הפרדת immunomagnetic של שומן דיפו ספציפי Sca1<sup&gt; גבוה</sup&gt; בתאי גזע שמקורם שומן (ASCs)

סיכום

אנו מציגים את הטכניקות הנדרשות לבידוד מקטע כלי הדם הסטרומלי (SVF) ממאגרי רקמות שומן מפשעתיים (תת עוריים) ופריגונדלים (קרביים) של עכברים כדי להעריך את ביטוי הגנים והפעילות הקולגנוליטית שלהם. שיטה זו כוללת העשרה של תאי גזע^שמקורם בשומן גבוה Sca1 (ASCs) באמצעות הפרדת תאים אימונומגנטיים.

תקציר

בידוד תאי גזע שמקורם בשומן (ASCs) הוא שיטה חשובה בתחום הביולוגיה של רקמת השומן, אדיפוגנזה ושיפוץ מטריצה חוץ-תאית (ECM). in vivo, סביבה עשירה ב-ECM המורכבת מקולגנים פיברילריים מספקת תמיכה מבנית לרקמות השומן במהלך התקדמות ורגרסיה של השמנת יתר. שיפוץ ECM פיזיולוגי בתיווך מטריצות מטאלופרוטאינאזות (MMPs) ממלא תפקיד מרכזי בוויסות גודל ותפקוד רקמת השומן^1,2. אובדן שיפוץ ECM קולגנוליטי פיזיולוגי עלול להוביל להצטברות מוגזמת של קולגן (פיברוזיס רקמות), חדירת מקרופאגים, ובסופו של דבר, אובדן הומאוסטזיס מטבולי כולל עמידות לאינסולין^3,4. כאשר נצפה שינוי פנוטיפי של רקמת השומן במודלים של עכברים ממוקדי גנים, בידוד ASCs ראשוניים ממאגרי שומן למחקרי מבחנה הוא גישה יעילה להגדרת תפקידו של הגן הספציפי בוויסות תפקודם של ASCs. בהמשך, אנו מגדירים הפרדה אימונומגנטית של ASCs^גבוהים Sca1.

מבוא

תאי גזע אנטיגן 1 (Sca1, או Ly6A / E) זוהה לראשונה כסמן פני התא הביע על ידי תאים hematopoietic ו גזע mesenchymal ^5,6. השבר וסקולרית סטרומה (SVF) של רקמת שומן המתקבלת מאגרי שומן עכבר הוא אוכלוסייה הטרוגנית של תאים הכוללים פיברובלסטים, מקרופאגים, תאי אנדותל של כלי דם, תאים עצביים, ועל ובתאים adipocyte ^7. ובתאי adipocyte, או תאי גזע שמקורם שומן (ASCs) הם תאים שאינם שומנים-לאדן כי מתגוררים מטריקס perivascular עשיר קולגן (ECM) ^8. כ -50% של SVF מורכב ASCs, המאופיינים שלילי השושלת (לין ^-) ו CD29 ^+: CD34 ^+: Sca1 ^{+ 9.} רוב של תאים אלה הם Sca1 ^+: CD24 ^- אבות adipocyte, המסוגלים בידול adipocyte במבחנה; עם זאת, רק חלק קטן של תאים (0.08% של SVF) מהווה Sca1 +: CD24 ⁺ תאים המסוגלים מלא של מתרבים ומבדל לתוך adipocytes בתנאים vivo ב ^9. למרות הסייגים הפוטנציאל של שימוש Sca1 ⁺ SVF ללא אפלית CD24 ⁺ תאי CD24 ^- תאים, לבודד Sca1 ⁺ ASCs מן מחסני שומן באמצעות פרדת תא immunomagnetic היא גישה יעילה ומעשית כדי לקבוע את הפנוטיפ-אוטונומי תא של ובתאים adipocyte העיקרי.

