מאמר שיטה

דיפרנציאציה של פרפור cardiomyocytes מתאי גזע פלוריפוטנטיים שימוש Grem2 אנטגוניסט BMP

7.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53919

⸱

10 במרץ 2016

 , 
1Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Vanderbilt University School of Medicine, 2Department of Pharmacology, Vanderbilt University, 3Department of Cell & Developmental Biology, Vanderbilt University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

יצירת קרדיומיוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים במבחנה מאפשרת גישה לכמויות גדולות של רקמת לב במבחנה למדע בסיסי וליישומים קליניים. פרוטוקול זה משתמש בגורם הפרוזדורים Grem2 כדי להגדיל את מספר הקרדיומיוציטים המתקבלים וליצור קרדיומיוציטים עם פנוטיפ פרוזדורים.

תקציר

פרוטוקולים להפקה אוכלוסיות של cardiomyocytes מתאי גזע פלוריפוטנטיים פותחו, אבל אלה כלליים מניבי תאים של פנוטיפים מעורבים. חוקרים המעוניינים לצאת ללימודים מעורבים תת myocyte ספציפי דורשים גישת בידול מכוונת יותר. על ידי טיפול עכבר גזע עוברי (ES) תאים עם Grem2, אנטגוניסט BMP מופרש כי הוא הכרחי עבור היווצרות תא פרוזדורי in vivo, מספר רב של תאי לב עם פנוטיפ פרוזדורים יכול להיוצר. שימוש הקו התאי גזע Myh6-DsRed-NUC פלוריפוטנטיים המהונדס מאפשר זיהוי, בחירה, וטיהור cardiomyocytes. בפרוטוקול זה גופי embryoid נוצרים מתאי Myh6-DsRed-NUC בשיטת ירידה התלויה ונשמרות השעיה עד יום בידול 4 (D4). בשעת תאי D4 מטופלים עם Grem2 מצופה על צלחות מצופות ג'לטין. בין D8-D10 באזורים וקבלנים גדולים הם נצפו בתרבויות ולהמשיך להתרחב מature דרך D14. מולקולרי, היסטולוגית electrophysiogical מניתוח תאים בתאים שטופלו Grem2 רוכשים תכונות פרוזדורים דמויים מתן מודל במבחנה ללמוד את הביולוגיה של cardiomyocytes פרוזדורי תגובתם סוכנים תרופתיים שונים.

מבוא

תאי גזע פלוריפוטנטיים הוא כלים רבים עצמה ליצירה ולומד על תאים מפני שורה של קשה לרקמות גישה ללימודי מחקר בסיסיים פרה-קליני, במיוחד אצל בני אדם 1-5. אפנון תקין מסלולי איתות התפתחותי יכול לכוון את ההתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים לגורל פנוטיפי הרצוי. פרוטוקולים רבים פותחו כדי ליצור cardiomyocytes (CMS) מתאי גזע פלוריפוטנטיים 6-14. פרוטוקולים אלה כרוכים אפנון בדרך של TFGβ superfamily (Activin, BMP ו- TGFβ) ו Wnt מסלולי דרך בנוסף מתוזמן של גורמי גדילה אקסוגניים ו / או מולקולות קטנות 10,12-15. פרוטוקולים אלה הם בדרך כלל יעילים להגדיל את אחוז התאים שהופכים CMS, אבל החוסר ספציפי, יצירת אוכלוסייה מעורבת של תאי מייצגי פרוזדורים, חדרית, שושלות מערכת קטרים ​​/ הולכה. על מנת ללמוד לב ספציפי לגבי תת-appro בידול מכוון יותרACH נדרש.

Gremlin2 (Grem2, המכונה גם החלבון הקשור לדן סרברוס או PRDC בקיצור) הוא אנטגוניסט BMP מופרש דרוש בידול לב ראוי היווצרות תא פרוזדורים במהלך התפתחות לב דג הזברה 16. טיפול בתאי גזע עובריים הבחנה עם Grem2 ביום בידול 4, רק לאחר ביטוי השיא של סמנים mesodermal T-Brachyury ו סרברוס כמו 1, מגדיל את התשואה של CMS ומייצר מאגר של תאים בעיקר של השושלת פרוזדורים 14.

רקומביננטי Grem2 משמש לטיפול בתאי ההבחנה והוא יכול להתבצע באמצעות טכניקות ייצור חלבון סטנדרטי 17 או ניתן לרכוש מסחרי. זה מאוד מסיס בתמיסות מימיות ניתן להוסיף exogenously לתרבויות בנקודת הזמן הרצוי.

