לויקוציטים שוליים-כבדיים מציגים מאפיינים ייחודיים ותפקודים אימונולוגיים מובהקים בהשוואה לאוכלוסיות לויקוציטים אחרות. כאן אנו מתארים שיטה לקטיף סלקטיבי של אוכלוסיית תאי הכבד הספציפית הזו, באמצעות זלוף מאולץ של הכבד של חולדות או עכברים. לויקוציטים שוליים בכבד נראים קריטיים בקביעת הרגישות למחלות וגרורות הקשורות לכבד.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
קציר סלקטיבי של לויקוציטים Marginating-כבדית
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
לויקוציטים שוליים-כבדיים (MH) (לויקוציטים הנצמדים לסינוסיואידים של הכבד), הוכחו כבעלי הרכב ומאפיינים ייחודיים בהשוואה ללויקוציטים של תאים חיסוניים אחרים. באופן ספציפי, עדויות מצביעות על פרופיל פרו-דלקתי מובהק של אוכלוסיית הלויקוציטים MH וציטוטוקסיות גבוהה יותר של תאי NK ספציפיים לכבד (כלומר, תאי בור) בהשוואה לאימונוציטים במחזור או טחול בעכברים ובחולדות. השיטה המוצגת כאן מאפשרת קציר סלקטיבי של לויקוציטים MH על ידי זלוף מאולץ של הכבד בעכברים וחולדות. בניגוד לשיטות אחרות המשמשות להפקת לויקוציטים בכבד, כולל טחינת רקמות ופירוק ביולוגי, שיטה זו מניבה אך ורק לויקוציטים מהסינוסואידים בכבד, שאינם מזוהמים על ידי תאים מתאי כבד אחרים. בנוסף, טכניקת הזלוף שומרת טוב יותר על השלמות והסביבה הפיזיולוגית של לויקוציטים MH, וחוסכת תגובות פיזיולוגיות ידועות לעיבוד רקמות. מכיוון שתאים ממאירים רבים במחזור ותאים נגועים נעצרים בזמן שהם עוברים דרך סינוסואידים בכבד, באינטראקציה פיזית עם תאי אנדותל ולויקוציטים תושבים, אוכלוסיית הלויקוציטים הייחודית MH ממוקמת אסטרטגית לאינטראקציה, זיהוי ותגובה כלפי תאים חריגים במחזור הדם. לפיכך, קציר סלקטיבי של לויקוציטים MH ומחקרם בתנאים שונים עשויים לקדם את הבנתנו את המשמעות הביולוגית והקלינית של לויקוציטים MH, במיוחד ביחס לתאים חריגים במחזור הדם ומחלות הקשורות לכבד וגרורות סרטניות.
מבוא
הכבד sinusoids מכיל תת לויקוציטים רבים של פעילויות שונות חיסון קריטיות האורגניזם. לדוגמה, marginating הכבד (MH) הרג טבעיים (NK) תאים, הידוע גם בשם תאים בור, מאופיינים מורפולוגית לימפוציטים פרטנית גדול (LGLs) והן מבחינה תפקודית כמו לויקוציטים עם קיבולת ציטוטוקסיות ספונטנית, מה שמאפשר בכבד התנגדות נגד הקמת דם גרורות גידול מובל. מטרת השיטה המוצגת כאן היא לאפשר קצירת סלקטיבית של לויקוציטים MH, כדי ללמוד אוכלוסיית תאים חשוב וייחודי זה (תא החיסון), וכדי להבהיר את ההשפעה של מניפולציות שונות (הפעלה חיסונית למשל) על תאים ספציפיים אלה.
למרות הכישלון של חסינות לחסל גידול ראשוני בפיתוח, ראיות חולות סרטן במודלים של בעלי החיים עולות כי מערכת החיסון יכולה לשלוט במחזור תאים סרטניים, micrometastases, ומחל שיורית throuתא בתיווך GH חסין (CMI). עם זאת, קיימת אי התאמה לכאורה בין אלה יכולות vivo ו במבחנה בבני אדם ובחיות, שיש בהם כדי להעיד כי רוב תאי הגידול עצמיים עמידים cytotoxicity ידי מחזורי או לויקוציטים הטחול 1,2. חוסר עקביות זה ניתן לייחס, לפחות חלקית, על קיומה in vivo של תת-אוכלוסייה לויקוציטים ברורה, כלומר בכבד marginating (sinusoids) לויקוציטים-אוכלוסייה שלהם של תאי NK מופעלים, כלומר תאים בורים 3. ואכן, נתונים שלא פורסמו מהמעבדה שלנו הראו כי אצל חולדות F344 תאים סרטניים syngeneic (MADB106), אשר נמצאו עמידים לויקוציטים במחזור הטחול, היו lysed ידי תאים MH-NK 4. לכן, תאים סרטניים, כי הם לכאורה "NK עמידים" כדי לויקוציטים במחזור עשוי להיות נשלט על ידי תאים MH-NK. ראויים לציון, בעכברים פעילות מוגברת של MH-NK ניכרת רק לאחר in vivo החיסוניתגירוי (למשל באמצעות שימוש לי פולי: C או CPG-C) 5.
