ניתוח Clinicopathological ביטוי מירנה שד רקמות סרטן על ידי שימוש מירנה<em&gt; באתרו</em&gt; כלאה

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול לאיתור ביטוי miRNA בדגימות חולות סרטן השד באמצעות הכלאה של miRNA באתר.

תקציר

במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לזיהוי miRNA ברקמת סרטן השד באמצעות הכלאה באתרה עם בדיקת LNA (חומצת גרעין נעולה) עם תווית דיגוקסיגנין. הגשושית זוהתה על ידי נוגדנים לפוספטאז אלקליין נגד DIG ופותחה מאוחר יותר באמצעות מצע פוספטאז אלקליין המייצר אותות פלואורסצנטיים. כאן השתמשנו בטכניקת miRNA in situ hybridization (MISH) כדי לנתח ביטוי של miR-489 ברקמות של חולות סרטן השד. טכניקה זו יכולה לזהות לוקליזציה של miRNA מעניין בדגימות רקמה בודדות. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי להשוות את הביטוי של miRNA רצוי ברקמת הגידול לזה ברקמה נורמלית סמוכה ולזהות את המבנים הספציפיים האחראים לביטוי miRNA זה. טכניקה זו יכולה להיות שימושית מאוד במענה על שאלות קליניות מסוימות, כגון תפקידו של miRNA ספציפי בהתפתחות סרטן. התוצאות שלנו מצביעות על כך שתאי אפיתל חלב מבטאים רמות גבוהות משמעותית של miR-489 מאשר תאי גידול סמוכים.

מבוא

סרטן השד הוא בין סוגי הסרטן הנפוצים ביותר המשפיעים על האוכלוסייה הנשית על פני הגלובוס. יותר מ -1.3 מיליון מקרים של סרטן השד מדווחים מדי שנה ברחבי עולם ^1,2. למרות תאים סרטניים נחשבו באופן מסורתי כמו ביולוגית הומוגנית מאוד שגשוג, זה הפך להיות ברור כי סרטן השד הוא גנטי קליני הטרוגנית. עמידות לתרופות אנטי סרטניות רווחות היא סימן היכר של סרטן השד מתקדם, שמובילה את התמותה ברוב המכריע של מטופלים באמצעות הסיוע של גרורות מרחק התקדמות וסרטן ^3.

מיקרו RNA (miRNAs) הם קבוצה של מולקולות RNA קטנות כ 22 נוקליאוטידים המווסתים ביטוי גנים על ידי חסימת תרגום mRNA או בתיווך mRNA השפלה ^4. יותר מ -2,000 miRNAs השונה עד כה זוהה בבני אדם, אשר מקושרים מחל אנושיות ^5. מערך הולך וגדל של מחקרים havהדואר הוכיח כי miRNAs יכול לתפקד כמו מוטציות מדכאי גידול ובדר"כ dysregulated בגידולים ^6. miRNAs מאוד להשפיע כל tumorigenesis העיקרי על ידי שליטה על הרגולטורים העיקריים של התקדמות מחזור התא, הזדקנות, אפופטוזיס autophagy, יחד עם אלה של תנועתיות תאים סרטניים, פלישה גרורה ^7.