בידול ניתן לעקוב באמצעות RT-qPCR לכמת ביטוי נציג סמניםשל אבות לב וכלי דם, אבות לב, ומחויב CMS. Immunofluorescence יכול לשמש גם כדי לזהות ולדמיין פריסה המרחבית של סוגי תאי לב.

יישומים הדורשים אוכלוסיות טהורות יותר בקלות להתבצע בעת שימוש במערכת כתב לזהות ולבודד CMS. לענין זה, הצגנו את αMHC-DsRedNuc לבנות לתוך הקו הסלולרי העכבר CGR8 ES 14. תאי CGR8 לגדול ולהישאר pluripotent ללא תאים מזינים, הקלת מבחני רחבה והבחנה 18. השורה בתאי הגזע העוברית מכילה רצף קידוד חלבון פלואורסצנטי DsRed עם אות לוקליזציה גרעינית תחת שרשרת לב ספציפי אלפא שרירן הכבד (אלפא MHC או Myh6) אמרגן גן. באמצעות תאים אלה, CMS ניתן לזהות בקלות ומבודד כימות, מיון התא, אלקטרופיזיולוגיה, מסכי סמים, ולומדים מנגנוני התמיינות פרוזדורים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת תא תרבות מדיה, פתרונות, ריאגנטים.

  1. כן 500 מיליליטר של תאי גזע עובריים עכבר (המסקלין) תקשורת על ידי ערבוב וסינון סטרילי (0.2 מיקרומטר גודל נקבובי) 445 מיליליטר גלזגו המינימום הכרחי הבינוני (GMEM), 50 מ"ל סרום שור עובר חום מומת (FBS), 5 מיליליטר 100X מרוכז L- החלפת גלוטמין, 5 μl העכבר רקומביננטי פקטור מעכבות לוקמיה (LIF) ב 1 x 10 7 יחידות למ"ל, ו 1.43 μl SS-mercaptoethanol (הריכוז הסופי הוא 50 מיקרומטר). חנות ב 4 C עד מוכן לשימוש.
  2. הכן 500 מ"ל של Embryoid גוף (EB) התקשורת בידול על ידי סינון ערבוב וסטרילי 391 מ"ל Iscove של השתנה Dulbecco בינוני (IMDM), 100 מ"ל חום מומת FBS, 5 מ"ל 100X מרוכזים החלפת L-Glutamine, 5 מ"ל 100X מרוכזים חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), ו 2.86 μl SS-mercaptoethanol (הריכוז הסופי הוא 100 מיקרומטר). חנות ב 4˚ C עד מוכן לשימוש.
  3. כן 0.2% wפתרון v / ג'לטין על ידי ערבוב אבקת ג'לטין העור חזירי 1 גרם עם 500 מ"ל של מסונן, H מזוקקים 2 O. לעקר על ידי מעוקר. ראוי לציין, כי ג'לטין לא יכול להיות מסיס לחלוטין במים ב RT. לאחר מעוקר את הג'לטין צריך להיות נמס לגמרי. חנות ב RT עד מוכן לשימוש.
  4. כן aliquots חלבון רקומביננטי Grem2 ידי המסת 50 מיקרוגרם גלולים של lyophilized Grem2 ב 100 בופר פוספט μl (PBS) בתוספת 0.1% BSA לעשות פתרון מנייה 0.5 מיקרוגרם / μl. Aliquot 20 μl של פתרון המניות זה לחמש צינורות צנטריפוגות סטרילי 1.5 מ"ל ולאחסן ב -80˚ C עד מוכן לשימוש.
  5. הכן PBS על פי פרוטוקולים שפורסמו או רכישה כמו מניה 10X לדלל 1:10 עם מסונן, מזוקקים H 2 O לבצע 1X עובד דילול 19. לעקר PBS על ידי מעוקר לפני השימוש. חנות ב RT עד מוכן לשימוש. בשלבים מסוימים, DPBS ללא Ca 2 + ו Mg 2+ משמש. זהו purchased כפתרון 1X. הזמנת מידע נכלל בטבלה של חומרים כימיים.

2. הכנת ג'לטין מצופה 10 ס"מ רקמות תרבות מנות

  1. במנדף בתרבית רקמה מעוקר להוסיף 5 מ"ל של תמיסת הג'לטין 0.2% על כל מנה תרבות 10 ס"מ רקמות לציפוי. מאכל מקום חממה ב 37 צלזיוס לפחות 30 דקות או עד 4 ימים.

