מאמר שיטה

בידוד ובידול של תאי גזע נגזר שומן מרקמות שומן תת עורי בשר חזירים

31K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53886

⸱

31 במרץ 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biotechnology, National Taiwan University, 2Department of Animal Science and Technology, National Taiwan University, 3Department of Surgery, National Taiwan University Hospital and College of Medicine

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר בידוד של תאי גזע שמקורם בשומן חזיר (pADSC) מרקמות שומן תת עוריות עם בחינת מולטיפוטנטיות. ה-pADSC הרב-פוטנטי משמש לתיחום תהליכים של התמיינות אדיפוציטים ולחקר טרנסדיפרנציאציה לשושלות תאים מרובות של מזנכימה מזודרמית או שושלות נוספות של אקטודרם ואנדודרם למחקרים רגנרטיביים.

תקציר

השמנת יתר היא מגיפה עולמית חסרת מעצורים. חשיפת בקרות מולקולריות בהתפתחות רקמת השומן טומנת בחובה הבטחה לטיפול בהשמנת יתר או סוכרת. למרות שהוקמו קווי תאים אדיפוגניים אימורטליים רבים, תאי גזע שמקורם בשומן מחלק כלי הדם הסטרומלי של רקמות שומן לבנות תת עוריות מספקים מערכת תאית אמינה ex vivo הרבה יותר קרובה להתפתחות שומן in vivo. תאי גזע שמקורם בשומן חזיר (pADSC) מבודדים מחזירונים בני 7 עד 9 ימים. מצבור השומן הלבן הגבי של רקמות שומן תת עוריות חזיריות פרוס, טחון וקולגנאז מתעכל. pADSC אלה מציגים פוטנציאל חזק להתמיין לאדיפוציטים. יתר על כן, ל-pADSC יש גם מולטיפוטנטיות, המוערכת על ידי סמנים סלקטיביים של תאי גזע, להתמיין לסוגי תאים מזנכימליים שונים כולל אדיפוציטים, אוסטאוציטים וכונדרוציטים. ניתן להשתמש ב-pADSC אלה להבהרת מתגים מולקולריים בוויסות התמיינות אדיפוציטים קלאסיים או בכיוון לסוגי תאים מזנכימליים אחרים ממקור מזודרמלי. יתר על כן, שושלות מורחבות לתאים ממוצא אקטודרמלי ואנדודרמלי הושגו לאחרונה. לכן, pADSC הנגזר בפרוטוקול זה מספק מקור שופע וניתן להערכה של תאי גזע מזנכימליים בוגרים עם מולטיפוטנטיות מלאה לחקר התפתחות השומן ויישומו בהנדסת רקמות של רפואה רגנרטיבית.

מבוא

השמנה, נוכח כ -30% מהאוכלוסייה בארצות הברית, עם אינדקס מסת גוף מעל 30, התפתחה תופעת 1 בעולם נפוצה. השמנה נוטה להוביל לסיבוכים הקשורים כולל מחלות לב וכלי דם, סוכרת מסוג 2, וסרטן 2-4. לכן, התמודדות עם השמנת יתר מהווה עדיפות חשובה. ההשמנה מתבטאת רחבה מסיבית של רקמות שומן, ומיוחסי צריכת מזון מופרז סגנון חיים בישיבה בחברה מודרנית. לפיכך, פיענוח תקנה תעתיק של adipogenesis ו lipogenesis יכול לקיים הבטחה לטיפול בהשמנת יתר או סוכרת 5.

3T3-L1, 3T3-F442A שורות תאי adipogenic עכבר אחרות יושם ללמוד adipogenesis או lipogenesis במהלך התפתחות רקמת שומן. עם זאת, יש כמה סתירות מנגנוני ויסות בין שורות תאים במבחנה ובבעלי חיים in vivo 6. ראשיים שומן-דרעיתאי גזע ved (ADSC) בשבריר התא וסקולרית-סטרומה ניתן לבודד ישירות שומן לבן מושרה להבדיל. דיפרנציאציה של ADSC לתוך adipocytes ככל הנראה משכפלת את תהליך adipogenesis ו lipogenesis בפיתוח רקמה שומנית in vivo 7.

חזירים הם מודל החיה מתאימה ללימוד adipogenesis ו lipogenesis בפיתוח רקמה שומנית. מחקרים חזירי הקודם שלנו 8-10 להוכיח כי הביטוי של 1c גורם שעתוק מחייבים אלמנט מווסת sterol (SREBP1c), גורם שעתוק חשוב הידוע לווסת שעתוק של synthase חומצות שומן lipogenic, מעוכבת על ידי חומצות שומן רב בלתי רווי (PUFA) בכבד חזירי ורקמות שומן. הביטוי של SREBP1c החזירי ירד ב PUFA in vivo ו במבחנה דומה מינים אחרים כגון בני אדם ועכברים 11-13. מחקרי חזיר אלה במבחנה הם בעיקר diffadipocytes erentiated נגזר ADSC חזירי (pADSC). לכן, תרבית תאים ראשונית זו של pADSC יכול לשמש כדי לשמש כמערכת הסלולר אמין ללמוד פיתוח רקמת שומן או יישומים תאי גזע אחרים.

פרוטוקול

הערה: שיטה זו כבר נקבעה השתמשו במחקר שדווח בעבר 14-17 ממעבדה זו; לאורך זמן המתודולוגיה שונה. ההליך הנוכחי בוצע באמצעות ממוצע של 60 גרם של רקמות שומן התת עורית חזיריות מ חזרזיר אחד (7 עד 9 ימים) עם זריעה על צלחות תרבית רקמת 6 באר. כל הנהלים בוצעו ב RT אלא אם כן צוין אחרת. כל הניסויים בבעלי החיים אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדית השתמש (IACUC) בנשיונל טייוואן האוניברסיטה.

