מאמר שיטה

במבחנה פירוק של וירוס שפעת capsids ידי צנטריפוגה שיפוע

DOI:

10.3791/53909

⸱

27 במרץ 2016

 ,  , 
1Institute of Biochemistry, ETH Zurich, 2Department of Biochemistry, University of Zurich, 3Institute for Molecular Health Sciences, ETH Zurich

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פירוק ליבות נגיף שפעת A במהלך כניסת הנגיף לתאי המארח הוא תהליך רב-שלבי. אנו מתארים שיטה במבחנה לניתוח השלבים המוקדמים של הסרת ציפוי נגיפי. בגישה זו, צנטריפוגה בשיפוע מהירות משמשת לניתוח ביוכימי של השלבים המתחילים הסרת ציפוי בתנאים מוגדרים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תהליכים מולקולריים המופעלים על ידי חומצה שולטים מקרוב בכניסת התאים של נגיפים רבים הנכנסים דרך המערכת האנדוציטית. במקרה של נגיף שפעת A (IAV), היתוך הנגיף עם הממברנה האנדוזומלית כמו גם הפירוק שלאחר מכן של הקפסיד הנגיפי, הנקרא ללא ציפוי, נשלט על ידי התנאים היוניים בתוך השלפוחיות האנדוציטיות. קשה לחקור את השלבים המוקדמים במחזור החיים של הנגיף מכיוון שלא ניתן לגשת ישירות לאנדוזומים באופן ניסיוני, מה שיוצר את הצורך בגישה חוץ גופית. כאן אנו מתארים שיטה המבוססת על צנטריפוגה בשיפוע מהירות של ויריונים מטוהרים באמצעות שיפוע גליצרול דו-שכבתי, המאפשר ניתוח של ליבת ה-IAV ויציבותה. השיפוע מכיל חומר ניקוי לא יוני (NP-40) בשכבה התחתונה שלו כדי להסיר את הממברנה הנגיפית על ידי המסה כאשר הנגיף משקע לכיוון הקרקעית. ב-pH ניטרלי, ליבות נגיפיות מגולגלות כמבנים יציבים. ניתן לזהות בבירור את מרכיבי הליבה העיקריים, חלבון מטריצה (M1) והריבונוקלאופרוטאינים הנגיפיים (vRNPs), בשבר הגלולה על ידי SDS-PAGE. הפחתת ה-pH ל-6.0 ומטה בשכבה התחתונה מסירה באופן סלקטיבי את M1 מהגלולה ואחריה שחרור של vRNPs בתנאים חומציים יותר. רצועות חלבון נגיפיות על ג'לים מוכתמים בקומאסי יכולות להיות נתונות לכימות צפוף כדי לנטר מצבי ביניים של פירוק IAV. מלבד pH, ניתן להעריך גורמים אחרים המשפיעים על יציבות הליבה הנגיפית, כגון ריכוז מלח וגורמי הסרת ציפוי נגיפיים משוערים, פשוט על ידי שינוי שכבת הגליצרול המכילה חומר ניקוי בהתאם. יחד, הטכניקה המוצגת מאפשרת ניתוח כמותי וניתן לשחזור של ציפוי ויראלי במבחנה. ניתן ליישם אותו על נגיפים עטופים אחרים שעוברים תהליכי הסרת ציפוי מורכבים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וירוס שפעת A (IAV) הוא וירוס אפוף ושייך למשפחת Orthomyxoviridae. הגנים שלו מקודדים על גנום RNA מפולח, שלילי-השכל חד-גדילים. אצל בני אדם, IAV גורם זיהומים בדרכי נשימה, אשר מתרחשים התפרצויות מגיפה עונתיות ונושאת פוטנציאל המגיפות העולמיות 1. עם קשירת שאריות חומצת sialic על תא מארח המשטח 2, IAV מופנם על ידי אנדוציטוזה clathrin התלוי מסלולים עצמאיים-clathrin 3-8. המילייה חומצי (pH <5.5) ב vacuoles endocytic מפעילה שינוי קונפורמציה מרכזי hemagglutinin גליקופרוטאין ספייק IAV (HA), שתוצאתה היתוך של נגיפי ואת endosomal מאוחר קרום 9. לאחר קפסיד IAV (כאן המכונה גם ויראלי "הליבה") ברח מן endosomes מאוחר (LES), הוא ללא ציפוי ב cytosol ואחריו התחבורה של ribonucleoproteins ויראלי (vRNPs) לתוך הגרעין - O את האתרf וירוס שכפול שעתוק 10-13. לפני הפעלת חומצה של HA בנגיף חווה ירידה הדרגתית pH במערכת endocytic, אשר מספרים ראשוניים הליבה עבור פירוקו לאחר 14-16. בחודש זה "הטרמה" צעד של תעלות יונים M2 בקרום ויראלי לתווך זרם של פרוטונים ו- K +10,14,16. השינוי בריכוז יוני בפנים הווירוס מפריע האינטראקציות להצטבר על ידי חלבון מטריקס ויראלי M1 ואת צרור השמונה vRNP, ומקל IAV uncoating בציטופלסמה הבא קרום היתוך 10,14-17.