כבד ספציפי תא NK (MH-נ"ח) ממוקם בתוך לומן סינוסי, דבקות לתאי אנדותל ותאי Kupffer. תאי MH-NK מאופיינים באופן בלעדי על ידי גרגרים צפופים כדורי שלפוחית cored מוט 6, אשר מכילים חומצת phosphatase אנזימים ליזוזומלית, ו perforin ו granzymes כחומרים ביו 7,8. לעומת תאי NK, תאי MH-NK מציגים מספר גבוה וגודל גרגירי שלפוחית 9-11. בתנאים דלקתיים, תאי MH-NK הוצגו להפגין ביטוי גבוה של LFA-1 12, לעומת תאי NK. ביטוי משופר זו עשויה להוות מנגנון שבאמצעותו תאי MH-NK הם יותר ציטוטוקסיות נגד תאים סרטניים מסוימים מאשר תאי NK 13,14. nterestingly, בא במבחנת דגירה עם interleukin (IL) -2, תאי MH-NK להיות מוגדלים,המספר והגודל של גרגרים שלהם להגדיל, שכולן עולים בקנה אחד עם רוצח פרו fi le של מופעל lymphokine (LAK) תאים 15.
לויקוציטים MH הפעילים לא ניתן להשיג אך ורק באמצעות שיטות קציר לויקוציטים כבד הרגילות, אשר מבוססות על שחיקה ושפלה ביולוגית של הרקמה. יש גישה זלוף שלנו המתוארים כאן שני יתרונות מרכזיים לעומת הגישות הסטנדרטיות. ראשית, גישת זלוף סלקטיבי היבול לויקוציטים MH, מניעת זיהום על ידי לויקוציטים אחרים מעמוד תאים כבדים אחרים. שנית, טכניקת זלוף הטובה יותר שומרת על השלמות, הפעילות, ובין ההוויה הפיזיולוגית של לויקוציטים MH, בניגוד עיבוד רקמות גישות הפוגעים בתאים או לשנות המורפולוגיה שלהם, ובשל ניזק לרקמות, לגרום לשחרור של גורמים שונים כי ניכרו לווסת חיסונית פעילות.
הכבד הוא איבר יעד מרכזי עבור גרורות סרטןnd לזיהומים שונים 16. ככל שתאי MH להציג מאפיינים ייחודיים חשוב ללמוד האוכלוסייה הספציפית הזה בתנאים שונים ביחס לפתולוגיות אלה. לדוגמא, הוא ראוי לציין כי הפעלה מערכתית חיסון על ידי BRMs השונה (למשל פולי לי: C או CPG-C) הוכח להפעיל MH-לויקוציטים יותר במחזור לויקוציטים 5.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
משפט ואתיקה: הנהלים הקשורים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) באוניברסיטת תל-אביב.
1. חולדות פרוטוקול
- תכשירים
- הכן heparinized PBS (30 יחידות / מ"ל) פתרון לשמש בטמפרטורת החדר (RT) על ידי הוספת 30 יחידות של הפרין בחינם משמר לכל מ"ל של בופר פוספט (PBS) פתרון 1x. חישוב 35 מ"ל לכל חיה.
- לעבור heparinized PBS מבעד לקווי משאבת peristaltic ואת מחטי הפרפר לחסל בועות אוויר.
- לעקר כלים כירורגיים - 2 זוגות מספריים, מלקחיים קהי פיפיות, 2 hemostats, מלקחי שן-רקמות (חיטוי ב 121 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לפחות על כוח משיכה (יבשה) הגדרה).
- זלוף של הכבד והגבייה-לויקוציטים MH
- להרדימו ממנת יתר של isoflurane 8%. כאמצעי זהירות, להציב צינור 50 מ"ל המכיל isofluraneכרית -soaked סביב ראש העכברוש עד פתיחת בית החזה שלה.