3. הכנת ג'לטין מצופה 6-גם צלחות תרבות רקמות

  1. במנדף בתרבית רקמה מעוקר להוסיף 1 מ"ל של ג'לטין 0.2% היטב בכל צלחת בתרבית רקמה 6 באר. מקום צלחות חממה ב 37 צלזיוס למשך 30 דקות לפחות או עד 4 ימים.

4. תרבות בתאי גזע עובריים

  1. mESCs פשרה
    1. כן תקשורת המסקלין ידי ההתחממות כדי RT במנדף בתרבית רקמה מעוקרת. הוסף 10 מ"ל התקשורת RT לצלחת ס"מ 10 ג'לטין מצופה.
    2. סר 1 בקבוקון של mESCs המכיל כ 1 x 10 6 תאיםcryostorage. החזקת cryovial עם מלקחיים, המקום באמבט מים 37 ג. מערבולת בעדינות עד השעית התא הפשירה ו גביש קרח קטן רק נשאר במרכז הבקבוקון. להתנגב בקבוקון עם הפנויה נטולת סיבים לנגב לעקר עם 70% EtOH.
    3. במנדף בתרבית רקמה סטרילית להסיר תאים מופשר באמצעות קצה P1000 מן cryovial ולהעביר עד 10 ס"מ צלחת ערוכים 4.1.1).
    4. מקום 10 ס"מ צלחת לתוך 37 תרבית תאים חממה humidified C עם 5% CO 2 ו שווה להפיץ תאים על ידי הזזת בעדינות בחזית צלחת אל גב, ולאחר מכן לצד. לאפשר לתאים לצרף צלחת O / N או לפחות 6 שעות.
    5. דבר ראשון תאי השק למחרת בבוקר עבור התקשרות באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר. כמה פסולת התא ותאים מתים יקויימו בתקשורת. זה נורמלי. תקשורת לשאוב מנות ולהחליף עם 10 מ"ל טרי תקשורת המסקלין.
    6. המשך לשנות תקשורת על תאים מדי יום כדי למנוע בידול.
  2. MESCs Passaging
    1. מעבר תאים כאשר 60-70% ומחוברות. הכן תאים עבור passaging ידי aspirating התקשורת ושטיפה עם 5 מ"ל סטרילי 1X DPBS ללא MgCl 2 ו CaCl 2. הוסף 2 מ"ל פתרון 0.05% טריפסין- EDTA. מניח חממה ב 37 צלזיוס למשך 5 דקות.
    2. בעוד התאים הם דוגרים, להכין צלחת 10 ס"מ חדש על ידי aspirating פתרון ג'לטין והוספת 10 מ"ל של התקשורת RT המסקלין. לאחר 5 דקות לבדוק את התאים עבור ניתוק. אם התאים נשארים צמודים, ממשיכים לדגור על 37 צלזיוס למשך 2 דקות בכל פעם, עד מנותקת לחלוטין.
    3. להרוות טריפסין-EDTA על ידי הוספת 3 מ"ל של התקשורת המסקלין. להעביר את ההשעיה התא צינור ספין 15 מ"ל צנטריפוגות ב XG 200 במשך 5 דקות עד גלולה. התקשורת לשאוב גלולה מחדש להשעות ב 10 מ"ל התקשורת המסקלין.
    4. בהתאם יחס הפיצול הרצוי, להוסיף 0.5-1.0 מ"ל של תרחיף תאים לכל צלחת מוכן בשלב 4.2.2). מניחים צלחת החממה ולהפיץ התאים באופן שווה על ידי הזזת בחזרה לחזית בעדינות ואז לצד. כלתאי ow לצרף O / N או עבור 12 שעות לפחות.
      הערה: ביחס פיצול של 1:10 - 1:20 נפוץ במרבית ענפי המסקלין. יחס זה עשוי להשתנות בהתאם לקו בשימוש, מספר מעבר, ואת המפגש רצוי על המנה החדשה. עבור העברה יחס הפיצול 01:10 1 מ"ל של השעיה התא לתוך 9 מ"ל המסקלין התקשורת צלחת צלחת 10 ס"מ מצופה ג'לטין מוכן טרי.

5. הכנת גופי Embryoid

הערה: כל השלבים מלבד צנטריפוגה מבוצעים ברדס בתרבית רקמה סטרילית.

