיף 2.1.
  2. ביום 3 של תרבות, להכין RPMI / FCS עם 2 ng / ml TGF-beta-1 עם הספק (2.5 מ"ל לכל כתר התא). לשאוב את המדיום הישן מבארות בעזרת פיפטה פסטר להוסיף 1 מ"ל של מוכן RPMI / FCS / TGF-beta-1 בתוך הכתר התא 1.5 מ"ל של אותו מדיום בחוץ. החלף בתוספת בינוני עם בטא TGF-1 כל 2 - 3 ימים עד יום 14, כמתואר תחת 4.2.

5.-outs קרא

  1. לקיחת דגימות עבור מדידות ELISA
    1. קח דגימות מן supernatants של סטטי (סעיף 2.1) ודינמי (סעיף 2.2) תרבות במהלךטיפול עם gefitinib (סעיף 3) ב ימים 11-14 התרבות כמצוין באיור 2. בנוסף, לקחת דגימה לפני הטיפול (T0).
    2. בתנאי תרבות סטטי, לקחת 100 מדגם μl מהחלק הפנימי של כתר התא. בתנאי תרבות דינמיים, להבריג את המזרק בהתקן הדגימה ולקחת 1 מיליליטר בינוני מחוץ למערכת bioreactor. אחסן את כל supernatants שנאספו ב -80 מעלות צלזיוס עד ELISA מתבצע.
  2. M30-ELISA עבור כימות אפופטוזיס
    1. כדי לכמת את אפופטוזיס את supernatants לבצע את assay מוות של תאים על פי הוראות היצרן. אפשר את כל ריאגנטים להגיע RT לפני ביצוע assay.
    2. ריאגנטים כל וורטקס. ממיסים את לוח לשטוף במים deionized טריים מ"ל 500. לדלל המצומד HRP עם 9.2 מ"ל של המצומד דילול מאגר ומערבבים. פיפטה 25 μl של תקן או מדגם לכל טוב.
    3. הוסף 75 μl של בדילול HRP Conjuפתרון שער לכל טוב. מכסים את הצלחת דגירה אותו על שייקר במשך 4 שעות ב RT. לשטוף את הצלחת באופן ידני, 5 פעמים עם 250 μl של פתרון לשטוף מוכן.
    4. הוסף 200 μl של 3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB) המצע היטב כל אחד. דגירה בחושך ב RT במשך 20 דקות. הוסף 50 μl של פתרון להפסיק היטב כל אחד. לנער את microplate במשך 10 שניות ולהשאיר את microplate למשך 5 דקות לפני שתקראו את הסעיף ספיגת. קבע את הספיגה ב 450 ננומטר קורא microplate. חשב את עקומת סטנדרט ועל ריכוזי בדגימות באמצעות תוכנית מתאימה לטיפול נתונים מסוג ELISA כגון מוצא.
  3. מכתים לדוגמא
    1. תיקון, פרפין הטבעה וסעיף הכנת דגם 3D
      1. תקן את SISmuc זורעים באמצעות 2.5 מ"ל paraformaldehyde 4% (PFA) לכל כתר התא עבור שעה 2 ו להטביע אותו לתוך פרפין
      2. כן 3 מיקרומטר סעיפי רקמות מכתימים כפי שפורסם בעבר25.
    2. תיקון של תאים שגודלו בתנאי 2D תרבות
      1. כאשר 70% המפגש הוא הגיע, לשטוף תאים בתרבית על coverslips זכוכית ב 24 גם צלחת אחת עם PBS ולתקן אותם עם 500 μl 4% PFA / היטב במשך 10 דקות.
      2. הסר PFA ולאחסן את coverslips זכוכית בצלחת-מכוסה היטב עם PBS ב 4 ° C עד מתבצע מכתים.
    3. H & E מכתימה
      1. הכתם בסעיפים rehydrated עם Hematoxylin / Eosin בתור מכתים סקירה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.