1. הכינו עיכול בינוני

  1. השג רקמות השומן התת עורית מן הצוואר והגב; 40 עד 80 גר 'לכל חזרזיר (7 עד 9 ימים), תלוי בגודל של החזירים. הנה, להשתמש 60 גרם של רקמות השומן התת עורית המתקבל חזיר אחד.
  2. הכן בינוני העיכול: לשקול אבקת collagenase השנייה עם סך של 54,000 יחידות לפזר אותו 90 מ"ל בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM,במשך 60 גרם שומן) בבקבוק סרולוגיות 100 מ"ל (900 יחידות של collagenase / 1.5 מ"ל שומן DMEM / g).
  3. בעדינות להתסיס את מדיום העיכול על שולחן שייקר (100 סל"ד) במשך 15 דקות לפחות לפזר ולאחר מכן לעבור את מדיום העיכול דרך פילטר 0.22 מיקרומטר עיקור. חנות ב 4 ° C לפני השימוש.

2. תת עורי לנתח ברקמות שומן מן החזירים

  1. לעקר את כל הכלים, הזכוכית כלי פלסטיק וחמה כל מדיה ל -37 מעלות לפני השימוש.
  2. להקריב את החזרזיר עם exsanguination ומהממת חשמל או באמצעות שיטה בהתאם לתקנות IACUC המקומיות. בצע לנתיחה בזהירות ומיד לאחר חזירונים מוקרבים.
  3. הנח את החזרזיר על שולחן כירורגית נקי (חזרה כלפי מעלה ובטן למטה). לגלח את השיער מן החזרזיר בחזרה הסרה כל השיער מהצוואר עד הזנב ומשני הצדדים עד קו האמצע.
  4. שפשף את עור הגב של החזיר עם 7.5% povidone-יוד שלוש פעמים (עם שלושה עלובי עצמאיים חדשים) ולאחר מכן לאפשר יוד לשבת על פני השטח של העור למשך כ -10 דקות.
  5. הסר את povidone- יוד עם תרסיסים מרובים של אתנול 70%. השתמש פדי גזה או ניירות רקמה המכילה אתנול 70% כדי לנגב את העור בכיוון אחד, לחזור עד אין צבע ברור של יוד povidone הוא ציין.
  6. השתמש אזמל להפריד את שכבת השומן הגבי חזירי של רקמות השומן התת עורית יחד עם שכבת העור המצורפת מהשרירים כשהוא אוחז את השומן והעור באמצעות מלקחיים.
  7. מייד לטבול את שכבת השומן של רקמות שומן התת עורית עם עור מצורף בכוס מעוקרת (200 מיליליטר) המכילה סרום ללא DMEM.
  8. תרסיס החיצוני של הכוס המכילה את שכבת השומן עם 70% אתנול ו מקום במנדף תרבית תאי זרימה למינרית. מניחים גדול (40 ס"מ x 30 ס"מ) מעוקרות רדיד כיסוי משולשת שכבה בתוך הכובע. [א שכבה משולשת משמשת כדי להבטיח שלמות מתמדת.]
  9. מניחים אתרקמה עם העור כלפי מטה על נייר הכסף לכסות.
  10. חתוך את רקמת השריר הנותרים הנחה של רקמת השומן באמצעות מלקחיים ומספריים כדי למנוע זיהום עם רקמת שריר.
  11. חותכים את השומן לחתיכות מרובעות (~ 7 ס"מ X 7 ס"מ) עם אזמל או מספריים. שים חתיכות אלה של שכבת השומן לתוך מבחנה מעוקרת חדשה (200 מיליליטר) המכילה סרום ללא DMEM.
  12. גדר בעל פרוסה אישית על נייר כסף הכיסוי התאסף עם להב מבצעה פלדת פחמן (איור 1). קח חתיכה אחת של שומן מן המבחנה ולמקם אותו על (שכבת עור על שכבה עליונה ושומן להלן) מבצעה.
  13. פורסים את שכבת השומן של רקמות השומן התת עורית לתוך כ חתיכות עבות 1 מ"מ. פורסים את שכבת השומן מהעור קרוב ככל האפשר, אך להימנע חיתוך העור.
  14. בשר טחון פרוס ברקמות שומן במספריים כמו קנס ככל האפשר.
  15. הוסף בינוני העיכול מסונן המכיל collagenase בבקבוק Erlenmeyer 250 מ"ל או בקבוק סרולוגית עם טחוןברקמות השומן (54,000 יחידות של collagenase / 90 מ"ל DMEM / 60 גרם שומן).
  16. דגירה ו מערבולת הבקבוק Erlenmeyer ב 45 סל"ד ב שייקר מסלולית במשך 90 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, כדי לאפשר collagenase לעכל את הרקמות.
    הערה: בדוק כל 15 עד 30 דקות כדי למנוע יתר מערכת העיכול. תהליך העיכול יושלם אם מדיום העיכול הוא תרחיף ללא גושי רקמות משמעותיים.
  17. הוסף נפח שווה (שווה מדיום העיכול) של מדיום התרבות המכיל DMEM / F12 עם בסרום שור עוברי 10% (FBS) כדי לעצור את עיכול collagenase.

figure-protocol-1
איור 1. מבצעה אישי המשמש לבידוד של pADSC. גזור רקמות שומן מרקמות שומן התת עורית הגבה חזיר מורכבות שכבת השומן עם שכבות עור מצורפות. מבצעה נדרש פורסים את שכבת השומן כ 1 מ"מ עובי עם הימנעות יתרחיתוך לתוך שכבות העור. משמאל לימין: בעל פרוסה, כרית מבצעה, להב מבצעה פחמן פלדה וברגים. להב מבצעה מוכנס בין בעל פרוסת כרית מבצעה כאשר התאספו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