ניתוח ישיר וכמותיים של הצעד יחול כבר הקשה על ידי העובדה endosomes קשה לגשת באופן ניסיוני. תהליך הכניסה, יתר על כן, מאוד לא סינכרוני. בנוסף, מבחני סוף נקודות, כגון qRT-PCR של מדידות infectivity או רנ"א נגיפי שוחרר, אינם מספקים תמונה מפורטת על מצב ביוכימי של capsi ויראליד בכל צעד נתון כניסה. בעוד ההפרעות של endosomes ידי siRNA או טיפול תרופתי תרם משמעותית להבנת כניסה IAV 18-20, כיוונון עדין קשה ונוטים תופעות לוואי נוקבים בתוכנית התבגרות אנדוזום תחת פיקוח הדוק.

כדי למנוע בעיות אלה, יש לנו התאמנו שפותח בעבר בפרוטוקול במבחנה מבוסס על שימוש צנטריפוגה שיפוע מהיר 17. בניגוד לניסיונות אחרים 21,22, 23,24, שהתבססו בעיקר על שילובים של מחשוף פרוטאוליטים וטיפול חומר ניקוי ואחריו ניתוח EM, גישה זו אפשרה להם תוצאה לכימות בקלות. צנטריפוגה דרך שכבות צבע שונות מאפשרת החלקיקים לסדימנטציה להיחשף ומגיבים עם שינוי תנאים באופן מבוקר. בפרוטוקול שהוצג, IAV נגזר נוזל allantoic בהיר או חלקיקים נגיפיים מטוהרים שקועים גליצרול דו שכבתישיפוע שבו השכבה התחתונה מכילה את הלא יוניים חומר ניקוי NP-40 (איור 1). כמו הנגיף חודר את השכבה השנייה, המכיל חומר ניקוי, המעטפה שומנים ויראלי גליקופרוטאינים המעטפה הם solubilized בעדינות והשאיר אחריו. הליבה, מורכב משמונה צרור vRNP ומוקף שכבת מטריקס, משקע כמבנה יציב לתוך השבר הגלול. חלבונים הליבה ויראלי, כגון M1 ו- nucleoprotein הקשורים vRNP (NP), יכול להיות מזוהים את הכדור על ידי SDS-PAGE ו Coomassie מכתים. בפרט, תוך ניצול של ג'ל שיפוע הזמין המסחרי מכתימה עם קולואידים רגישות הגבוהה Coomassie 25, מאפשר דיוק וזיהוי גבוהים של כמויות קטנות אפילו של חלבוני ליבה קשורה ויראלי.

זו מגדירה את הבסיס לבדוק האם תנאים שונים כגון pH, ריכוז מלח, וגורם uncoating המשוערת יש השפעות על התנהגות השקיעה של רכיבי ליבת הליבה stabil ity. למטרה זו, רק את השכבה התחתונה, המכיל חומר ניקוי שיפוע גליצרול היא שונה על ידי החדרת הגורם או מצב עניינים. הטכניקה כבר יקרה במיוחד בחקירת ההשפעה שונה ערכי pH וריכוז מלח על שלמות ליבת IAV 16. פעולות ביניים של uncoating IAV יכול להיות במעקב דיסוציאציה כולל של שכבת מטריקס ב- pH חומצי קל (<6.5) ואחריו דיסוציאציה vRNP ב- pH 5.5 והתחתון 16,17 (איור 1). השלב האחרון היה עוד יותר משופר על ידי נוכחות של גבוה K + ריכוז בשכבת גליצרול, המשקף בסביבה endocytic מאוחר 16. לכן, כמו הווירוס ואת הליבה משקעים דרך השיפוע שחווה בסביבה משתנית שתנאים מחקו ב endosomes. התוצאה היתה פירוק הדרגתי של הליבה ויראלי במבחנה, המשלימה התוצאות הנגזרות מבחני ביולוגיה של התא.