    4. מכתים Immunofluorescent של דגם 3D
      1. עבור מכתים immunofluorescent, לבצע אחזור אנטיגן על ידי הצבת את השקופיות deparaffinized ו rehydrated לסיר אדים עם חיץ ציטראט שחומם מראש (pH 6.0) במשך 20 דקות.
        הערה: ראה טבלת חומרים והציוד דרוש של להכנה של חיץ ציטראט.
      2. העברת שקופיותלמאגר הכביסה (0.5 M PBS חיץ + 0.5% Tween), סעיפים מעגלים עם עט PAP כדי למזער את הנפח הנדרש עבור פתרונות מכתימים במקום שקופיות בתא לחות.
      3. חסום סעיפי רקמה עם סרום 5% מן המין המארח של נוגדנים משני המשמשים קטנים 5.3.4.6 עבור 20 דקות ב RT.
      4. הסר בסרום חסימת ידי הקשה על השקופיות בעדינות ממחטת נייר ולהחיל את הנוגדן הראשוני בסעיפים כיתרו ב דילול פי הוראה של היצרן (ארנב נגד Ki67 1: 100, vimentin 1 נגד ארנב: 100, אנטי עכבר הפאן cytokeratin 1 : 100). דגירה O / N ב 4 ° C. עבור מכתים כפול, נוגדנים ראשוניים ממינים שונים מארח חייבים לשמש.
      5. בזהירות לשטוף נוגדן מאוגד עם כביסה חיץ שלוש פעמים במשך 5 דקות.
      6. לגילוי של איגודים ספציפיים-נוגדן אנטיגן, להחיל נוגדנים משני הדילול 1: 400 סדר הסעיפים לדגור על RT במשך שעה 1.
      7. לשטוף UNBנוגדן ound עם כביסה חיץ שלוש פעמים במשך 5 דקות.
      8. הר שקופיות עם בתווך מימי המכיל DAPI כדי counterstain גרעינים ולתת להם O / N יבש.
    5. מכתים Immunofluorescent של תאים בתרבית 2D
      1. הסר PBS לכסות את מכסה זכוכית תלושי זורעים עם 0.2% Triton-X100 ב PBS במשך 5 דקות עבור permeabilization. שטוף את מכסה זכוכית תלוש עם כביסת חיץ (0.5 Tween M PBS חיץ + 0.5%) במשך 5 דקות.
      2. בצע שלבים 5.3.4.3 כדי 5.3.4.7. לבצע את כל הפעולות בצלחת היטב על פלטפורמת נדנדה ולהסיר ריאגנטים על ידי היפוך לצלחת.
      3. עבור הרכבה, במקום ירידה של מדיום מימי המכיל DAPI כדי counterstain גרעינים על שקופית זכוכית ללא ציפוי ולהעביר את התלוש לכסות אליו עם התאים מול ההרכבה הבינונית באמצעות מלקחיים. תן לו להתייבש לפני ההדמיה.
  4. קביעת מדד הפצת נשק
    1. בצע immunofluorescentמכתים נגד Ki67 לפי סעיף 5.3.4. או 5.3 5.
    2. קח תמונות הניאון של קטעי רקמה או תאים בתרבית 2D עם מיקרוסקופ הפוכה. השתמש במסננים שונים לקחת תמונות של stainings DAPI ושל Ki67 stainings. עבור כימות, השתמש 10 תמונות סעיפי 3D או 5 תמונות של תרבויות 2D (20X גדלה) של כל תנאים מחלקים שאינם חופף של הדגימה.
    3. לקבוע מספר הגרעינים ומספר הגרעינים חיובי עבור Ki67 ב 2D
      1. רוזן Ki67 גרעינים חיוביים באופן ידני באמצעות דלפק תא תוסף של התוכנה 26 פיג'י. לכן, פתח את התמונה ולחץ על "תוספים" → "לנתח" → "מונה Cell". לחץ "אתחול" ובחר סוג הדלפק. לחץ על כל גרעין Ki67 חיובי. מספר הקליקים מוצג לצד סוג הדלפק שנבחר.