  1. הכנת תרחיף תא ב- Media EB
    1. עם 70% confluency (בדרך כלל 24-48 שעות שלאחר מעבר), משתמשי תאי היווצרות EB. כן תאים עבור היווצרות EB ידי ניתוק ו pelleting לפי סעיפי 4.2.1) - 4.2.3).
      הערה: (. למשל, מוות של תאים קטנים מאוד, אין זיהום, מורפולוגיה נכונה) עדיף תאי מעבר לפחות פעם אחת הפשרת פוסט וסמן לבריאות צמיחה איתנה (ה.ז., הכפלות האוכלוסייה המתרחשים כל 24-48 שעות) לפני השימוש להכנת EBS.
    2. Re- להשעות גלולה בתקשורת 5 מ"ל EB. ספירת תאים באמצעות hemocytometer או נגד תא אוטומטי.
    3. לדלל השעית תא נפח נדרש תקשורת EB לעשות לריכוז סופי של 25 תאים / μl (או 2.5 x 10 3 תאים / מיליליטר). שים לב שכל מכסה של צלחת פטרי היא מחזיקה ב -60 EBS ודורש כ -1.3 מ"ל של תרחיף תאים. בשלב זה, להכין נפח מספיק של השעיה תא כדי ליצור את המספר הרצוי של EBS. לדוגמה, אם 240 EBS נדרשים לצורך הניסוי, להכין 5.2 מ"ל ב 2.5 x 10 3 תאים / מ"ל.
      הערה: mESCs שאינם משמשים ליצירת EB יכול לשמש בניסויים עתידיים על ידי ספינינג למטה, מחדש השעיית במדיה המסקלין ציפוי כמפורט בסעיף 4.2.
  2. יצירת גופי Embryoid
    1. כן-בצלחות פטרי חיידקים 10 סנטימטרים סטרילי לתליית היווצרות טיפה ידי הוספת 2 מיליליטר של 1X PBS לתחתית דוארACH.
    2. להעביר את ההשעיה EB משלב 5.1) כדי אגן פתרון סטרילי.
    3. מורידים את המכסה מן צלחת פטרי מוכן ובזהירות להפקיד שישים, 20 טיפות μl של השעיה EB על המשטח הפנימי. להשיג זאת ביעילות באמצעות pipet הרב ערוצית מצויד 6 טיפים. כל ירידה של 20 μl עכשיו 500 תאים.
    4. בעדינות להחליף המכסה על החצי התחתון של פטרי צלחת חיידקי, נזהר שלא לעקור תלוי טיפות. מניחים מנות לתוך תרבית תאים חממה ב 37˚ C. לאחר 2 ימים, תאים מוכנים לשטוף כמתואר 5.3).
  3. לשטוף למטה של ​​גופי Embryoid
    הערה: כל הצעדים לשטוף למטה מבוצעים ברדס בתרבית רקמה סטרילית.
    1. אחרי 2 ימים EB של מוכנים לשטיפה למטה ומעבירים בצלחות פטרי חיידקי 6 סנטימטר. טרום חם 3 מיליליטר של תקשורת EB לכל צלחת פטרי RT. כל צלחת פטרי חיידקי 6 ס"מ יכול להחזיק 2 מכסים בשווי של תלוי טיפות ביעילות.
      הערה: הקפד להשתמש f בצלחת פטרי הלא מצופהאו שלב זה (ראה טבלת חומרים). אין להשתמש בצלחת בתרבית רקמה או כל משטח אחר מעודדת הידבקות תא. EBS צריך להיות מושעה בתקשורת עד מוכן להיות מצופה כמתואר בסעיף 6.
    2. הסר בצלחות פטרי 10 ס"מ מן החממה ומקום לתוך מכסה המנוע בתרבית רקמה סטרילית. מוציאים בזהירות מכסה עם EBS להטות בזווית של 45 מעלות.
    3. שימוש pipet סרולוגיות 5 מ"ל המכיל 3 מ"ל של התקשורת RT EB, לשטוף בעדינות EBS לתוך בריכה בתחתית המכסה. בזהירות לבדוק את המכסה עבור EBS התקועות אל פני השטח מחדש לשטוף במידת הצורך.
    4. לאחר שטיפת כל העברת EBS כדי בצלחת פטרי 6 ס"מ.
    5. חזור על שלבים 5.3.2) -5.3.4) עבור כל EBS. כל צלחת פטרי 6 ס"מ אמור להכיל EBS משני מכסים 10 ס"מ. מניחים את כל הכלים בחזרה לתוך החממה ב 37 צלזיוס במשך יומיים יותר.
      הערה: EBS כי הם קרובים מדי זה לזה השעיה עשויה להידבק יחד ויוצרים אגרגטים גדולים. זה יכול להשפיע יעילות בידול לב שליליתכמו גם לצמצם את מספר זמין EBS משמעותי. כדי למנוע צבירה, EBS צריך להיבדק בכל יום ומופרד על ידי הזזת בעדינות קדימה ואחורה, אז לצד. שימוש מנות חיידקים בשלבי הבידול המוקדמים נחוץ כדי למנוע עיקול EB כדי בצלחת ולאפשר EBS לגדול השעיה.