t "> השיטה המוצגת כאן אפשרה מהר וניתוח לשחזור ביותר של IAV (X31 ו- A / WSN / 33) ואת IBV (B / Lee / 40) uncoating מופעלות על ידי pH חומצי והגדלת K +16,17 וכן פירוק ליבות paramyxovirus בחשיפה pH בסיסי 17. זה מתקבל על הדעת כי ניתן להתאים את הגישה וירוסים אפוף אחרים כדי להשיג תובנות את התכונות הביוכימיות של המבנה קפסיד ויראלי ופירוק קפסיד במהלך ערך בתא.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת חוצצים ופתרונות במלאי

  1. הכן חיץ MNT (20 MES מ"מ, 30 מ"מ טריס ו 100 mM NaCl) על ידי המסת 470 מ"ג טריס Hydrochloride, 390 מ"ג מימה MES ו 580 מ"ג NaCl ב 80 מ"ל DDH 2 O. התאם את חיץ pH 7.4 ולהביא אותו לנפח סופי של 100 מ"ל עם DDH 2 O.
  2. הכן שלושה פתרונות זהים של 500 חיץ מ"מ MES על ידי המסת מימה MES 9.76 גרם 80 מ"ל DH 2 O כל אחד. התאם את מאגרי 5.8 pH, 5.4, ו -5.0, בהתאמה, על ידי titrating עם NaOH המרוכז. תביאו כל חיץ לנפח סופי של 100 מ"ל עם DH 2 O.
  3. הכן שני פתרונות זהים של 500 מ"מ טריס חיץ ידי המסת 7.88 גרם טריס הידרוכלוריד ב 80 מ"ל DH 2 O כל ולהתאים את ה- pH ל 7.4 ו -6.4, בהתאמה, על ידי titrating עם מרוכזת HCI. תביאו למאגר לנפח סופי של 100 מ"ל עם DH 2 O.
  4. הכן פתרון גליצרול 50% ב DH 2 O ומערבבים היטב עד glycארול הוא מעורב homogenously. סנן את הפתרון באמצעות יחידת מסנן Steritop (0.22 מיקרומטר גודל נקבובי) לתוך בקבוק זכוכית.
  5. כן 10% פתרון NP-40 ו 1 M NaCl ב DH 2 O.
  6. הכן 25x מעכב פרוטאז מרוכז על ידי המסת שתי טבליות ב 4 מ"ל DDH 2 O.

2. הכנת מעברי צבע גליצרול

  1. כן 5 מיליליטר לערבב חומרי ניקוי החיץ מאסטר (300 mM NaCl, 2% NP-40, 2x מרוכז מעכבי פרוטאז) פתרון עבור כל תנאי pH לבדוק (pH 7.4, 6.4, 5.8, 5.4, ו -5.0). לשם כך, לערבב 9 מ"ל של 1 M NaCl, 6 מ"ל של 10% NP-40, 2.4 מ"ל של המניה מעכב פרוטאז 25x, ו- 9 מ"ל DDH 2 0.
  2. עבור כל pH מצב pipet 4.4 מ"ל של מיקס מאסטר לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל.
  3. עבור ערכי ה- pH מעל 5.8 להוסיף 0.6 מ"ל של פתרון המניות בהתאמה מותאם pH 500 מ"מ טריס אל הצינור. עבור 5.8 pH והתחתון להוסיף 0.6 מ"ל של פתרון המניות pH המותאמת בהתאמה 500 מ"מ MES.
  4. הפוך 5מ"ל של תמיסת מאגר המכיל 300 mM NaCl, מעכבי פרוטאז 2x, 60 מ"מ טריס מותאם pH 7.4 ו DDH 2 O. זה ישמש חיץ שיפוע מלא חומר ניקוי חינם.
  5. במידת הצורך, עדין לכוונן את ה- pH של פתרונות pH 7.4, 6.4, 5.8, 5.4, ו -5.0 ידי הוספת פתרונות HCI או NaOH מרוכז, בהתאמה.
  6. הוסף 5 מ"ל של המניה גליצרול 50% עד 5 מ"ל של המכילים חומרי ניקוי וחומרי ניקוי ללא תערובות חיץ וכתוצאה מכך שישה פתרונות גליצרול שונים 25%. בדוק את ערכי ה- pH באמצעות רצועות אינדיקטור pH.
    הערה: במידה pH נמדד שונה באופן משמעותי מן הערך הרצוי, הפתרונות המתאימים צריכים להיות מוכנים שוב.
  7. כן פתרון גליצרול 15% על ידי ערבוב 50% מניות גליצרול עם DH 2 O ב 3: יחס 7.