בתחום השמנת יתר וסוכרת, סיסטיק לרקמות ודלקת לשחק תפקיד קריטי בפיתוח ותחזוקה של סוכרת מסוג 2 ^3. לאחרונה, Tokunaga et al. הראה כי תאי ^גבוה Sca1 המבודד מפשעתי (או תת עורית, SQ) ו perigonadal (או קרבי, VIS) מאגרי שומן C57BL6 / J להפגין חתימות גנטיות שונות שיפוץ ECM במבחנה ^10. MMP14 (MT1-MMP), חבר אבטיפוס של-t הממברנהמטלו מטריקס ype (MMP) המשפחה מתווכת בפיתוח שומן לבן (WAT) דרך פעילותה collagenolytic ^1.

דוגמאות של ניסויים שעלולים להתנהל עם התאים מבודדים והעשירו באמצעות הפרוטוקול הבא כוללות תרבות תלת ממדים, מחקרי בידול, מבחני שפלת קולגן, ו- RNA רצף ^10,11. מבחני שפלה צריכים להתנהל עם קולגן חומצת חילוץ כדי להבטיח את השימור של telopeptide ^11,12. הפרוטוקול הבא יהיה להדגים את השיטות לבודדות תאי סטרומה וסקולרית ראשית ממנהל מאגרי שומן שונים ולהעשיר ובתאי adipocyte באמצעות פרדת תא immunomagnetic. תוקפו של מיון התא יוערכו עם זרימת cytometry ובאמצעות באמצעות עכברים Sca1-GFP המבטאים GFP ב Sca1 ⁺ תאים, מונע על ידי האמרגן Sca1 ^13.

פרוטוקול

משפט ואתיקה: אוניברסיטת מישיגן ועדת על השימוש והטיפול של בעלי חיים (UCUCA) ואישר את כל שיטות ופרוטוקולים בהתאם מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (המכון מעבדה בבעלי חיים למחקר, המועצה הלאומית למחקר). עכברים נשמרות ביבר אוניברסיטת מישיגן מקבלים גישה חופשית למזון ומים ושמר על מחזור 12 שעות חושך / אור.

1. הכנות

1. כן תקשורת התרבות העיקרית עם DMEM, 10% FBS, 1x P / S / G ו- 1x אנטיביוטיקה / antifungals. זה ישמש כדי לשמור רקמות לעיכול לפני. מניח מניות aliquot באמבט מים 37 ºC.
2. כן חמישה מיליליטר של תמיסת collagenase Type III ב 5 מג / מיליליטר מומס HBSS (+ Ca, Mg +) עבור כל סוג של כרית שומן מבודדת, עד חמישה עכברים. לדוגמה, כאשר לבודד SQ ו VIS מ גנוטיפ יחיד, לעשות 10 מ"ל, אם סוג-בר SQ מוטנטים VIS, לעשות 20 מ"ל. התאם ל- pH 7.4 ו STEלהרגיז מסנן. Aliquot לתוך צינורות 50 מ"ל. מניחים בצד הרחק מאור.
3. השתמש 70% אתנול לחיטוי בתחום כירורגית. נגב ולכסות עם כרית כחולה. לרסס קצת אתנול על כרית כחולה.
4. השתמש 22 מחטי G כדי להצמיד כרית ספיגה ללוח הקלקר לקצץ במספריים. תרסיס כרית עם אתנול ולאחר מכן להגדיר את הלוח על כרית כחולה ומכסים כרית כחולה אחרת עד תחילת לנתיחה.
5. מלאו שני צינורות 50 מ"ל עם אתנול ומניחים עמדה סמוך בתחום כירורגית. מניח את מספרי מלקחיים של אתנול.
6. מלאו אחר צינור 50 מ"ל עם PBS בתוספת 1x אנטי-אנטי לשטיפה אתנול מחוץ כלים כירורגיים.
7. ב למכסה המנוע, מנות התווית 60 מ"מ לכל סוג רקמה ולמלא עם התקשורת והתרבות חימם עד 37 ºC. מניח את הצלחות סמוכות לאזור כירורגית.