אוסף 3. pADSC מן שבר סטרומה-וסקולרית

  1. לעבור את המדיום העיכול המכיל את רקמות השומן מתעכל דרך שכבה יחידה של שיפון לתוך בקבוק 250 מ"ל Erlenmeyer מעוקר נקי או בקבוק סרולוגיות 250 מ"ל. השתמש במלקחיים כדי לדכא באמצע השיפון כדי להדריך ולסייע חלוף לעכל.
  2. מסננים ולסובב שיפון עם מלקחיים כדי להשלים את המעבר.
  3. פזר מדיום העיכול לתוך צינורות צנטריפוגות חרוטים ארבעה 50 מיליליטר (~ 40 מיליליטר בינוני לכל צינור).
  4. צנטריפוגה ב XG 700 במשך 10 דקות כדי לאסוף את הגלולה של תאי דם סטרומה.
  5. למזוג supernatant מבלי להפריע את הכדורים להסיר ביותר של שכבת השומן העליונה המכילה adipocytes הבוגר. שטפו את הכדור על ידי הוספת DMEM 10 מ"ל לתוך צינור אחד כדי resuspend גלולה עם pipetting ו רעד עדין של הצינור.
  6. צנטריפוגה ב XG 700 במשך 6 דקות. למזוג supernatant.
  7. הוסף 10 מ"ל חיץ ACK תמוגה ולאחר מכן resuspend גלולה ידי pipetting. תן לזה לעמוד 7 דקות (5 עד 10 דקות) ב RT כדי lyse כדוריות דם אדומות בשבריר וסקולרית-סטרומה.
  8. להוסיף כמויות שווות של DMEM (10 מיליליטר) כדי לעצור את התגובה עם רעד עדין של הצינור ואז צנטריפוגות ב XG 700 במשך 10 דקות.
  9. למזוג supernatant, להוסיף 10 מ"ל DMEM לתוך צינור אחד, resuspend גלולה עם pipetting חזר, ו צנטריפוגות ב XG 700 במשך 6 דקות. חזור פעמיים.
  10. אסוף ולהעביר את DMEM (הכולל של DMEM 40 מ"ל מ 4 צינורות המייצגים 60 גרם שומן) עם תאים מושעה דרך מסננת 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל חדש.
  11. Medi פיפטה בעדינותאממ כמה פעמים כדי לערבב היטב aliquot 20 μl של המדיום הסלולרי המכיל מעורבב עם 180 μl של פתרון כחול 0.4% trypan (01:10 דילול) בצינור 1.5 מ"ל Eppendorf חדש.
  12. ספירת התאים עם hemocytometer ואז זרע pADSC בצפיפות של 60,000 תאים / 2 סנטימטר על גודל רצוי של מנת תרבות או צלחת עם מדיום תרבות המכיל DMEM / F12, 10% בסרום שור עוברי (FBS) ו אנטיביוטיקת 1% של פניצילין פתרון B -streptomycin-amphotericin (P / S / A). באופן כללי, זרע pADSC על צלחות תרבית הרקמה 6-גם עבור adipocyte או בידול osteocyte. זרעים pADSC על מנות של 10 ס"מ עבור מכתים סמן פני השטח של תאי גזע או הבידול הכונדרוציטים.
  13. דגירה צלחות או מנות בחממה 37 מעלות צלזיוס באוויר עם 5% CO 2 כדי לאפשר מצורף התא הצלחות.

4. זיהוי Surface בתאי גזע סמנים של pADSC ידי cytometry זרימה

  1. לאחר 24 שעות, להסיר את המדיום לחלוטין, לשטוף הדואר 10 ס"מ צלחת פעמיים עם בופר פוספט (PBS), ותאי הקציר עם 1 מ"ל של 0.25% טריפסין- EDTA במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
  2. לנטרל עם טריפסין-EDTA כמויות שוות של מדיום תרבות (1 מ"ל), לאסוף תאים צינור חרוטי 15 מ"ל חדש, ולאחר מכן צנטריפוגות ב g 400 × 7 דקות.
  3. למזוג supernatant. קר כקרח FCS-חיץ לשטוף שטפו את הכדור פעמיים ב 3 מ"ל (PBS המכיל 10% FBS) מחדש ההשעיה באמצעות ידי pipetting יחד עם צנטריפוגה ב 400 XG במשך 7 דקות.
  4. גלולה, לספור, ולהתאים pADSC עד 10 מ"ל 6 תאים / חיץ קר כקרח FCS-ווש. מקום תאים (100 μl / צינור אחד) לתוך צינורות חרוטי חדשים מרובים של 15 מ"ל ו דגירה צינורות המכילים pADSC ב 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עם נוגדנים נגד CD4a או Phycoerythrin מצומדות (CD4a-PE), CD29-PE, CD31-PE ,-PE CD44, CD45-PE, CD90-PE, MHC I-PE או MHC II-PE עבור מכתים ישיר. עצור את התגובה על ידי שטיפת התאים פעמיים ב 10 מ"ל חיץ FCS-לשטוף יחד עם 400 × גרם centrifugatיון 7 דקות.
  5. תקן ו resuspend התאים חיץ קיבעון (PBS עם FBS 0.01% לבין 1% פורמלדהיד) עבור cytometry הזרימה על פי הוראות היצרן ואת בפרסום הקודם שלנו 18.