3. ultracentrifugation של IAV

  1. הוסף 3 פתרון גליצרול מ"ל 15% לתוך צינורות צנטריפוגה אולטרה ברור (13.2 מ"ל, 14 מ"מ x 89 מ"מ) באמצעות מזרק 5 מ"ל ו לביתDLE (21 G, 9 ס"מ). אין להשאיר טיפות על הקיר הפנימי של הצינור, שכן הדבר עלול להפריע את היושרה של השיפוע. חזור על פעולה זו עבור סכום כולל של שישה צינורות צנטריפוגה, אחד עבור כל אחד מחמשת התנאים pH לבדוק ואחד למדגם שליטה.
  2. בזהירות במקום 3.4 מ"ל 25% פתרון גליצרול מתחת לשכבת גליצרול 15% באמצעות מזרק 5 מ"ל ו מחט ארוכה. יש להיזהר שלא לערבב את שתי השכבות. חזור על פעולה זו עבור כל ששת התנאים לבדוק עם פתרונות גליצרול pH המותאמת בהתאמה.
    הערה: עבודת בארון biosafety בכיתה השנייה על הצעדים הבאים.
  3. בעדינות כיסוי הדרגתי גליצרול עם 30 μl בהירים נוזל allantoic המכיל IAV (X31, H3N2) מדולל 1 מיליליטר חיץ MNT (מקביל סביב 20-30 מיקרוגרם של חלבון נגיפי הכולל) עבור כל צבע.
  4. יתרה מנוגדים צינורות ומניחים אותם לתוך הרוטור ultracentrifugation SW41. צנטריפוגה עבור 150 דקות, ב 55,000 XG, ו -12 מעלות צלזיוס.
  5. לאחר צנטריפוגה, בזהירותלהסיר את supernatant, כלומר, הן שכבות גליצרול באמצעות פיפטה פסטר נקייה וכן aspirator. Resuspend גלולה ב 40 μl (1x) חיץ מדגם LDS הלא צמצום. חשוב pipet מעלה ומטה מספר פעמים כדי לפזר את הגלולה לחלוטין. מעבירים את המדגם לתוך צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge.