בידוד 2. של תת עורי (SQ) רפידות שומן

1. להרדים עכבר עם ממנת יתר של isoflurane ו pneumothorax.
2. בעדינותלרסס עכבר עם 70% אתנול ושכב פרקדן. הצמד את הכפות אל קאפה עם 22 מחטים G.
3. ביצוע חתך קטן בעור של הבטן התחתונה. החזקת החלק העליון של החתך עם מלקחיים, לקחת את המספריים ולהפריד את העור מפני הצפק.
4. לאחר העור מופרד הצפק מן הבטן אל החזה, לשקף את העור הרחק הצפק לכיוון הראש על ידי ביצוע חתכים לרוחב בעור לאורך צדי הגוף.
5. לשקף את העור שנותר מחזיק את השומן מפשעתי מהגוף להצמיד ללוח עם 22 מחטים G.
6. Switch to מספרי מלקחיים בסדר. תפוס את כרית השומן מפשעתי עם מלקחיים בראשית הצירים ליד הצפק לגזוז בין עור ושומן מפשעתי התקדמות לקראת במפשעה הימנעות זיהום SQ עם העור.
7. מניחים את כרית השומן מפשעתי insolated בצלחת שכותרתו 60 מ"מ.

3. בידוד של הקרביים (VIS) רפידות שומן

1. באופן דומה לשלב 2.5, לחתוך הצפק פתוח לחשוף את רפידות ובמעיים שומן הקרביים.
2. הזז את הבטן משם לכיוון בית החזה.
3. תפוס את כרית השומן VIS בקצה הדיסטלי ולמשוך בעדינות. לנתח את כרית שומן VIS תוך הקפדה שלא לכלול epididymal (או רחם, אם באמצעות נקבת עכברים) רקמות.
4. מקום בצלחת שכותרתו וחזור על שלב 3.3 עבור כרית VIS הנותרים.

4. עיכול Collagenase של רפידות שומן

1. הזז 60 מ"מ צלחות למכסה המנוע בתרבית רקמה ו לשאוב את התקשורת.
2. לרכך את רפידות שומן עם מספריים מעוקל מכן להוסיף לפתרון collagenase. הקפידו לשטוף את המספריים מלקחיים בין סוגי רקמות עם אתנול PBS.
3. Shake ב 300 סל"ד ו -37 ºC עבור 10-20 דקות עד רקמות מתעכלות. מקובל אם כמה חתיכות של SQ עדיין גלויות. זה יטופל בשלב מאוחר יותר.
4. הוסף 25 מ"ל של התקשורת בתרבות לפתרון collagenase לעצור את collagטיפול enase, ו פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים עם טפטף סרולוגיות 10 מיליליטר לפזר את הרקמות המעוכלות.
5. תאי זנים באמצעות מסננת תא 100 מיקרומטר. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב g 300 x.
6. בזהירות למזוג את התקשורת לא להפריע גלולה ולהוסיף 5 מ"ל של מים סטריליים כדי גלולה ו פיפטה בעדינות להשעות תאים. חכה 2 דקות כדי lyse אריתרוציטים.
7. הוסף 25 מ"ל של התקשורת עם תאים FBS ומתח 10% דרך מסננת תא חדש 100 מיקרומטר.
8. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב g 300 x. התקשורת למזוג ו resuspend גלולה ב 1 מ"ל של התקשורת והתרבות.
9. ספירת תאים עם hemocytometer באמצעות 1: 1 trypan כחול.
10. פלייט 1 x 10 ⁶ תאים היטב אחד על צלחת 6 באר.

