ניתוח Clinicopathological ביטוי מירנה שד רקמות סרטן על ידי שימוש מירנה<em&gt; באתרו</em&gt; כלאה

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול לאיתור ביטוי miRNA בדגימות חולות סרטן השד באמצעות הכלאה של miRNA באתר.

תקציר

במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לזיהוי miRNA ברקמת סרטן השד באמצעות הכלאה באתרה עם בדיקת LNA (חומצת גרעין נעולה) עם תווית דיגוקסיגנין. הגשושית זוהתה על ידי נוגדנים לפוספטאז אלקליין נגד DIG ופותחה מאוחר יותר באמצעות מצע פוספטאז אלקליין המייצר אותות פלואורסצנטיים. כאן השתמשנו בטכניקת miRNA in situ hybridization (MISH) כדי לנתח ביטוי של miR-489 ברקמות של חולות סרטן השד. טכניקה זו יכולה לזהות לוקליזציה של miRNA מעניין בדגימות רקמה בודדות. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי להשוות את הביטוי של miRNA רצוי ברקמת הגידול לזה ברקמה נורמלית סמוכה ולזהות את המבנים הספציפיים האחראים לביטוי miRNA זה. טכניקה זו יכולה להיות שימושית מאוד במענה על שאלות קליניות מסוימות, כגון תפקידו של miRNA ספציפי בהתפתחות סרטן. התוצאות שלנו מצביעות על כך שתאי אפיתל חלב מבטאים רמות גבוהות משמעותית של miR-489 מאשר תאי גידול סמוכים.

מבוא

סרטן השד הוא בין סוגי הסרטן הנפוצים ביותר המשפיעים על האוכלוסייה הנשית על פני הגלובוס. יותר מ -1.3 מיליון מקרים של סרטן השד מדווחים מדי שנה ברחבי עולם ^1,2. למרות תאים סרטניים נחשבו באופן מסורתי כמו ביולוגית הומוגנית מאוד שגשוג, זה הפך להיות ברור כי סרטן השד הוא גנטי קליני הטרוגנית. עמידות לתרופות אנטי סרטניות רווחות היא סימן היכר של סרטן השד מתקדם, שמובילה את התמותה ברוב המכריע של מטופלים באמצעות הסיוע של גרורות מרחק התקדמות וסרטן ^3.

מיקרו RNA (miRNAs) הם קבוצה של מולקולות RNA קטנות כ 22 נוקליאוטידים המווסתים ביטוי גנים על ידי חסימת תרגום....

פרוטוקול

מחקר זה אושר על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדית של בית החולים האוניברסיטאי הלאומי Chonnam הוואסון ואונ' הדרום קרוליינה. דגימות TMA מורכבות סרטן שד רקמות שד נורמלים סמוכות מתאימות נמסרו על ידי Biobank של חולי הוואסון אונ' הלאומיים Chonnam, חבר ברשת Biobank קוריאה.

1. פתרון כנה

1. כן 1 ליטר מים חינם DNase ו RNase. הפוך את כל תמיסות כימיות באמצעות diethylpyrocarbonate (DEPC) מים מטופלים. פנקו 1 ליטר מים עם 500 μl של DEPC דגירה במשך 3 שעות בטמפרטורת החדר. חיטוי המים כדי ל....

תוצאות

רקמת סרטן שד אדם שמשה כדי לקבוע ביטוי מירנה-489. צינור בלוטת חלב ותאי אפיתל נמצאו להביע מירנה-489 גבוהות משמעותי רמות מאשר רקמת גידול סמוכה בשני חולים (איור 1A ו -1 B). זה מראה בבירור כי ביטוי מירנה-489 אבד רקמת גידול, דבר המצביע על פעילות מדכאת גידול של מירנה-489. כדי להמשיך לאשר את הממצאים, רקמת הגידול לבין רקמות בריאות סמוכות מאותו החולה הושוו. כפי שנצפה באיור 2 א ו -2, רקמות בר.......

דיון

מטרת המחקר הנוכחי הייתה לקבוע את רמת הביטוי מירנה ברקמות סרטן השד באמצעות מירנה הכלאה באתרה. יש לציין כי בניסוי זה, כל התנאים היו אופטימיזציה עבור רקמת סרטן השד. אופטימיזציה נוספת עשויה להידרש סוגי רקמות אחרות. כל הפתרונות חייב להיעשות עם מים DEPC וכל מכולות לשמש יש לשטוף עם מים מטופלים DEPC ובהמשך autoclaved. אפילו קל זיהום RNase יכול להפריע את התוצאה הסופית של הניסוי. כפי מירנה הוא רצף קצר מאוד, יש צורך להשתמש חללית LNA כדי להקל הכלאה טובה יותר עם המטרה. יתר על כן, לאחר.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ELF-97	טכנולוגיית חיים	E6604
50x Denhard't	טכנולוגיית חיים
t-RNA	רוש	109541	להרכיב מחדש במי DEPC
הרינג זרע DNA	פרומגה	D1815
חסימת רוש	Roche	11096176001
RVC	Fisher	50-812-650	לפני השימוש סובב אותו ב-16.1 RCF וקח supernatant
בדיקה miR-489	Exiqon	38599-01
BSA Roche ללא נוקלאז
נוגדן ראשוני-אנטי DIG	Roche
דיאתיל פירוקרבונט	סיגמא	1609478

75001871145411093274910