ציפוי 6. וטיפול EBS עם Grem2

  1. כן בינוני טיפול Grem2 ידי הוספת נפח מספיק של מניות (0.5 מיקרוגרם / μl) Grem2 עד בינוני RT EB עבור דילול סופי של 1-5 מיקרוגרם / מיליליטר.
    הערה: ריכוז יעיל לטיפול EBS משתנה בהתאם לקו התא פעילות ספציפית של המגרש הנוכחי של Grem2. מומלץ לפני שימוש המינון הוא טיטרציה למצוא האפקטיביות מקסימליים. עבור הקו CGR8 המסקלין אנו משתמשים באופן שגרתי 3-5 מיקרוגרם / מ"ל ​​של Grem2. ריכוזים אפקטיביים של Grem2 עבור דור myocyte פרוזדורים יהיה לייצר תאי קבלנות במהירות ביןימים 7-8 כי נפוצים ברחבי כל טוב. אם הפנוטיפ קבלנות לא הוא ציין בתרבויות שטופלו מומלץ כי Grem2 מינון להיות טיטרציה בטווח המצוין.
  2. כן צלחות תרבית רקמת 6-היטב על ידי aspirating פתרון ציפוי ג'לטין מבאר כל והוספת 2 מיליליטר של תקשורת טיפול RT Grem2. הסר EBS מן החממה ומקום לתוך מכסה המנוע בתרבית רקמה סטרילית.
  3. באמצעות P1000 נקבע על 100 μl העברת 30 EBS מ 6 צלחות פטרי ס"מ היטב כל אחד. EBS מקום לתוך החממה שווה לפזר ידי הזזת הצלחת בעדינות בחזרה לחזית אז לצד.
    1. לאחר EBS כשמצמיד אותה הבארות מצופות ג'לטין, להחליף מדיה Grem2 כל ימים עד יום 10. לאחר יום 10, להפסיק את טיפול Grem2 ולהוסיף תקשורת EB טריה כל ימים כדי לשמור על תאים בריאים.
      הערה: לאחר שחבר, EBS יהיה לרדד על פני השטח של הצלחת המצופית.

7. תא דיסוציאציה עבור RT-qPCR Analyאחותי

  1. תא דיסוציאציה עם-EDTA טריפסין
    1. לשאוב התקשורת מכל טוב ולשטוף פעמיים עם 1 מ"ל לכל טוב של DPBS סטרילית מינוס Ca 2 + ו Mg 2+.
    2. הוסף 0.5 מ"ל 0.25% פתרון טריפסין- EDTA סטרילי היטב כל שממנו תאים ייאספו.
    3. מניחים צלחת החממה ב 37 צלזיוס למשך 5 דקות.
    4. לאחר 5 תאי צק דקות דיסוציאציה. אם התאים עדיין להישאר מחובר אל החלק התחתון של ברז היטב בעדינות כדי להסיר. אם קשה לא לשחרר תאים, ומכניס לתוך חממה ולעקוב אחר כל 2 דקות עד תאים מנותקים לחלוטין.
    5. לנטרל פתרון טריפסין- EDTA על ידי הוספת 0.5 מ"ל התקשורת EB היטב כל אחד.
    6. העבר 1 מ"ל כולו ההשעיה לתא צינור צנטריפוגות מיקרו 1.5 מ"ל.
    7. תאים גלולה ידי ספינינג בצנטריפוגה בטבלה העליונה במשך 5 דקות ב g 300 x.
    8. לשאוב מן התקשורת גלולה ולהמשיך הלאה תמוגה מיד או גלולה חנות ב -70 C עד מוכן תמוגה. -Ter ארוךאחסון של כדורים מ אינו מומלץ כמו זה יכול להוביל שפלה של רנ"א.
  2. תמוגה תא ניתוח מולקולרי
    1. בשלב זה תאים מוכנים בידוד RNA באמצעות ערכת חילוץ מסחרית עמודה או באמצעות מגיב מיצוי RNA על פי הפרוטוקולים שסופקו על ידי היצרנים (ראה טבלה של חומרים). לאחר מבודד, להפוך RNA עיבד ולהשתמש cDNA לניתוח RT-qPCR באמצעות טכניקות סטנדרטיות 20, 21.
      הערה: Primers שמוצג Lab זה RT-qPCR מפורטים בטבלה 1. זהות פרוזדורים הוא אישר באמצעות שילוב של RT-qPCR להסתכל הביטוי של גנים פרוזדורים חדרית ו אלקטרופיזיולוגיה משך פוטנציאל פעולה שיא (ראו סעיף 8). מבחר של גנים נכלל בפרוטוקול זה כדוגמא סמני פרוזדורים חדרית אמינים. מידע נוסף על פרוזדורי ביטוי גני חדרית בהקשר של התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטיים נמצא התייחסות 14.