      2. עבור ספירת תאים אוטומטית של המספר הכולל של גרעינים ליצור מאקרו באמצעות פיג'י 27,28. adjust המאקרו עבור כל שורת מכתים התא. בעקבות, לראות דוגמה כיצד ליצור מאקרו.
        1. התחל מאקרו מקליט. פתח דימוי DAPI ולהמיר אותו לפורמט 8 סיבי על ידי לחיצה על "תמונה" → "סוג" → "8-bit". לחץ "שפר ניגודיות", להגדיר 'רווי' כמו "1" ו "לנרמל".
        2. הגדר "טשטש את המסווה" כדי לחדד את התמונה. השתמש 'רדיוס' של "1" ו "מסכה" של "0.60". לחץ על "סף אוטומטי", לבחור שיטה "RenyiEntropy" עם "אובייקטים לבנים על רקע שחור 'כדי binarise התמונה.
        3. לחץ על "התוספים" → "BioVoxxel" → "תכונות לא סדירות קו פרשת מים" עם רדיוס שחיקה "5" להפריד בין התאים. לחץ על "נתח" → "נתח חלקיקים" ולהגדיר את "גודל" כדי "0.02-אינפיניטי".
          הערה: מספר חלקיקים / תאיםמוצג בטבלת הסיכום כמו ספירה.
        4. לחץ על "צור" כדי לשמור מאקרו לניתוח תמונות נוספות.
    4. לקבוע מספר הגרעינים ומספר הגרעינים חיוביים עבור Ki67 ב -3 D באופן ידני כמתואר בסעיף קטן 5.4.3.1.
    5. חישוב המדד התפשטות הממוצע (PI) על פי הנוסחה הבאה:
      figure-protocol-1
      n = מספר התמונות (3D: 10, 2D: 5)

6. בדור סימולציה דגם גידול Silico לריפוי Anti- EGFR בתאי HCC827

  1. דור רשת באמצעות ניתוח תוכנת רשת
    1. להשתמש במסדי נתונים שונים ומוכרים כדי ליצור את רשת הגידול מבוססת על הפרמטרים של ניסוי לקריאה החוצה החשובים ורקע מוטאציות של הקו הסלולרי HCC827.
    2. פתח את תוכנת ניתוח הרשת 21 כדי להמחיש אתרֶשֶׁת.
      1. לחץ על "קובץ" → "חדש" סוג → 'מודלים JoVE_tumor' → ולחץ על "אישור" כדי ליצור רשת חדשה. לחץ על "צפון Closeup כיכר" → "אישור" כדי להמחיש את קולטן קרום כפול. לחץ על "חלבון גנרי" לדמיין צמתים (= חלבונים) כמל → סוג 'EGFR' → ולחץ על "אישור"; חוזר על זה כל צומת ברשת.
      2. לייבל צומת ברשת: קליק ימני → "שינוי צבע & בצורה ..." → לבחור עבור EGFR צמתים (EGF-EGFR) קוד צבע "255,0,0" (צבע אדום); עבור הצמתים c-MET ו- (ג-MET) קוד צבע "0,255,0" (צבע ירוק); עבור קוד צבע gefitinib "255,255,0" (צבע צהוב); עבור קוד צבע PI3K-Inh "204,204,204" (אפור בהיר צבע); עבור קוד צבע MEK-Inh "102,102,102" (אפור כהה צבע); עבור כל צומת האחרים בקוד צבע הרשת בוחר4; 255,255,255 "(צבע לבן).
      3. לחץ "הפנוטיפ" לדמיין הפרמטרים לקריאה בתור משושים → סוג 'התפשטות' → ולחץ על "אישור" → קליק ימני → "שינוי צבע & בצורת ..." → קוד צבע בחר "255,204,204" (סלמון צבע); חוזר על זה אפופטוזיס פרמטר → קוד צבע בוחר "255,51,204" (צבע סגול).