4. SDS-PAGE של גלולה שברים ו Coomassie מכתים

  1. מחמם את כל הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בשלב זה הדגימות ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס עד שהם מנותחים על ידי SDS-PAGE.
  2. טען 20 μl של כדורי מומס על שיפוע מראש יצוק (4-12%) Bis-טריס ג'ל מיני ולהפעיל עבור שעה 1 ב 200 V ב 1x מגבים SDS הפעלת המאגר.
  3. בצע פתרון קיבעון עם 40% מתנול 10% קרחוני חומצה אצטית DDH 2 O.
  4. דגירה ג'ל בתמיסה קיבעון עבור שעה 1 ו להכתים לילה בצלחת תרבית תאים 15 ס"מ עם נפח מספיק של פתרון Coomassie קולואידים בעוד בעדינותרועד בטמפרטורת החדר.
    הערה: חשוב לסגור את המנה על מנת למנוע אידוי של הפתרון המכתים.
  5. Destain הג'ל DDH 2 O. החזר את DDH 2 O כל 15-20 דקות עד שרקע ג'ל מתבהר. אחסן את הג'ל DDH 2 O על 4 מעלות צלזיוס עד שהוא נסרק כימות הלהקה.
  6. סרוק את הג'ל על ברזולוציה גבוהה ולהשתמש תוכנה זמינה או מחוייט מסחרית עבור כימות של עוצמות להקת חלבון. הפחת את אות רקע מאזור קרוב להקות בהתאמה לנרמל את הערכים הללו ל דגימות בקרת חומר הניקוי ללא (ב- pH 7.4).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כפי שכבר דן, יחול ב endosomes נדרש כדי להבהיר את ליבת IAV uncoating מוסמכת. Protonation של הליבה מחליש אינטראקציה של M1 ו- vRNPs (מורכב של רנ"א הנגיפי, NP, ואת פולימראז המורכב PB1 / PB2 / רש"פ). תהליך זה מופעל כאשר וירוס נכנס חשוף pH של 6.5 (או נמוכים) ב endosomes מוקדם (EES) וממשיך עד נתיכי הווירוס בסביבות 5.0 pH ב Les.

על מנת לחקות את ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

capsids ויראלי הם קומפלקסים macromolecular metastable. בעוד הרכבה של virions מחייבת encapsidation ועיבוי של הגנום הווירוס, ייזום של הסיבוב הבא של זיהום תלוי פירוק מבנה קפסיד קומפקטי זו. וירוסים התפתחו לנצל מנגנונים תאיים שונים כדי לשלוט על מחזור הציפוי-uncoating, כולל קולטני תאים, מלווה, אנזימים פרוטאוליטים, כוחות פיסיים הניתנים על ידי חלבונים מנועים או helicases וכן pH ומתגים יוניים 26,27. כאן, אנו מתארים גישה במבחנה מבוססת על צנטריפוגה שיפוע גליצרול כדי לבדוק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים יוהיי Yamauchi ורוברטה מנצ'יני לספק לנו חומרים כימיים. מעבדת AH נתמכה על ידי רשתות ההדרכה הראשוניות מארי קירי (ITN), מועצת המחקר האירופית (ERC), ועל ידי הקרן הלאומית למדע השויצרי (Sinergia).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
cOmplete™, טבליות מעכבי פרוטאז ללא EDTASigma-Aldrich11873580001ניתן לאחסן את תמיסת המלאי בטמפרטורה של 2 עד 8 מעלות; C למשך 1 עד 2
שבועות חומצה אצטית קרחוניתMerck Millipore100063
גליצרול נטול מים BioChemicaAppliChemA1123
חומצה הידרוכלוריתMerck Millipore100317
מחט הזרקה ארוכה (21  G, 9 ס"מ, משופע או קהה)
MES hydrateSigma-AldrichM8250
מתנולMerck Millipore
Sigma-AldrichI8896זמין כעת מסחרית כ-IGEPAL® CA-630
NuPAGE 4-12% מיני ג'ל ביס-טריס, 10  בארות, 1.0 מ"מLife TechnologiesNP0321
NuPAGE LDS מאגר דגימה (4x)Life TechnologiesNP0008
NuPAGE MOPS SDS מאגר ריצה (20x)Life TechnologiesNP0001
רצועות מחוון pH, pH 4.0-7.0Merck Millipore109542
QC Colloidal Coomassie StainBIO RAD1610803
נתרן כלורידMerck Millipore106406
סודיוםהידרוקסידMerck Millipore106498
יחידת מסנן SteritopMerck MilliporeSCGPT05RE
SW41 Ti, סט רוטור אולטרה-צנטריפוגהBeckman Coulter331336
Thinwall, צינורות צנטריפוגה אולטרה-ברורים, 13.2  מ"ל, 14 מ"מ x 89 מ"מבקמן קולטר344059
טריס הידרוכלוריד AppliChemA1087
X31 נגיף שפעת A (H3N2), נוזל אלנטואי שגדל בביצים, מובהרVirapurהופשר טרי ב-4 מעלות; ג
106009-NP-40