בידול 5. pADSC לתוך adipocytes, Osteocytes ו chondrocytes

  1. דיפרנציאציה של pADSC לתוך adipocytes
    1. כן בינוני אינדוקצית adipocyte ובינוני תחזוקת adipocyte
      1. לקבלת בינוני אינדוקציה adipocyte, להכין 1 ליטר של F12 סרום ללא DMEM / (עם אנטיביוטיקה של 1% P / S / A) המכיל את הפעולות הבאות: 1 מ"ל המניות אינסולין (10 מ"ג / מ"ל ​​חיץ HEPES, pH 8), קונצרט כלשהו הסופי = 10 מיקרוגרם / מ"ל; 1 μl מלאה T3 (3,3 ', 5 Triiodo-L-thyronine, 1 מ"מ DMSO), קונצרט כלשהו סופי = 1 ננומטר; 200 μl המניות transferrin (50 מ"ג / O מזוקקים H 2 כפול מ"ל), סופי קונצרט כלשהו = 10 מיקרוגרם / מ"ל; 100 המניות dexamethasone μl (10 מ"מ אתנול), סופי קונצרט כלשהו = 1 מיקרומטר; 100 מניות rosiglitazone μl (10 מ"מ DMSO), קונצרט כלשהו סופי= 1 מיקרומטר.
      2. כן בינוני תחזוקת adipocyte עם אותו התוספות כמדיום האינדוקציה, אבל עם חסרון של dexamethasone.
    2. תהליך בידול עבור adipocytes
      הערה: לאחר זריעת pADSC על 6 צלחות היטב, pADSC יהיה ומחוברות בתוך 72 שעות.
      1. לאחר 3 ימים, להסיר את המדיום לגמרי ואז להוסיף 3 מ"ל של מדיום אינדוקציה adipocyte לבאר כל אחד. החזר את הצלחות אל האינקובטור. זהו יום אפס של בידול.
      2. לאחר 3 ימים, להסיר את המדיום אינדוקציה adipocyte לחלוטין ולהחליף עם 3 מ"ל של מדיום תחזוקה adipocyte כל שלושה ימים. adipocytes הבוגר יהיה בדיל סופנים בכ 9 ימים. למעלה מ -90% של adipocytes הם מובחנים היטב באמצעות פרוטוקול זה. adipocytes אלה מוכנים מכתים O האדום השמן.
  2. דיפרנציאציה של pADSC לתוך osteocytes
    1. כן בינוני אינדוקצית osteocyte: mediu התרבות השלםמ '(DMEM / F12 עם 10% FBS ו -1% P / S / A) המכיל 1 מיקרומטר dexamethasone, 10 מ"מ β-glycerophosphate ו -50 מיקרוגרם / מ"ל ​​ascorbate-2-פוספט.
    2. תהליך בידול עבור osteocytes
      הערה: לאחר זריעת pADSC על 6 צלחות היטב, pADSC יהיה ומחוברות בתוך 72 שעות.
      1. לאחר 3 ימים, להסיר את המדיום לחלוטין ולהוסיף 3 מ"ל של מדיום אינדוקציה osteocyte לבאר כל אחד. החזר את הצלחות אל האינקובטור 37 מעלות צלזיוס. זהו יום אפס של בידול.
      2. החלף בינוני אינדוקציה osteocyte כל שלושה ימים. osteocytes למבוגרים יהווה ידי 14 ימים של בידול. osteocytes אלה מוכנים מכתים S האדום Alizarin.
  3. דיפרנציאציה של pADSC לתוך chondrocytes
    1. הכן בינוני אינדוקציה הכונדרוציטים: αMEM המכילים FBS 1%, 6.25 מיקרוגרם / מ"ל ​​אינסולין, 50 מיקרוגרם / 2-פוספט ascorbate מ"ל, ו -10 ng / ml הפיכת צמיחה-β1 גורם.
    2. תהליך בידול עבור chondrocytes
      1. לאחר זריעת pADSC על תרבות מנות של 10 ס"מ על 24 שעות, להסיר בינוני תרבות לחלוטין לשטוף כלים פעמיים עם PBS.
      2. Trypsinize pADSC עם 1 מ"ל של 0.25% טריפסין- EDTA במשך 5 דקות, ולאחר מכן לנטרל עם המדיום תרבות 1 מ"ל. אסוף, לספור ולהתאים pADSC ב 15 מיליליטר צינורות חרוטים עם צפיפות של 2.5 × 10 5 תאים לכל צינור. השתמש hemocytometer כדי לספור את התאים.
      3. לאחר צנטריפוגה ב g 400 × 7 דקות, לבטל את supernatant מבלי להפריע גלולה ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום אינדוקציה הכונדרוציטים בתוך שפופרת 15 מ"ל. הצינור הוא חזר 37 ° C החממה. זהו יום אפס של בידול.
      4. החלף את מדיום האינדוקציה הכונדרוציטים כל שלושה ימים מבלי להסיר תאים על הקרקעית. chondrocytes למבוגרים יהווה כ 14 ימים. chondrocytes אלה מוכנים מכתים O toluidine הכחול.