- פתח את חללי הצפק וחזה כדי לחשוף את הכבד ואת מורכבות לב-ריאה מייד עם הפסקת הנשימה. למנוע דימום דרך התהליך הזה.
- באופן ספציפי, להתחיל את החתך בנקודת קו אמצע הבטן התחתונה, ללא איברים פנימיים מזיקים, והתקדמות לשני הצדדים באלכסון לכיוון הצלעות, חיתוך דרך אותם לרמות חזה החלל העליונות.
- בתוך כ דקות, לאסוף דם רב ככל האפשר (~ 6 מ"ל מבעל חיים 250 גרם) מן החדר הימני לתוך מזרק.
- הצמד את הווריד הנבוב הזנב עם hemostat קרוב ככל האפשר אל הלב, כדי לאפשר גביית perfusate.
- משוך את המעיים ומקום מחוץ החיה בצד ימין של הנסיין, כדי לחשוף את וריד השער.
- הכנס קטטר G IV 25, מחובר משאבת peristaltic, לתוך וריד השער, כמו זנב ככל האפשר,אבל מקורי וריד הטחול.
- הכנס מחט פרפר 25 G, מחובר מזרק 5 מ"ל, לתוך הווריד הנבוב נחות, הזנב אל hemostat.
- הפעל את המשאבה peristaltic במהירות של כ 3 מ"ל / דקה בעדינות לאסוף את מ"ל הראשון של perfusate כי הם מזוהמים עם דם לתוך המזרק. המשך עד שהצבע perfusate הוא מחוויר אדום (כ 3-5 מ"ל). שימו לב שצבע הכבד משתנה לכיוון חום בהיר.
- מבלי לעצור את המשאבה peristaltic, להחליף את המזרק קציר 5 מ"ל עם מזרק קציר 20 מ"ל ולאסוף לפחות 20 מ"ל של perfusate הכבד העסקת מהירות גבוהה יותר של זלוף (עד 4 מ"ל / דק '). לפקח באופן רציף את זרימת perfusate לתוך מזרק האיסוף, ולהימנע ואקום כי הוא חזק מדי (אשר עשוי לסתום את המחט דרך קורסת קירות הווריד הנבוב).
- לסיים זלוף כאשר הצבע של הכבד פונה חום בהיר.
- הפקה לויקוציטים
- צנטריפוגה perfusate במשך 10 דקות ב 400 XG, 24 מעלות צלזיוס.
- לשאוב supernatant
- הוסף 10 מ"ל PBS, צנטריפוגות ב 400 XG במשך 10 דקות, ולאחר לשאוב supernatant. בהתבסס על מטרות מחקר, להשתמש בתכשיר כמו שהוא, או לנהל purifications נוסף (למשל, פרידת שיפוע צפיפות).
- באופן ספציפי, שכבה 4 מ"ל של perfusate מעל 4 מ"ל של המונית ההפרדה-שיפוע צפיפות בתוך שפופרת צנטריפוגות פוליפרופילן 50 סמ"ק. ספין צינורות ב 754 XG, RT, למשך 30 דקות עם לנתק.
- השג את שכבות mononuclear בממשק ההפרדה-supernatant צפיפות שיפוע ידי pipetting ידנית, לשטוף ב- PBS, ולהכניס לתוך צינור 5 מ"ל.
2. עכבר פרוטוקול
- תכשירים
- הכן heparinized PBS (30 יחידות / מ"ל) פתרון לשמש בטמפרטורת החדר (RT) על ידי הוספת 30 יחידות של הפרין בחינם משמר לכל מ"ל של בופר פוספט (PBS) 1x solution. חישוב 20 מ"ל לכל חיה.
- לעבור heparinized PBS מבעד לקווי משאבת peristaltic ואת מחטי הפרפר לחסל בועות אוויר.
- לעקר כלים כירורגיים - 2 זוגות מספריים, מלקחיים קהי פיפיות, 2 hemostats, מלקחי שן-רקמות (חיטוי ב 121 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לפחות על כוח משיכה (יבשה) הגדרה).
- זלוף של הכבד אוסף של MH-Leukocytes
- להרדימו ממנת יתר של isoflurane 8%. כאמצעי זהירות, להציב צינור 15 מ"ל המכיל כרית ספוג isoflurane סביב הראש העכבר עד פתיחת בית החזה שלה.
- תקן את הגפיים של העכבר למיטה.