      4. דמיינו קצוות (= אינטראקציות): לחץ על "מעבר למדינה" עבור הפעלות (חיצים), לחץ על "עיכוב" עבור עכבות (חיצים קהים); חוזר זה עבור כל אינטראקציה ברשת.
    3. לחץ על "קובץ" → "שמירה בשם ..." → סוג 'JoVE_tumor models.xml' → לחץ על "שמור" כדי לשמור את רשת איתות שנוצר כפי .xml בפורמט.
  2. בסימולציה Silico באמצעות SQUAD
    הערה: SQUAD מייצג הטופולוגיה דואר רשת כמערכת בוליאני דיסקרטית לוגית (AND, OR, NOT) ומבצעת ניתוח מצב יציב. ניתוח המצב היציב משקף את שיווי המשקל של מערכת ואת האחריות על גירויי איתות (למשל., יישום סמים או מוטציה).
    1. 17 תוכנות SQUAD להרחיב, לחץ על "רשת טען" → העלאה 'JoVE_tumor models.xml' קובץ. לחץ על "ניתוח מפעיל":
      הערה: בשלב הבא, SQUAD חל פונקציה מעריכית לשרבב את הקישוריות לרשת בוליאני, המאפשר סימולציה דינמית של התנהגות הרשת לאורך זמן (עקומות הפעילות סיגמואיד צבעוני).
    2. לחץ על "מתקדם" → "Perturbator" כדי לכתוב פרוטוקול סימולציה. לדמות התנגדות EGFR אנטי: לחץ על "פרוטוקול ערוך"
      1. לחץ "הפרעות" → להשתמש תקן "initialstate = SS-4" (מצב יציב 4) → לחץ על "הוסף" כדי להוסיף "דופק קבוע חדש" → Select פרמטר "המדינה" → היעד בחר "להעיף" → הזמן בחר "0" → ערך בחר "0.4" → לחץ על "אישור".
      2. חזור על פעולה זו: לחץ על "הוסף" → פרמטר בחר "מדינה" → היעד בחר "c-MET" → בחר זמן "0" → ערך בחר "0.4" → לחץ על "אישור"; לחץ על "הוסף" → פרמטר בחר "מדינה" → היעד בחר "gefitinib" → הזמן בחר "0" → ערך בחר "1" → לחץ על "אישור".
      3. גדר ערכי מדינת צומת פעילה (EGF-EGFR): לחץ על "activenode" → לחץ על "ערוך" → מצב בוחר "0.8" → לחץ על "אישור"; עבור כל הצמתים אחרים: לחץ על "ערוך" → בחר מדינה "0" → לחץ על "אישור". לחץ על "אישור" כדי לשמור את הפרוטוקול.
      4. הצגת עקומות ספציפיים: לכו ללוח "אפשרויות" → בחר "(EGF-EGFR)", "* (EGF-EGFR)", "* MEK", "caspases", "(c-MET)", "PI3K", "gefitinib", "אפופטוזיס", "התפשטות", "MEK-Inh" ו "PI3K-Inh" עבור ייצוג גרפי. לחץ על "אתחול" → "הפעל" כדי להתחיל סימולציה מלאה של תגובת המערכת. לחץ על "אפס" על מנת להתחיל סימולציה חדשה.
    3. לדמות PI3K בשילוב וטיפול מעכב MEK: לחץ על "פרוטוקול ערוך"
      1. השתמש באותו פרמטר צומת כמתואר תחת 6.2.2.1 - 6.2.2.3. לחץ "ההפרעות" → לחץ על "הוסף" כדי להוסיף "דופק קבוע חדש" → פרמטר בחר "מדינה" → היעד בחר "PI3K-Inh" → הזמן בחר "0" → ערך בחר "1" → לחץ על "אישור"; לחץ על "הוסף"להוסיף 'דופק קבוע חדש "→ פרמטר בחר" מדינה "→ היעד בחר" MEK-Inh "→ הזמן בחר" 0 "→ ערך בחר" 1 "→ לחץ על" אישור ".