6. הכתמה של הבדיל adipocytes, Osteocytes ו chondrocytes

  1. שמן אדום O מכתים עבור adipocytes הבדיל
    1. ביום 9, להסיר בינוני תחזוקת adipocyte צלחות תרבות 6 היטב עם adipocytes בדיל ולאחר מכן לשטוף את הצלחת פעמים עם PBS. [בשלבים הבאים, להוסיף מספיק ריאגנטים המיועדת לכיסוי היטב בכל צלחת 6-היטב.]
    2. תקן adipocytes עם פתרון פורמלין 10% עבור 10 דקות לפחות.
    3. הסר את הפתרון פורמלין 10% ולשטוף את הצלחת פעמיים עם מים מזוקקים פעמיים.
    4. לאחר שתי שטיפות, להוסיף פרופילן גליקול 100% לצלחת התרבות ולתת לעמוד במשך דקות 1.
    5. הסר את גליקול 100% פרופילן ולאחר מכן להוסיף פתרון O האדום השמן (0.5% ב פרופילן גליקול) לצלחת התרבות. תנו להחזיק מעמד לפחות 10 דקות על שייקר נדנדה עם תסיסה עדינה (100 סל"ד).
    6. הסר את פתרון O האדום השמן ולאחר מכן להחליף עם פרופילן גליקול 60%. בואו לעמוד 1 דקות.
    7. הסר את גליקול 60% פרופילן ולאחר מכן לשטוף את הצלחת פעמיים עם דouble-מים מזוקקים.
    8. חלף עם פתרון פורמלין 10%. טיפות השומנים המוכתמות הפנימיות של adipocytes מוכנות לצורך השגחה על ידי מיקרוסקופ אור.
    9. כימות של שמן תאיים האדום O (שלבים אופציונליים להלן): לאחר תצפית מיקרוסקופית, להסיר 10% פתרון בפורמלין לשטוף את הצלחת פעמיים עם מים מזוקקים פעמיים.
    10. מסננים את הצלחת לחלוטין ולהוסיף 500 μl של isopropanol לצלחת 6 באר.
    11. בואו isopropanol לעמוד צלחת 6-היטב על שייקר נדנדה עדינה (100 סל"ד) למשך 10 דקות לפחות כדי לפזר את צבען של O. האדום השמן
    12. לשאוב את isopropanol המכיל שמן האדום O ולהפיץ בצלחת 96-היטב. לכמת את O האדום שמן חילוץ באמצעות קריאה spectrophotometric ב 510 ננומטר.
  2. Alizarin האדום S מכתים עבור osteocytes הבדיל
    1. ביום 14, להסיר בינוני osteocyte אינדוקציה מ 6 צלחות היטב עם osteocytes מבודל לשטוף את הצלחות פעמיים עם PBS. [ב following שלבים, להוסיף מספיק ריאגנטים המיועדת לכיסוי היטב בכל צלחת 6-היטב.]
    2. תקן osteocytes בתמיסת פורמלין 10% עבור 10 דקות לפחות.
    3. הסר את הפתרון פורמלין 10% מכל טוב לשטוף את הצלחת פעמיים עם מים מזוקקים פעמיים.
    4. לאחר שתי שטיפות, ולהוסיף פתרון האדום S 2% Alizarin (pH = 4.1-4.3) לצלחת 6-היטב ולתת לעמוד במשך 15 דקות לפחות על שייקר נדנדה עדין (100 סל"ד).
    5. הסר את הפתרון האדום S Alizarin ולאחר מכן לשטוף את הצלחת פעמיים עם מים מזוקקים פעמיים.
    6. חלף עם פתרון פורמלין 10%. Osteocytes מוכן לצורך השגחה על ידי מיקרוסקופ אור.
  3. Toluidine מכתים כחול O עבור chondrocytes הבדיל
    1. באותו יום 14, בינוני אינדוקציה הכונדרוציטים לשאוב מהצינור חרוטי 15 מ"ל מבלי להסיר משקעים של כונדרוציטים הבדיל בתחתית הצינור ולשטוף את הצינור פעמיים עם PBS. [בשלבים הבאים, להוסיף מספיק ריאגנטים מיועדים Cover chondrocytes בתחתית הצינור או בשקופית סעיף.]
    2. תקן chondrocytes בתמיסת פורמלין 10% עבור 10 דקות לפחות.
    3. הסר את הפתרון פורמלין 10% מהצינור כל ולשטוף את הצינור פעמיים עם מים מזוקקים פעמיים.
    4. לאחר שתי שטיפות, להטביע כדורים במתחם אוקטובר וסעיף עם cryostat בעובי של 5 מיקרומטר.
    5. הכתם את השקופית של סעיפי cryostat עם פתרון הכחול O toluidine (0.1% עם pH 4.1).
    6. הסר פתרון כחול O toluidine ולאחר מכן לשטוף את סעיף פעמיים עם מים מזוקקים פעמיים.
      הערה: chondrocytes בשקופיות מוכנה לצורך השגחה על ידי מיקרוסקופ אור.

תוצאות

PADSC נגזר שומן תת עורי מגבה חזיר היה זורע על צלחות התרבות או מנות שמוצג באיור 2. המורפולוגיה של pADSC נגזר שבר סטרומה-וסקולרית דומה עכבר או ADSC אדם. עשרים וארבע שעות לאחר הזריעה, pADSC subconfluent הם דבקו ויש להם מורפולוגיה פיברובלסטים דמוית מורחב (איור 2 א). PADSC יהפוך ומחובר בתוך 72 שעות והם מוכנים adipocyte או בידול mesenchymal-סוג אחר (איור 2 ב). pADSC להפגין פוטנציאל adipogenic חזק לאחר אינדוקציה כימית adipocytes הבוגרת ניתן לראות לאחר 9 ימים של בידול עם מעל 90% של pADSCs מראה בידול adipogenic (איור 2 ג).

כדי להתמודד עם המאפיינים של pADSC נגזר בפרוטוקול זה, סמני משטח של pADSC הוערכו על ידי cytometry זרימה אנאלייסיס. כפי שניתן לראות בתרשים 3, סמנים משטח עבור בתאי גזע mesenchymal, כולל CD29, CD44, CD90 ו MHC אני (או HLA I), באו לידי ביטוי ביותר. סמנים משטח שלילי, כגון CD4a, CD31, CD45 ו MHC II (או HLA השנייה) היה ניתן להבחין בהן בקושי pADSC נגזר בפרוטוקול (איור 3). תוצאות אלו מראות כי התערוכה pADSC אלה המאפיינים תאי גזע mesenchymal מסוג בלי אנדותל משמעותי או זיהום תאי גזע haematopoietic, כולל אבות מיאלואידית או הלימפה.