8. ניתוח אלקטרו

  1. תא דיסוציאציה עם Collagenase
    1. התקשורת לשאוב מבאר כל ולשטוף פעמיים עם 1 מ"ל לכל טוב של PBS סטרילית.
    2. הוסף 0.5 מ"ל של 1 מ"ג / פתרון collagenase מ"ל היטב כל אחד.
    3. מניחים צלחת החממה ב 37 צלזיוס למשך 10 דקות.
    4. לאחר 5 תאי צק דקות דיסוציאציה. אם התאים עדיין להישאר מחוברים זה לזה או התחתון של ברז היטב בעדינות כדי להסיר. בהמשך לנתק את התאים על ידי טחינה דקה ועדינה עם P1000.
      הערה: כדי להקל על תיקון תאי הקלטות מהדק יש triturated עד השעית תא בודד מושגת.
    5. הוסף 0.5 מ"ל התקשורת EB היטב כל ומערבבים ידי pipetting.
    6. העבר 1 מ"ל כולו ההשעיה לתא צינור צנטריפוגות מיקרו 1.5 מ"ל.
    7. תאים גלולה ידי ספינינג בצנטריפוגה בטבלה העליונה במשך 5 דקות ב g 300 x.
    8. תקשורת לשאוב כדורי תא.
    9. מחדש להשעות תאי 500μl PBS עם 10% FBS, ויש להקפיד triturate לתוך ההשעיה תא בודד.
  2. אפיון אלקטרו.
    הערה: פרוטוקולים מעולים רבה פורסמו בכתב העת הזה על שימוש מהדק תיקון תא בודד למדוד פוטנציאלי קרום תא. לקבלת מידע מפורט על כיצד לבצע תיקון תא בודד מהדק את קורא הטירון מכונה הפרוטוקולים הללו 21-24. להלן מכיל מידע ספציפי עבור פרוטוקול זה שיסייע electrophysiologist המנוסה להכין ולטפל המסקלין נגזר CMS לאפיון תת סוג.
    1. הכן פתרון הקלטה תאיים המורכב מאלה: 10 חיץ HEPES מ"מ, 5 מ"מ MgATP, 2 מ"מ EGTA, 110 גלוטמט אשלגן מ"מ, 10 מ"מ KCl, ו -10 מ"מ NaCl. התאם פתרון pH של 7.2 באמצעות NaOH.
    2. הכן הקלטה תאיים (אמבטיה) פתרון המורכב מאלה: גלוקוז 2 מ"מ HEPES, 10 מ"מ, 1 מ"מ MgCl 2, 2 מ"מ CaCl 2, 5.4 מ"מ KCl, ו -137mM NaCl. התאם פתרון pH של 7.4 באמצעות NaOH.
    3. הכן כוס pipet המודד 2-5 התנגדות MΩ כאשר backfilled עם פתרון הקלטה באמצעות זכוכית בורוסיליקט רגיל עם נימה.
    4. העברה 100 μl של תאים מושעים לתוך תא הקלטה המכילים פתרון הקלטה תאי באמצעות P200.
      הערה: תאים עשויים להיות תוקנו בהשעייה או, כדי להקל על הטיפול ולהשתמש עבור טיפול תרופתי ו / או מבחני זלוף, ניתן זורעים על coverslip ג'לטין מצופה כפי שמתואר 8.2.5).
    5. הכן coverslips זכוכית מצופה ג'לטין על ידי הצבת coverslip זכוכית בקוטר 10 מ"מ לבאר כל צלחת 6-גם ומכסה עם פתרון ג'לטין כמפורט בסעיף 3.1) של פרוטוקול זה.
      1. אחרי לפחות פתרון ג'לטין 30 דקות לשאוב ולהוסיף 100 μl של תאים מושעים ישירות coverslip ומניח צלחת 6-היטב כולו לתוך חממה לפחות 2 שעות או עד תאים יש מצורפים. אחרי התאים יש מצורפים, rתלוש ומקום כיסוי סר ברישום קאמרי עם פתרון הקלטה תאי.
        הערה: אם אתה משתמש αMHC-DsRed פלורסנט כתב לב הקו המסקלין, CMS ניתן לזהות על ידי גרעיני הניאון האדומים שלהם. אם אינך משתמש קו כתב לב, תאי קבלנות ספונטנית ניתן לצפות ומבודדים למדידות. תאי גזע פלוריפוטנטיים נגזרו CMS הם בדרך כלל קטן יותר ויותר מעוגלים, חסרים את המורפולוגיה המלבנית המאפיין של myocytes לב מבוגר נוצר באופן מלא.
    6. הפוך את כל ההקלטות ב 37 ג. תיקון תאים בודדים באמצעות מהדק התא כולו במצב הנוכחי מהדק עם pipet זכוכית בורוסיליקט של 2-5 התנגדות MΩ. הפעל לחץ שלילי עדין להשיג חותם gigaohm לפני שתקבלו גישה התא כולו. להפעיל לחץ שלילי מהיר להיקרע קרום ולהשיג גישת תא כולו לפני הקלטת פוטנציאלים הממברנה.
    7. לעורר פוטנציאל פעולה באמצעות 4 msec depolarizing זריקות הנוכחית.
      הערה:עבור CMS הנגזרות PSC כמות הזרם הדרוש להפעלת reproducibly פוטנציאל פעולה עשוי להשתנות. על מנת למצוא הנוכחי סף אופטימלי, מתחיל ב משרעת נוכחי מפעילה נוכחית גידול נמוך יחסית באופן הדרגתי עד פוטנציאל פעולה לשחזור מתקבל.
      הערה: פעולת משכי פוטנציאל מיוציטים פרוזדורים הנגרמת Grem2 הם בדרך כלל בטווח של 20-40 ms וחסר בשלב מפנה (איור 6).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לפני בידול, תאי גזע פלוריפוטנטיים צריך להיות קומפקטי ללא התמיינות ספונטנית. התאים שמוצג באיור 1A מוכנים להיות singularized והשתמשו לתליית טיפות כמתואר 5.1 של סעיף פרוטוקול. התאים שמוצג באיור 1 הם המבדילים באופן ספונטני ולא אמור לשמש להכנת טיפות תלויות.