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Taubenberger, J. K., Kash, J. C. Influenza Virus Evolution, Host Adaptation, and Pandemic Formation. Cell host & microbe. 7 (6), 440-451 (2010).
  2. Skehel, J. J., Wiley, D. C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annual review of biochemistry. 69, 531-569 (2000).
  3. de Vries, E., et al. Dissection of the influenza a virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway. PLoS pathogens. 7 (3), e1001329(2011).
  4. Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol. 91 (3 Pt 1), 601-613 (1981).
  5. Patterson, S., Oxford, J. S., Dourmashkin, R. R. Studies on the mechanism of influenza virus entry into cells. J Gen Virol. 43 (1), 223-229 (1979).
  6. Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).
  7. Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. Dissecting virus entry via endocytosis. J Gen Virol. 83 (Pt 7), 1535-1545 (2002).
  8. Yoshimura, A., et al. Infectious Cell Entry Mechanism of Influenza Virus. Journal of Virology. 43 (1), 284-293 (1982).
  9. White, J., Kartenbeck, J., Helenius, A. Membrane-fusion activity of influenza virus. Embo Journal. 1 (2), 217-222 (1982).
  10. Martin, K., Helenius, A. Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: The viral matrix protein (M1) promotes export and inhibits import. Cell. 67 (1), 117-130 (1991).
  11. Palese, P., Shaw, M. L. Chapter 47. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams & Wilkins. 1647-1690 (2006).
  12. Chou, Y. -Y., et al. Colocalization of Different Influenza Viral RNA Segments in the Cytoplasm before Viral Budding as Shown by Single-molecule Sensitivity FISH Analysis. PLoS Pathog. 9 (5), e1003358(2013).
  13. Martin, K., Helenius, A. Transport of incoming influenza virus nucleocapsids into the nucleus. Journal of Virology. 65 (1), 232-244 (1991).
  14. Bui, M., Whittaker, G., Helenius, A. Effect of M1 protein and low pH on nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins. Journal of Virology. 70 (12), 8391-8401 (1996).
  15. Li, S., et al. pH-Controlled Two-Step Uncoating of Influenza Virus. Biophysical Journal. 106 (7), 1447-1456 (2014).
  16. Stauffer, S., et al. Stepwise priming by acidic pH and high K+ is required for efficient uncoating of influenza A virus cores after penetration. Journal of Virology. , (2014).
  17. Zhirnov, O. P. Solubilization of matrix protein M1/M from virions occurs at different pH for orthomyxo- and paramyxoviruses. Virology. 176 (1), 274-279 (1990).
  18. Banerjee, I., et al. Influenza A virus uses the aggresome processing machinery for host cell entry. Science. 346 (6208), 473-477 (2014).
  19. Huotari, J., et al. Cullin-3 regulates late endosome maturation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (3), 823-828 (2012).
  20. Yamauchi, Y., et al. Histone Deacetylase 8 Is Required for Centrosome Cohesion and Influenza A Virus Entry. PLoS Pathog. 7 (10), e1002316(2011).
  21. Bachmayer, H. Selective Solubilization of Hemagglutinin and Neuraminidase from Influenza Viruses. Intervirology. 5 (5), 260-272 (1975).
  22. Reginster, M., Nermut, M. V. Preparation and Characterization of Influenza Virus Cores. Journal of General Virology. 31 (2), 211-220 (1976).
  23. Nermut, M. V. Further Investigation on the Fine Structure of Influenza Virus. Journal of General Virology. 17 (3), 317-331 (1972).
  24. Schulze, I. T. The structure of influenza virus: II. A model based on the morphology and composition of subviral particles. Virology. 47 (1), 181-196 (1972).
  25. Candiano, G., et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).
  26. Greber, U. F., Singh, I., Helenius, A. Mechanisms of virus uncoating. Trends in microbiology. 2 (2), 52-56 (1994).
  27. Yamauchi, Y., Helenius, A. Virus entry at a glance. Journal of Cell Science. 126 (6), 1289-1295 (2013).
  28. Zhirnov, O. P., Grigoriev, V. B. Disassembly of Influenza C Viruses, Distinct from That of Influenza A and B Viruses Requires Neutral-Alkaline pH. Virology. 200 (1), 284-291 (1994).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

NP 40pHSDS PAGEM1

מאמרים קשורים