כדי להמשיך לאשר pADSC מייצגים בתאי גזע mesenchymal, את multipotency של pADSC נבדק על ידי בידול לתוך adipocytes, osteocytes ו chondrocytes. Osteocytes ו chondrocytes adipocytes, אלו הוכתמו על ידי צבעים ספציפיים, O אדום שמן, S האדום Alizarin, ו toluidine כחול O, בהתאמה (איור 4). נתונים אלו מעידים כי פרוטוקול זה שנוצר pADSC כי שמר multipotency עם מאפיינים מלאים הדומה אבות מסוג mesenchymal.

figure-results-1
איור 2. מורפולוגיה של pADSC מן חזירי בחזרה באזור שומן. (א) subconfluent pADSC דבק והרחיבה לאחר זריעת 24 שעות על צלחת תרבות 6 היטב. (ב) pADSC הפך ומחובר לאחר זריעת 72-h על צלחת תרבות 6 היטב. (C) adipocytes למבוגרים נצפו לאחר 9 ימים של בידול adipogenic מ pADSC. תמונות צולמו ב -100 הגדלת x באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-2
זיהוי איור 3. של-תאי גזעמשטח סמנים עבור pADSC. 1 x 10 5 של pADSC היו הגיב עם נוגדנים ספציפיים ונותחו עבור סמנים תא גזע על ידי ניתוח תזרים cytometry. המספרים מציינים את אחוז התאים מוכתם באוכלוסייה (אדום) לעומת שליטה בלא כתם. ציר ה- X מייצג את עוצמת הקרינה היחסית. ציר y מייצג את אוכלוסיית התאים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-3
בידול איור 4. מולטיפוטנטיים של pADSC. Multipotency של pADSC נקבע תוך הבחנה pADSC לתוך (א) adipocytes, (B) osteocytes (C) chondrocytes וכתמי צבע נציג, O אדום שמן, Alizarin האדום S, ו toluidine כחול O, בהתאמה . אמאGES צולמו (א) 100 x, (ב) 200 x, ו- (ג) 100 x הגדלה באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב, בהתאמה. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

דיון

כאן אנו מציגים מערכת הסלולר אמינה ללמוד פיתוח רקמת שומן בתרבות תא ראשונית של pADSC. לעומת שורות תאים הונצח אחרים, שיטה זו מספקת דרך נוחה לבודד כמויות גדולות של תאי גזע mesenchymal למבוגרים באיכות גבוהה כי ניתן להחיל ללמוד תהליכי התמיינות של adipocytes או שושלות mesenchymal אחרים הקשורים לפיתוח חיה in vivo. הצעד השונה הקריטי פרוטוקול זה הוא כי אנו מפיקים pADSC באמצעות חזרזיר בן 7- 9-יום כי זה קל להתמודד עם החזרזיר הקטן לעומת חזירים מבוגרים דומה למינים אחרים 19,20, תשואת multipotency של pADSC פוחת ככל 21 גילי חזיר.

מקורות של תאי גזע אפשריים כוללים תאי גזע עובריים (ESC), תאי גזע מושרים (iPSC), ותאי גזע בוגרים לאחר לידה. האילוץ של ADSC, מסווגים תאי גזע מולטיפוטנטיים בוגרים, היא multipotency של תאי גזע בוגריםלהבדיל שושלות מסתעפות מוגבל בהשוואה יחסית עם ESC או iPSC. עם זאת, סוגיות אתיות לגבי הגזירה של נכסים ESC ו בשעור של iPSC לרסן את היישום של ESC ו iPSC 22,23. לכן, חוקרים רבים התמקדו בתאי גזע בוגרים עם מאמצים לחיזוק pluripotency. המקור הנפוץ ביותר של תאי גזע mesenchymal המבוגרים (MSC), אשר מזה זמן רב למדו, הוא בתאי גזע mesenchymal עצם שמקורם במח 24. עם זאת, מח עצם קציר נחשב הליך כואב יחסית. דאגה נוספת היא שהתשואה של תאי גזע ממח העצם היא סופית. Aspirates מח עצם להניב ממוצע של 6 × 10 6 התאים בעלי הגרעין לכל מ"ל, ו- MSC רק מייצגים 0.001 ל -0.01% מכלל התאים בעלי הגרעין. לאחר ששקל החסרונות הללו, ADSC מוצע כמקור מתבלט פחות להשיג תאי גזע מולטיפוטנטיים 25,26.

מגבלות על השימוש ADSC ב regeneraהרפואה המופרזת תלויה, במידה רבה על תשואת תא ואיכות. לכן, המשמעות של העסקת חזירים לבודדים ADSC בפרוטוקול זה היא להניב כמות גדולה של תאי גזע בוגר באיכות גבוהה. החזיר הוא מודל חיה שימושי מייצג בני אדם בגלל גודל האיבר להשוות ודומה פיזיולוגית וביוכימיים רבים בין המינים 27-30. רכישת hADSC מחברות מסחריות היא יקרה ובמקרים רבים התאים נפלו קורבן למניפולציות, passaged או cryopreserved. רכישת דגימות קליניות בבני אדם היא יחסית קשה בגלל בעיות אתיות וייצור של ADSC מוגבל. אנו שואבים כ 6 x 10 5 hADSC לכל גרם שומן לאחר עיכול collagenase. עם 100 גרם של רקמת שומן חזה נשית (דגימה ממוצעת), סך של 6 x 10 -7 תאים ניתן לקצור. באמצעות עכבר פרט, התשואה היא מצומצם אף יותר. סך של 1 x 10 6 תאים ניתן לקצור מ -0.4 גרם של i העכבר תת עוריתרקמת שומן nguinal משתי הרגליים של עכבר FVB המבוגר (גיל 6-8 שבועות). אולם אחד חזיר פרט (7 עד 9 ימים), סך של 2 x 10 8 תאים ניתן לקצור בקלות מ -60 גרם של רקמה שומנית תת עורית המתקבלת דיפו הגב השומן. PADSC נגזר בפרוטוקול זה יש multipotency מלא mesenchymal מסוג וסמנים תאי גזע mesenchymal המתאים. לכן, pADSC הוא מקור נוח להשיג כמויות גדולות של תאי גזע בוגרים מבלי להתפשר על איכות תאי גזע.