      2. לחץ על "אישור" כדי לשמור את הפרוטוקול. לך ללוח "אפשרויות": השתמש באותו צומת עבור ייצוג גרפי כמתואר תחת 6.2.2.4. לחץ על "אתחול" → "הפעל" כדי להתחיל סימולציה מלאה של תגובת המערכת. לחץ על "אפס" על מנת לסיים את הסימולציה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

על בסיס פיגום SISmuc (איור 2 א ל C), הקמנו פרוטוקול הפעלה סטנדרטי עבור הדור, הגירוי והטיפול של מערכת בדיקת גידול 3D (איור 2 ד). מודל זה מאפשר קביעת מדד התפשטות כימות של אפופטוזיס באמצעות M30-ELISA כפי שמוצג באיור 1 ואיור 3, בהתאמה. איור 3 מראה נציג H & E מכתים של דגמי A549 ו HCC827 ומדידת אפופטוזיס נציג אחד עם gefitinib. המודל המוצג כאן נועד באמצעות הדוגמא של N...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הקמנו בשילוב במבחנה / במערכת מבחן הגידול סיליקון לתחזיות טיפול מונחה סמן ביולוגי. המודל במבחנת מעריכת היבטים חשובים שונים של פעולות תרכובת כגון שינויים של ריבוי תאים סרטניים אפופטוזיס על רקע מוטציה ספציפי שיכול לעבור סימולצית סיליקו 17. כאן, אנו מציגים פרוטוקול סטנדרטי עבור הדור מודל הגידול 3D ובדיקה המתחם כולל כימות של שגשוג אפופטוזיס ואת הקמתה של מידע צופה פני מודל סיליקון. המודל הגידול 3D מבוסס על שורות תאים סרטני...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים אין לי מה לחשוף.

תודות

מחקר זה מומן על ידי המרכז למחקר קליני הבינתחומי (IZKF, BD247 מהענק) של בית החולים האוניברסיטאי של וירצבורג ותכנית Fit באיירן (שהוענקה היקה וואלס).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ביו-ריאקטוריםלהנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית, Wü rzburg (GER)הגדרת Bioreactor
ארגז כלים BioVoxxel (ImageJ / Fiji)יאן ברוכר, תורסטן וגנר, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox
כתריתאים יו"ר הנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית, Wü rzburg (GER)לתרבית תלת מימד סטטית
CellDesignerhttp://www.celldesigner.org/-תוכנה זו שימשה לציור הרשת.
תמיסת מלאי חיץ ציטראט (10x)בייצור42 גרם/ליטר חומצת לימון מונוהידרט, 17.6 גרם/ליטר כדורי נתרן הידרוקסיד במים נטולי יונים, pH 6.0, מאוחסנים ב-RT. 
פתרון עבודה של מאגר ציטראטבייצור10% תמיסת מלאי חיץ ציטראט במים דה-מינרליים, המאוחסנים ב-RT.
חומצת לימון מונוהידראטVWR, דרמשטדט (GER)1002441000המשמש למאגר הציטראט
תלושי כיסויVWR, דרמשטדט (GER)631-1339
DAPI Fluoromount-GTMSouthernBiotech, ברמינגהם (ארה"ב)SBA-0100-20
מסדי נתונים כגון KEGG, HPRD ו-QIAGEN (גנים & Pathways)http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/-מאגרי מידע ידועים שונים שימשו ליצירת טופולוגיית הרשת.