5. הפרדת Cell מגנטית

1. לאחר כ -4 עד 6 שעות של הידבקות התא, לשטוף תאים פעמיים עם HBSS (-Ca, -Mg). לנתק תאים חסידים באמצעות טריפסין 0.05%. לדלל השעית תא טריפסין חיץ הפרדה 1 מיליליטר ספין עבור5 דקות ב g 300 x.
2. לשאוב supernatant. תאי Resuspend במאגר 500 μl. הסרת aliquot 10 μl ולספור תאים באמצעות hemocytometer.
3. ספין תאים למשך 5 דקות ב 300 x גרם.
4. לשאוב supernatant לחלוטין. תאי Resuspend ב 90 חיץ μl. הוסף 10 μl נוגדן ראשוני נגד Sca1-FITC. מערבבים היטב דגירה במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס בחושך.
5. שטפו תאים עם 1 מ"ל חיץ תאים צנטריפוגות במשך 5 דקות ב g 300 x. הסר supernatant לחלוטין.
6. תאי Resuspend ב 80 חיץ μl. הוסף 20 μl microbeads אנטי FITC. מערבבים היטב דגירה במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס בחושך.
7. שטפו תאים עם 1 מ"ל חיץ תאים צנטריפוגות במשך 5 דקות ב g 300 x.
8. הסר supernatant ו resuspend גלולה במאגר 500 μl.
9. מקום עמודה בעל מגנטית ולשטוף טור עם 500 חיץ μl.
10. הוסף השעית תא לעמודה. הימנע בועות תוך pipetting.
11. אסוף את Sca1 ללא תווית ^{- <}/ Sup> תאים ולשטוף פעמים בטור 3 עם 500 חיץ μl. רק להוסיף למאגר חדש כאשר המאגר ריק. הימנע בועות תוך pipetting.
12. הסר עמודה מבעל מגנטי ומקום לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל.
13. הוסף 1 מ"ל חיץ לעמודה ו elute Sca1 ⁺ על ידי דחיפת הבוכנה המסופק באמצעות המאגר טור.
14. ספין למטה שברי תא במשך 5 דקות ב 300 x ז. תאים Resuspend בתקשורת תרבות 1 מ"ל.
15. הסרת aliquot 10 μl מן השברים שכותרתו ללא תווית ולספור תאים באמצעות hemocytometer.
16. פלייט כל שבריר תא 1 גם צלחת 6 באר.

6. אימות של הפרדת immunomagnetic של ACSs Sca1 ^הגבוה עם cytometry הזרימה

1. יש לשטוף את התאים פעמיים עם HBSS (-Ca, -Mg) ו לנתק תאים באמצעות טריפסין 0.05%.
2. תאי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות. תאים Resuspend בתקשורת תרבות 1 מ"ל ולספור באמצעות hemocytometer.
3. השג> 10 ⁶ תאים 1 מ"ל התקשורת בתרבות צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות.
4. הסר צעד supernatant וחזור 6.3 פעמיים נוספות.
5. תאים Resuspend עם 1 מ"ל של סרום עיזים 2% + 2% BSA ולחסום במשך 30 דקות ב RT.
6. תאי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות.
7. הסר חסימת פתרון.
8. להוסיף עכברוש IgG2a אלקסה פלואוריד 647 (0.25 מיקרוגרם, 1: 400) או אנטי-Sca1 אלקסה פלואוריד 647 (0.25 מיקרוגרם, 1: 400), ב 100 μl של PBS עם 2% נסיוב עז ו -2% BSA + PBS ב 4 ° C במשך 30 דקות בחושך.
9. הוסף 1 מ"ל של קר PBS לתאים. צנטריפוגה XG 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C.
10. הסר צעד supernatant וחזור 6.9 פעמיים נוספות.
11. תאים Resuspend ב 1 מ"ל PBS. Pass השעיות התא דרך מסננת התא 100 מיקרומטר כהכנה ניתוח תזרים cytometric.

תוצאות

העשרה של ASCs ^הגבוהה Sca1 מ רפידות שומן שונות.

תאי סטרומה וסקולרית המבודדים תצוגת שומן SQ פיברובלסטים דמויים, נמתחו צורת תא ללא קשר לרמת ביטוי Sca1 (איור 1 א). מצד השני, VIS (eWAT נגזרת) תאי ^נמוך Sca1 ^גבוה Sca1 להדגים הבדל מובהק בצורת התא שלהם. כמו SQ (iWAT נגזרת) תאים ^גבוהים Sca1, VIS (e...