היישום של pADSC אינו מוגבל לפענוח בידול adipocyte כולל adipogenesis ו lipogenesis. לאחרונה, ADSC הפכו מקור פופולרי של תאי גזע בתחום 22,31,32 רפואה רגנרטיבית. לעומת מקורות אחרים של תאי גזע, ADSC לשמור על יתרון ייחודי של להיות נגיש בקלות בשפע, multipotency החזק שלהם הודגם להיות מקור מבטיח טיפול בתאי גזע ודואר רקמותngineering 22,33,34. הנגישות הקלה של רקמת שומן גורמת ADSC אחת הדרכים פולשניות לפחות לקבל אבות multipotent. לאחרונה, אנו הבדיל pADSC לאשכולות גלוקוז-תגובה מפרישי אינסולין, המציין כי pADSC אינם מוגבלים בידול mesenchymal (נתונים שלא פורסמו). אחרים גם הוכחו כי ADSC יכול להיות מובחן לתוך תאים מסוגים רבים שמקורם שכבות ניבטות אחרות כגון hepatocytes endodermal (מ hADSC 35 או pADSC 36) או נוירונים ectodermal (מ hADSC 37 או pADSC 38). לפיכך, pADSC יוכל לשמש עבור תרופת תפוקה גבוהה או הקרנה ביולוגית על ידי הפניית תאי לתהליכי בידול מסתעפים להניב שושלות רצויות. לכן, pADSC נגזר בפרוטוקול זה יש פוטנציאל היישום בטיפול בתאי גזע והשתלת רקמות למחקר רפואה רגנרטיבית.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים מבקשים להביע תודה לכל חברי המעבדה לדיון הנרחב וטכניקה תומכת בפרוטוקול זה. מחקרים אשר נערכו במעבדה נתמכו על ידי מענקי משרד מדע והטכנולוגיה (MOST 103-2314-B-002-126 ורוב 102-2313-B-002-026-MY3) ועל ידי מענקים לשאוף תכנית האוניברסיטה למעלה (104R350144) של האוניברסיטה הלאומית, טייוואן.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנטים
קולגנאז, סוג IIסיגמא-אולדריץ'C6885
DMEM, גלוקוז גבוה, פירובטLife Technologies11995-040
DMEM/F-12, HEPESLife Technologies11330-032
סרום בקר עוברי (FBS) תעשיות ביולוגיות04-001-1   
תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין-אמפוטריצין B (P/S/A)תעשיות ביולוגיות03-033-1לשימוש באנטיביוטיקה ואנטי-פטרייה
&אלפא; MEM, ללא נוקלאוזידים Life Technologies12561-049
מאגר ליזה ACK Life TechnologiesA10492-01
טריפסין-EDTA (0.25%), פנול אדוםLife Technologies25200072
CD4a-PEסיגמא-אולדריץ'SAB4700063
CD29-PEסיגמא-אולדריץ'SAB4700398
CD31-PEסיגמא-אולדריץ'SAB4700467
CD44-PEסיגמא-אולדריץ'SAB4700183
CD45-PEסיגמא-אולדריץ'SAB4700483
CD90-PEסיגמא-אולדריץ'SAB4700686
HLA Class I-PE (MHC I) סיגמא-אולדריץ'SAB4700640
HLA-DR-PE (MHC II) סיגמא-אולדריץ'SAB4700662
אינסולין סיגמא-אולדריץ'I9278
3,3',5-טריודו-L-תירונין (T3)סיגמא-אולדריץ'T6397
טרנספרין סיגמא-אולדריץ'T2036
3-איזובוטיל-1-מתילקסנטין (IBMX)סיגמא-אולדריץ'I7018
דקסמתזון סיגמא-אולדריץ'D4902
רוזיגליטזוןקיימן71740
&בטא;-גליצרופוספט סיגמא-אולדריץ'G9422
2-פוספו-L-חומצה אסקורבית Sigma-Aldrich49752
TGFB1 חלבון אנושי רקומביננטי מו"פ D מערכות 240-B-002
שמן אדום O Sigma-AldrichO0625
Alizarin Red SSigma-AldrichA5533
Toluidine Blue OSigma-Aldrich198161
Name>CompanyCatalog NumberComments
>Equipment
להבי פלדת פחמןתומאס סיינטיפיק6727C18
פלקון 100 ומיקרו; מסננת תאים mקורנינג 352360
פלקון צלחת 6 בארותקורנינג 
353046 פלקון 100 מ"מ  צלחתקורנינג 
353003