טי שירט נקבה Luer Lug StyleMednet, Mü nster (GER)FTLT-1הגדרת Bioreactor
נקבה סגנון חוט Luer עם משושה 5/16 אינץ' ל-1/4-28 UNF ThreadMednet, Mü nster (GER)SFTLL-J1A הגדרת ביו-ריאקטור
סרום עגל עובריBio& SELL, Feucht (GER)FCS. ADD.0500לא מופעל בחום
GefitinibAbsource Diagnostics GmbH, Mü nchen (GER)S1025-100 מ"ג100 מ"ג תמיסת מלאי עם בקבוק DMSO
Glas (שוט, GER) מסופק עם חיבור צינור glasWeckert, Kitzingen (GER)בהתאמה
Histofix 4% (Paraformaldehyd)קארל רות', קרלסרוהה (GER)P087.1
צימוד צינורMednet, Mü nster (GER)CC-9חממת הקמת ביו-ריאקטור
לביו-ריאקטוריםיו"ר הנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית, Wü rzburg (GER)הגדרת Bioreactor
M30 CytoDeathTM ELISAPeviva, Bromma (SWE)10900
Male Luer טבעת נעילה אינטגרליתMednet, Mü nster (GER)MTLL230-J1Aהגדרת ביו-ריאקטור
תא לחותבהתאמה
עכבר אנטי פאן-ציטוקרטיןסיגמא-אולדריץ', מינכן (GER)   C2562-2MLשיבוט C-11 + PCK-26 + CY-90 + KS-1A3 +M20+A53-B/A2, משמש 1/100 עבור אימונופלואורסצנציה
שסתום ספוג ללא מחטים נקבה LuerMednet, Mü nster (GER)NVFMLLPCהגדרת ביו-ריאקטור, לדגימה, טבעת O מעוקרת גמא
MVQ 10 אדום 37 x 3 מ"מArcus Dichtelemente, Seevetal (GER)21444טבעת O גדולה, הגדרת Bioreactor
טבעת O MVQ 70 אדום 27 x 2.5 מ"מArcus Dichtelemente, Seevetal (GER)19170טבעת O קטנה, הגדרת Bioreactor
עט PAPDako, המבורג (GER)S002
פרפיןקארל רות', קרלסרוהה (גרמניה)6642.6
משאבה פריסטלטיתIsmatec, Wertheim-Mondfeld (GER)מערך ביו-ריאקטור
פוספט חוצץמלח סיגמא-אולדריץ', מינכן (GER)   קלטת צינורות משאבה D8537-6x500 מ"ל
Ismatec, Wertheim (GER)IS 3710הגדרת ביו-ריאקטור
ארנב אנטי Ki67Abcam, קיימברידג' (בריטניה)ab16667Clone SP6, משמש עבור 1/100 עבור IF
ארנב אנטי וימנטיןAbcam, קיימברידג' (בריטניה)ab92547שימש 1/100 עבור IF
RPMI-1640 טכנולוגיות חיים בינוניות, דרמשטדט (GER)61870-044חם ב 37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש
צינור סיליקוןCarl Roth GmbH, קרלסרוהה (GER)HC66.1הגדרת ביו-ריאקטור
נתרן הידרוקסידסיגמא-אולדריץ', Mü nchen (GER)30620-1KG-Rשימש עבור מאגר הציטראט
SQUADhttp://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm-תוכנהזו שימשה לביצוע הסימולציות הכמותיות למחצה.
מסנן אוויר סטרילי, גודל נקבוביות 0.2 ומיקרו; מSartorius Stedium Biotech, Gö ttlingen (GER)16596-HYKהגדרת ביו-ריאקטור
מזרק Luer Lok 5 מ"לBD Biosciences, היידלברג (GER)309649לדגימת ביו-ריאקטור
לוחות בדיקת תרבית רקמות: 6-,          12-, 24-, 96- בארTPP טכנו מוצרי פלסטיק AG, Trasadingen (GER)92006, 92012, 92024, 92048 
גורם גדילה טרנספורמטיבי - בטא 1 (TGF-β 1) עם איתות תא מוביל, פרנקפורט (GER)8915LCתמיסת מלאי במאגר ציטראט סטרילי pH 3.0
Triton X-100Sigma-Aldrich, Mü nchen (GER)X100-1L
Tween-20Sigma-Aldrich, Mü nchen (GER)P7949-500 מ"ללשטיפת מאגר של צביעה אימונופלורסנט
יו"ר ביתי ביתי אישיתאישית

מקורות

  1. Bhattacharjee, Y. Biomedicine Pharma firms push for sharing of cancer trial data. Science. 338, 29(2012).
  2. Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nat Rev Drug Discov. 3, 711-715 (2004).