- פתח את חללי הצפק וחזה כדי לחשוף את הכבד ואת מורכבות לב-ריאה מייד עם הפסקת הנשימה, שמירה על ההיבט הנמוך של הסרעפת ללא פגע (כדי ליצור מאגר חלל חזה ניקוז). למנוע דימום דרך התהליך הזה.
- באופן ספציפי, להתחיל את החתך לפי הנמוךנקודת קו אמצע בטן, ללא איברים פנימיים מזיקים, והתקדמות לשני הצדדים באלכסון לכיוון הצלעות, חיתוך דרך אותם לרמות חזה החלל העליונות.
- נסיגת המעיים והמקום מחוץ חית זכותו של הנסיין, כדי לחשוף את וריד השער.
- הכנס מחט 30 גרם, מחוברת משאבה peristaltic לתוך מקורי פורטל וריד אל וריד הטחול.
- חותך את הווריד הנבוב הנח מעל הסרעפת כדי לאפשר ניקוז ואיסוף של perfusate מחלל החזה.
- הפעל את המשאבה peristaltic במהירות של כ 3 מ"ל / דקה בעדינות לאסוף את perfusate 3 מ"ל של הראשון כי הם מזוהמים עם דם ממאגר חלל החזה.
- בטל perfusate זה. חזור כביסה כזה שוב במידת הצורך, באמצעות מלוחים, ורק אז להתחיל לאסוף perfusate הכבד.
- התחל מחדש את זלוף במהירות של עד 4 מ"ל / דק ', ולאסוף 10 מ"ל של perfusate מחלל החזה באמצעותפרפר מחובר מזרק.
- לסיים זלוף כאשר הצבע של הכבד פונה חום בהיר.
- הפקה לויקוציטים
- צנטריפוגה perfusate במשך 10 דקות ב 400 x ז.
- לשאוב supernatant.
- הוסף 10 מ"ל PBS, צנטריפוגות ב 400 XG במשך 10 דקות, ולאחר לשאוב supernatant בהתבסס על מטרות המחקר, להשתמש בתכשיר כפי שהוא, או לנהל purifications נוספים (למשל, פרידה שיפוע צפיפות).
- באופן ספציפי, שכבה כל 4 מ"ל של perfusate מעל 4 מ"ל של המונית ההפרדה-שיפוע צפיפות בתוך שפופרת צנטריפוגות פוליפרופילן 50 סמ"ק. ספין צינורות ב 754 XG, RT, למשך 30 דקות עם לנתק.
- השג את שכבות mononuclear בממשק ההפרדה-supernatant צפיפות שיפוע ידי pipetting ידנית, לשטוף ב- PBS, ולהכניס לתוך צינור 5 מ"ל.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בחולדות F344 השווינו את cytotoxicity של תאי MH-NK (נגבי sinusoids הכבד על ידי זלוף כבד בכפייה) כדי cytotoxicity של אוכלוסיית התא כבד כולו בעקבות שחיקה מכאנית של רקמת הכבד, ואל cytotoxicity של מחזורים לויקוציטים. כל הכנות התא נשטפו לפחות 3 פעמים, כדבר שבשגרת מבחני אימונולוגית, וכפי שורות תאי היעד השתמשנו אלוגנאית YAC-1 או שורות תאי יעד MADB106 syngeneic. כפי שניתן לראות דמויות 1 - 4, ואילו תאי MH-NK הציגו cytotoxici...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שיטת זלוף הכבד המוצגת כאן מאפשרת קצירת סלקטיבית ולומדים של האוכלוסייה הייחודית של marginating לויקוציטים כבד. תאים כבדיה NK, המכונים גם בורים תאים 3, מהווים אוכלוסיית תא NK ייחודית מתגוררות sinusoids הכבד. הם נמצאים אצל חולדות, עכברים 17 ובבני אדם 18,19. לעומת תאים היקפיים NK מבודדים, תאים בורים הפגינו cytotoxicity התחזק כנגד YAC-1 ו CC531s שורות תאי יעד 20, הוצגו יש מספר גבוה יותר של גרגרי ציטופלסמית קטנים 20, ו ביטוי גבוה של...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים אין לי מה לחשוף.