מקורות

  1. Farese, R. V., Zechner, R., Newgard, C. B., Walther, T. C. The Problem of Establishing Relationships between Hepatic Steatosis and Hepatic Insulin Resistance. Cell Metab. 15, 570-573 (2012).
  2. Taubes, G. Cancer research. Unraveling the obesity-cancer connection. Science. 335 (28), 30-32 (2012).
  3. Apovian, C. M., Gokce, N. Obesity and cardiovascular disease. Circulation. 125, 1178-1182 (2012).
  4. Glass, C. K., Olefsky, J. M. Inflammation and lipid signaling in the etiology of insulin resistance. Cell Metab. 15, 635-645 (2012).
  5. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. Adipocytes as regulators of energy balance and glucose homeostasis. Nature. 444, 847-853 (2006).
  6. Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4, 263-273 (2006).
  7. Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells. J Vis Exp. , (2013).
  8. Hsu, J. M., Ding, S. T. Effect of polyunsaturated fatty acids on the expression of transcription factor adipocyte determination and differentiation-dependent factor 1 and of lipogenic and fatty acid oxidation enzymes in porcine differentiating adipocytes. Brit J Nutr. 90, 507-513 (2003).
  9. Hsu, J. M., Wang, P. H., Liu, B. H., Ding, S. T. The effect of dietary docosahexaenoic acid on the expression of porcine lipid metabolism-related genes. J Anim Sci. 82, 683-689 (2004).
  10. Liu, B. H., Kuo, C. F., Wang, Y. C., Ding, S. T. Effect of docosahexaenoic acid and arachidonic acid on the expression of adipocyte determination and differentiation-dependent factor 1 in differentiating porcine adipocytes. J Anim Sci. 83, 1516-1525 (2005).
  11. Ou, J. F., et al. Unsaturated fatty acids inhibit transcription of the sterol regulatory element-binding protein-1c (SREBP-1c) gene by antagonizing ligand-dependent activation of the LXR. P Natl Acad Sci USA. 98, 6027-6032 (2001).
  12. Sekiya, M., et al. Polyunsaturated fatty acids ameliorate hepatic steatosis in obese mice by SREBP-1 suppression. Hepatology. 38, 1529-1539 (2003).
  13. Xu, J., Nakamura, M. T., Cho, H. P., Clarke, S. D. Sterol regulatory element binding protein-1 expression is suppressed by dietary polyunsaturated fatty acids - A mechanism for the coordinate suppression of lipogenic genes by polyunsaturated fats. J Biol Chem. 274, 23577-23583 (1999).
  14. Ding, S. T., McNeel, R. L., Mersmann, H. J. Conjugated linoleic acid increases the differentiation of porcine adipocytes in vitro. Nutr Res. 20, 1569-1580 (2000).
  15. Ding, S., Mersmann, H. J. Fatty acids modulate porcine adipocyte differentiation and transcripts for transcription factors and adipocyte-characteristic proteins. J Nutr Biochem. 12, 101-108 (2001).
  16. Liu, L. R., et al. Serum amyloid A induces lipolysis by downregulating perilipin through ERK1/2 and PKA signaling pathways. Obesity (Silver Spring. 19, 2301-2309 (2011).
  17. Chen, Y. J., et al. Docosahexaenoic acid suppresses the expression of FoxO and its target genes. J Nutr Biochem. 23, 1609-1616 (2012).
  18. Lin, Y. Y., et al. Modulation of glucose and lipid metabolism by porcine adiponectin receptor 1-transgenic mesenchymal stromal cells in diet-induced obese mice. Cytotherapy. 15, 971-978 (2013).
  19. Schipper, B. M., Marra, K. G., Zhang, W., Donnenberg, A. D., Rubin, J. P. Regional anatomic and age effects on cell function of human adipose-derived stem cells. Ann Plast Surg. 60, 538-544 (2008).
  20. Efimenko, A., et al. Adipose-Derived Mesenchymal Stromal Cells From Aged Patients With Coronary Artery Disease Keep Mesenchymal Stromal Cell Properties but Exhibit Characteristics of Aging and Have Impaired Angiogenic Potential. Stem Cell Transl Med. 3, 32-41 (2014).
  21. Akanbi, K. A., Brodie, A. E., Suryawan, A., Hu, C. Y. Effect of age on the differentiation of porcine adipose stromal-vascular cells in culture. J Anim Sci. 72, 2828-2835 (1994).
  22. Mizuno, H., Tobita, M., Uysal, A. C. Concise Review: Adipose-Derived Stem Cells as a Novel Tool for Future Regenerative Medicine. Stem Cells. 30, 804-810 (2012).
  23. Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Cir Res. 100, 1249-1260 (2007).
  24. Tobita, M., Orbay, H., Mizuno, H. Adipose-derived Stem Cells: Current Findings and Future Perspectives. Discov Med. 57, 160-170 (2011).
  25. Baer, P. C. Adipose-Derived Stem Cells and Their Potential to Differentiate into the Epithelial Lineage. Stem Cell Dev. 20, 1805-1816 (2011).
  26. Kakudo, N., et al. Adipose-derived regenerative cell (ADRC)enriched fat grafting: optimal cell concentration and effects on grafted fat characteristics. J Transl Med. 11, (2013).
  27. Lunney, J. K. Advances in swine biomedical model genomics. Int J Biol Sci. 3, 179-184 (2007).
  28. Prather, R. S., Lorson, M., Ross, J. W., Whyte, J. J., Walters, E. Genetically Engineered Pig Models for Human Diseases. Annu Rev Anim Biosci. 1, 203-219 (2013).
  29. Vodicka, P., et al. The miniature pig as an animal model in biomedical research. Ann Ny Acad Sci. 1049, 161-171 (2005).
  30. Wolf, E., et al. Transgenic pigs as models for translational biomedical research. Transgenic Res. 20, 1150-1150 (2011).
  31. Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The Potential of Adipose Stem Cells in Regenerative Medicine. Stem Cell Rev Rep. 7, 269-291 (2011).
  32. Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circ Res. 100, 1249-1260 (2007).
  33. Cignarelli, A., et al. Human adipose tissue stem cells: relevance in the pathophysiology of obesity and metabolic diseases and therapeutic applications. Expert Rev Mol Med. 14, (2012).
  34. Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. Adipose tissue stem cells: the great WAT hope. Trends Endocrinol Metab. 23, 270-277 (2012).
  35. Banas, A., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a source of human hepatocytes. Hepatology. 46, 219-228 (2007).
  36. Bruckner, S., et al. A fat option for the pig: hepatocytic differentiated mesenchymal stem cells for translational research. Exp Cell Res. 321, 267-275 (2014).
  37. Anghileri, E., et al. Neuronal Differentiation Potential of Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Dev. 17, 909-916 (2008).
  38. Huang, T. T., He, D. S., Kleiner, G., Kuluz, J. Neuron-like differentiation of adipose-derived stem cells from infant piglets in vitro. J Spinal Cord Med. 30, S35-S40 (2007).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בידוד ובידול של תאי גזע נגזר שומן מרקמות שומן תת עורי בשר חזירים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.