דיון

בזאת אנו מדגימים את הבידוד והפרדה תא immunomagnetic של ASCs בעכברים מ רפידות שומן שונים והשימוש בהם לניסויים במבחנה. השיטה המוצגת היא יעילה עבור הבידוד המהיר של מספר רב של ASCs Sca1 החיובי, המהווה יתרון על FACS בתיווך מורכב ויקר טכניים הבידוד של ASCs ^9,14. בניגוד FACS, הפרדת תא immunomagnetic אינה מאפשרת את השימוש של אנטיגן המרובה לאיתור אוכלוסיית תא המטרה. אף על פי כן, אם אנטיגן השטח היטב מאופיין, שימוש פרדת immunomagnetic מגדיל את מספר התאים להיות מנותח ללא ה...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
סוג 3 קולגנאז	וורת'ינגטון ביוכימי		LS004182 עיכול רקמות
DMEM	Gibco	11965-092	תרבית גלוקוז גבוהה
בינוני עט/סטרפטוקוקוקוק/גלוטמין (100x)	Gibco	10378-016	אנטיביוטיקה מדיה
אנטי אנטי (100x)	Gibco	15240-062	מדיה אנטי פטרייתית
FBS	Gibco	16000-044
PBS (1x, pH 7.4)	Gibco	10010-023
טריפסין (0.05%)	Gibco	25300-054
מסננת תאים	BD Bioscience	352360	100-μ m מסננת תאים
60 מ"מ צלחות	BD Falcon	353004
מספריים	FST	14001-12
מספריים גדולות	FST	14091-11	קצה עדין ומעוקל
מלקחיים גדולים	FST	11000-12
מלקחיים עדינים	כל ספק
25 גרם 5/8 אינץ' מחטים	BD	305122
מחטים 22 גרם 1.5 אינץ'	BD	305159
צינורות חרוטיים 15 מ"ל	BD Falcon	352097
צינורות חרוטיים 50 מ"ל	BD Falcon	352098
MACS עמודות הפרדה	Miltenyi Biotec	130-042-201
ערכת מיקרו-חרוזים Anti-Sca1 (FITC)	Miltenyi Biotec	130-092-529	FITC-anti-Sca1 1º מיקרו-חרוזים בטן ואנטי FITC 2º Ab
AutoMACS מאגר ריצה	Miltenyi Biotec	130-091-221
מפריד MiniMACS	Miltenyi Biotec	130-042-102
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
רפידות צ'וקס כחולות	פישר	276-12424
רפידות סופגות	פישר	19-165-621
לוח קלקר			השתמש משפופרות 50 מ"ל
70% אתנול
איזופלורן	כל ספק
עכברוש IgG2a Alexa Fluor 647	Invitrogen	R2a21
עכברוש IgG2a נגד עכבר Sca1 Alexa Fluor 647	Invitrogen	MSCA21
R-PE	Invitrogen	R2a04
Rat IgG2a נגד עכבר F4/80 R-PE	Invitrogen	MF48004
צינור תחתון עגול	BD Falcon	352058
HBSS (– Ca, – Mg)	Gibco	14175-095
HBSS (+Ca, +Mg)	Gibco	14025-092	לתמיסת קולגנאז
קולגן מסוג I (2.7 מ"ג/מ"ל בחומצה אצטית 37 מ"מ	הכנה בבית12
10x MEM	Gibco	11430-030
1 M HEPES	Gibco	15630-080
0.34 N NaOH	הכנה בבית
פתקי כיסוי	Corning	2870-22
Alexa Fluor 594 חומצה קרבוקסילית, אסתר סוקסינימידיל, איזומרים מעורבים	Invitrogen	A-20004
0.89 M NaHCO3	Gibco	25080-094