  3. Arrowsmith, J. Trial watch: Phase II failures: 2008-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 328-329 (2011).
  4. Arrowsmith, J. Trial watch: phase III and submission failures: 2007-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 87(2011).
  5. Arrowsmith, J., Miller, P. Trial watch: phase II and phase III attrition rates 2011-2012. Nat Rev Drug Discov. 12, 569(2013).
  6. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
  7. Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
  8. Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 485-489 (2013).
  9. Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 675-680 (2013).
  10. Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30, 247-255 (2003).
  11. Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochem Cell Biol. 74, 833-851 (1996).
  12. Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. Int J Mol Sci. 16, 5517-5527 (2015).
  13. Kim, J., Tanner, K. Recapitulating the Tumor Ecosystem Along the Metastatic Cascade Using 3D Culture Models. Front Oncol. 5, 170(2015).
  14. Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels - Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92(2015).
  15. Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Sci Transl Med. 7, 283ps9(2015).
  16. Stadler, M., et al. Increased complexity in carcinomas: Analyzing and modeling the interaction of human cancer cells with their microenvironment. Semin Cancer Biol. , (2015).
  17. Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Mol Oncol. 8, 351-365 (2014).
  18. Mok, T. S., et al. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma. N Engl J Med. 361, 947-957 (2009).
  19. Maemondo, M., et al. Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR. N Engl J Med. 362, 2380-2388 (2010).
  20. Rosell, R., et al. Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (EURTAC): a multicentre, open-label, randomised phase 3 trial. Lancet Oncol. 13, 239-246 (2012).
  21. Sequist, L. V., et al. Phase III study of afatinib or cisplatin plus pemetrexed in patients with metastatic lung adenocarcinoma with EGFR mutations. J Clin Oncol. 31, 3327-3334 (2013).
  22. Lee, J. M., Dedhar, S., Kalluri, R., Thompson, E. W. The epithelial-mesenchymal transition: new insights in signaling, development, and disease. J Cell Biol. 172, 973-981 (2006).
  23. Wells, A., Yates, C., Shepard, C. R. E-cadherin as an indicator of mesenchymal to epithelial reverting transitions during the metastatic seeding of disseminated carcinomas. Clin Exp Metastasis. 25, 621-628 (2008).
  24. Janne, P. A., et al. AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372, 1689-1699 (2015).
  25. Moll, C., et al. Tissue engineering of a human 3D in vitro tumor test system. J Vis Exp. , (2013).
  26. Funahashi, A., et al. CellDesigner 3.5: A Versatile Modeling Tool for Biochemical Networks. Proceedings of the IEEE. 96, 1254-1265 (2008).
  27. Auto Threshold(ImageJ)v.v1.15. , Source: http://fiji.sc/Auto_Threshold (2013).
  28. BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji). , Source: http://fiji.sc/BioVoxxel_Toolbox (2015).
  29. Buettner, R., Wolf, J., Thomas, R. K. Lessons learned from lung cancer genomics: the emerging concept of individualized diagnostics and treatment. J Clin Oncol. 31, 1858-1865 (2013).
  30. Engelman, J. A., et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 316, 1039-1043 (2007).
  31. Mukohara, T., et al. Differential effects of gefitinib and cetuximab on non-small-cell lung cancers bearing epidermal growth factor receptor mutations. J Natl Cancer Inst. 97, 1185-1194 (2005).
  32. Noro, R., et al. Gefitinib (IRESSA) sensitive lung cancer cell lines show phosphorylation of Akt without ligand stimulation. BMC Cancer. 6, 277(2006).
  33. Gill, B. J., et al. A synthetic matrix with independently tunable biochemistry and mechanical properties to study epithelial morphogenesis and EMT in a lung adenocarcinoma model. Cancer Res. 72, 6013-6023 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

EGFRGefitinibKi67M30 ELISAIn Silico

מאמרים קשורים