הפאנלים בנתון 2 התכנית יצרה בהצלחה EBS ביום בי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מייצר תרבויות שיגרתיות עם אחוז גבוה של CMS אופייניים שושלת הפרוזדורים. כמו עם כל פרוטוקול בידול, איכות mESCs לפני הבידול יש לתת תשומת לב מיוחדת. mESCs צריכה להיות במעקב שגרתי עבור מורפולוגיה נכונה (איור 1 א). כל התמיינות ספונטנית המתרחשת לפני ההיווצרות של EBS קשות תגביל את היעילות של cardiogenesis, ויש להסירם לפני passaging (1B איור). גודל EB משפיע גם cardiogenesis. מספרים סלולריים החל בין 200 ל -1,000 EB נבדקו 500 תאים לכל EB שגרתי מי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברי כתב היד הזה אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי HL083958 מענקי NIH ו HL100398 (AKH) ו 2T32HL007411-33 "תכנית ב מנגנוני לב וכלי דם: הכשרת החקירה" (JB).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
GMEMLife Technologies11710
FBSLife Technologies10082
GlutamaxLife Technologies35050
LIFEMD MilliporeESG1107
ß-MercaptoethanolSigmaM3148
IMDMSigmaI3390
חומצות אמינו לא חיוניותSigmaM7145
10 ס"מ צלחות תרבית רקמותSarstedt83.3902
10 ס"מ צלחות פטרי חיידקיותVWR25384-342
6 ס"מ צלחות פטרי חיידקיותVWR25384-092
צלחות תרבית רקמות 6 בארותSarstedt83.3920
Gremlin 2 חלבון רקומביננטיR& המגבר; D Systems2069-PR-050
יחידות סינון סטריליותתרמו פישר09-741-02
ג'לטין (מעור חזיר)SigmaG1890
10X PBS,סיגמא סטריליP5493
BSA Sigma5470
תמיסת 0.05% טריפסין-EDTALife Technologies25300054
DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיוםLife Technologies14200