תודות
המחברים ועבודה זו נתמכו על ידי מענק NIH/NCI # R01CA172138 (ל-SBE).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| פריסטלטית אוטוקלוד | |||
| מחט פרפר | OMG | 26 גרם | |
| מחט פרפר | OMG | 21 גרם * 3/4 אינץ' | |
| תמיסת | מזרק תמונה | 1 מ"ל | |
| תמיסת | מזרק | 2.5 מ"ל | |
| תמיסת | מזרק | פיק 5 מ"ל | |
| מזרק | תמיסת | 10 מ"ל | |
| מזרק | תמיסת | 25 מ"ל | |
| מלקחיים | |||
| שוליים מספריים | |||
| המוסטט | |||
| מלקחיים | |||
| 22 W מנורת |
מקורות
- Melamed, R., et al. The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells. J Immunother. 33, 16-29 (2010).
- Benish, M., Melamed, R., Rosenne, E., Neeman, E., Sorski, L., Levi, B., Shaashua, L., Matzner, M., Ben-Eliyahu, S. The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics. Immunologic Research. 58, 28-39 (2014).
- Wisse, E., van't Noordende, J. M., van der Meulen, J., Daems, W. T. The pit cell: description of a new type of cell occurring in rat liver sinusoids and peripheral blood. Cell Tissue Res. 173, 423-435 (1976).
- Vermijlen, D., et al. Hepatic natural killer cells exclusively kill splenic/blood natural killer-resistant tumor cells by the perforin/granzyme pathway. J Leukoc Biol. 72, 668-676 (2002).
- Gao, B., Radaeva, S., Park, O. Liver natural killer and natural killer T cells: immunobiology and emerging roles in liver diseases. J Leukoc Biol. 86, 513-528 (2009).
- Kaneda, K. Liver-associated large granular lymphocytes: morphological and functional aspects. Arch Histol Cytol. 52, 447-459 (1989).
- Podack, E. R., Hengartner, H., Lichtenheld, M. G. A central role of perforin in cytolysis? Annu Rev Immunol. 9, 129-157 (1991).
- Kamada, M. M., et al. Identification of carboxypeptidase and tryptic esterase activities that are complexed to proteoglycans in the secretory granules of human cloned natural killer cells. J Immunol. 142, 609-615 (1989).
- Wisse, E., et al. On the function of pit cells, the liver-specific natural killer cells. Semin Liver Dis. 17, 265-286 (1997).
- Bouwens, L., Remels, L., Baekeland, M., Van Bossuyt, H., Wisse, E. Large granular lymphocytes or "pit cells" from rat liver: isolation, ultrastructural characterization and natural killer activity. Eur J Immunol. 17, 37-42 (1987).
- Vanderkerken, K., et al. Origin and differentiation of hepatic natural killer cells (pit cells). Hepatology. 18, 919-925 (1993).
- Luo, D., et al. The role of adhesion molecules in the recruitment of hepatic natural killer cells (pit cells) in rat liver. Hepatology. 24, 1475-1480 (1996).
- Shresta, S., MacIvor, D. M., Heusel, J. W., Russell, J. H., Ley, T. J. Natural killer and lymphokine-activated killer cells require granzyme B for the rapid induction of apoptosis in susceptible target cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 5679-5683 (1995).
- Luo, D., et al. Involvement of LFA-1 in hepatic NK cell (pit cell)-mediated cytolysis and apoptosis of colon carcinoma cells. J Hepatol. 31, 110-116 (1999).
- Wiltrout, R. H., et al. Augmentation of mouse liver-associated natural killer activity by biologic response modifiers occurs largely via rapid recruitment of large granular lymphocytes from the bone marrow. J Immunol. 143, 372-378 (1989).
- Schluter, K., et al. Organ-specific metastatic tumor cell adhesion and extravasation of colon carcinoma cells with different metastatic potential. Am J Pathol. 169, 1064-1073 (2006).
- Wiltrout, R. H., et al. Augmentation of organ-associated natural killer activity by biological response modifiers. Isolation and characterization of large granular lymphocytes from the liver. J Exp Med. 160, 1431-1449 (1984).
- Winnock, M., et al. Functional characterization of liver-associated lymphocytes in patients with liver metastasis. Gastroenterology. 105, 1152-1158 (1993).
- Hata, K., et al. Isolation, phenotyping, and functional analysis of lymphocytes from human liver. Clin Immunol Immunopathol. 56, 401-419 (1990).
- Vanderkerken, K., Bouwens, L., Wisse, E. Characterization of a phenotypically and functionally distinct subset of large granular lymphocytes (pit cells) in rat liver sinusoids. Hepatology. 12, 70-75 (1990).
- Sorski, L., Melamed, R., Lavon, H., Matzner, P., Rosenne, E., Ben-Eliyahu, S. PNIRS Annual Scientific meeting, Seattle, , (2015).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