מקורות

  1. Loya, K., Eggenschwiler, R., et al. Hepatic differentiation of pluripotent stem cells. Biological Chemistry. 390 (10), 1047-1055 (2009).
  2. Narazaki, G., Uosaki, H., et al. Directed and systematic differentiation of cardiovascular cells from mouse induced pluripotent stem cells. Circulation. 118 (5), 498-506 (2008).
  3. Zhang, Y., Pak, C., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  4. Park, I. H., Arora, N., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  5. Golos, T. G., Giakoumopoulos, M., Garthwaite, M. A. Embryonic stem cells as models of trophoblast differentiation: progress, opportunities, and limitations. Reproduction. 140 (1), 3-9 (2010).
  6. Boheler, K. R., Czyz, J., Tweedie, D., Yang, H. T., Anisimov, S. V., Wobus, A. M. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells Into cardiomyocytes. Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).
  7. Burridge, P. W., Anderson, D., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).
  8. Cai, C. L., Liang, X., et al. Isl1 Identifies a cardiac progenitor population that proliferates prior to differentiation and contributes a majority of cells to the heart. Developmental Cell. 5 (6), 877-889 (2003).
  9. Fujiwara, M., Yan, P., et al. Induction and enhancement of cardiac cell differentiation from mouse and human induced pluripotent stem cells with Cyclosporin-A. PLoS ONE. 6 (2), e16734(2011).
  10. Rai, M., Walthall, J. M., Hu, J., Hatzopoulos, A. K. Continuous antagonism by Dkk1 counter activates canonical wnt signaling and promotes cardiomyocyte differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells and Development. (1), 54-66 (2012).
  11. Burridge, P. W., Matsa, E., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  12. Lian, X., Zhang, J., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
  13. Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
  14. Tanwar, V., Bylund, J. B., et al. Gremlin 2 promotes differentiation of embryonic stem cells to atrial fate by activation of the JNK signaling pathway. Stem Cells. 32 (7), 1774-1788 (2014).
  15. Kattman, S. J., Witty, A. D., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
  16. Müller, I. I., Melville, D. B., et al. Functional modeling in zebrafish demonstrates that the atrial-fibrillation-associated gene GREM2 regulates cardiac laterality, cardiomyocyte differentiation and atrial rhythm. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 332-341 (2013).
  17. Kattamuri, C., Luedeke, D. M., Thompson, T. B. Expression and purification of recombinant protein related to DAN and cerberus (PRDC). Protein Expression and Purification. 82 (2), 389-395 (2012).
  18. Schulz, H., Kolde, R., et al. The FunGenES Database: A genomics resource for mouse embryonic stem cell differentiation. PLoS ONE. 4 (9), e6804(2009).
  19. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  20. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using Real-Time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  21. Beck, H., Semisch, M., Culmsee, C., Plesnila, N., Hatzopoulos, A. K. Egr-1 regulates expression of the glial scar component phosphacan in astrocytes after experimental stroke. American Journal of Pathology. 173 (1), 77-92 (2008).
  22. Graham, E. L., Balla, C., Franchino, H., Melman, Y., del Monte, F., Das, S. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
  23. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
  24. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
  25. Sachinidis, A., Fleischmann, B. K., Kolossov, E., Wartenberg, M., Sauer, H., Hescheler, J. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).
  26. Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 862-869 (1995).
  27. Höpfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Volume 2: molecular embryo analysis, live imaging, transgenesis, and cloning. Methods in Molecular Biology. , 254-279 (2004).
  28. Ao, A., Williams, C. H., Hao, J., Hong, C. C. Modified mouse embryonic stem cell based assay for quantifying cardiogenic Induction Efficiency. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
  29. Antonchuk, J., Gassmann, M., Desbaillets, I. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWell™ plates. Basic Cell Culture Protocols. 946, 523-533 (2013).
  30. Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells. Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Grem2Myh6 DSRed Nuc

מאמרים קשורים