ביטוי Aberrant מירנה נקשר גם עם השלכות קליניות כגון במה, בידול, הפרוגנוזה ואת תגובה לטיפול אדג'ובנטי ^8. בפרט, גדל ביטוי miR-146 הוא מתואם עם פרוגנוזה גרועה בחולי סרטן ריאות ^9. מחקר אחר הראה כי ביטוי אבוד של מירנה-let7b קשור פנוטיפים ממאירים, וכתוצאה מכך, ⁶ הישרדות עניה. הבנת הסוגים של תאים ומבנים מבטאים miRNAs היא חלק חשוב להבין את המכניקה שדרכו שינויים בתא השפעת ביטוי מירנהרקמת פנוטיפים ^10. miRNAs מסוים מצא להיות מופרשים בתאי סטרומה נלקח על ידי תאי אפיתל ולפעול עליהם במיוחד את המטרות שלהם. באותה רוח, miR-212 ומיר-132 מופרשים על ידי stroma ולהסדיר את אינטראקציות סטרומה אפיתל הנדרשים תולדה ductal במהלך התפתחות בלוטת החלב ^11. המטרה הכללית של מאמר זה היא להסביר פרוטוקול מפורט לזהות ביטוי מירנה ברקמות סרטן השד באמצעות מירנה הכלאה באתרה. יש לנו אופטימיזציה כל התנאים כדי assay את רמות ביטוי מירנה-489 בדגימות חולות סרטן השד. לשם כך, השתמשנו DIG שכותרתו נעול חומצות גרעין (LNA) בדיקה בניסוי שלנו. חלק נוקלאוטידים המקורי היה שינוי LNA, כלומר, גשר מתילן חיבור 'אטום חמצן 4' 2 אטום פחמן של עמוד השדרה ריבוז שמתקן נוקלאוטיד כזה שהוא נשאר "נעול במקום" לאחר כלאה. כתוצאה מכך, זה הרבה יותר קשהעבור מתחם ההכלאה לפגל ^12,13.

פרוטוקול

מחקר זה אושר על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדית של בית החולים האוניברסיטאי הלאומי Chonnam הוואסון ואונ' הדרום קרוליינה. דגימות TMA מורכבות סרטן שד רקמות שד נורמלים סמוכות מתאימות נמסרו על ידי Biobank של חולי הוואסון אונ' הלאומיים Chonnam, חבר ברשת Biobank קוריאה.

1. פתרון כנה

1. כן 1 ליטר מים חינם DNase ו RNase. הפוך את כל תמיסות כימיות באמצעות diethylpyrocarbonate (DEPC) מים מטופלים. פנקו 1 ליטר מים עם 500 μl של DEPC דגירה במשך 3 שעות בטמפרטורת החדר. חיטוי המים כדי להשבית DEPC.
   זהירות: אין לשאוף DEPC מאחר וידוע מסרטן.
2. הכן PBS 1x מ 10x PBS באמצעות מים מטופלים DEPC.
3. הכן 20x SSC (לפזר 175.3 גרם של NaCl ו 88.2 גרם של נתרן ציטראט ב 800 מ"ל מים, להתאים את ה- pH ל 7.0 עם ירידה כמה 14 N פתרון של HCl ולהתאים את עוצמת הקול עד 1 ליטר עם וואטאה), 4% paraformaldehyde, 95% אתנול, 80% אתנול באמצעות מים מטופלים DEPC.
4. הוסף 8 מ"ל של triethanolamine ו -1.05 מ"ל של HCl ב 590 מ"ל מים DEPC שטופלו ולהוסיף 1.5 מ"ל של אנהידריד אצטית עבור acetylation.
5. הכן 50 מיקרוגרם / μl proteinase K במאגר (50 mM Tris-HCl, pH 8.0 ב DEPC מים מטופלים).
6. הכן חיץ הכלאה מורכב 500 μl של לפוראמיד, 250 μl של 20x SSC, 100 μl של 50x פתרון של Denhardt, 12.5 μl של t-RNA, 2.5 μl של ה- DNA זרע הרינג, 30 μl של RVC, 0.02 גרם של מגיב חסימת 50 μl מי DEPC. כן טרי.

2. סעיפי רקמות שד

1. חותכי 5 מיקרומטר קבוע פורמלין חלקי פרפין מוטבע עם microtome ולהחיל את הסעיף לחייב שקופית ^14.
   הערה: רקמת השד משמש כאן הוכנה בעבר מרשת Biobank קוריאה.

3. רקמות הכנה

1. הסר פרפין הלוך ושובמ הרקמה ידי טבילה שקופיות לתוך 2x צנצנת Coplin קסילן טרי במשך 10 דקות כל אחד ו רעננותם קטע רקמה על ידי 5 incubations דקות בהפחתת ריכוזי אתנול (100%, 95% ו -80%) ב DDH ₂ O. בצע פעולה זו במנדף.
2. לטבול את רקמת DEPC מי מטופלים במשך 5 דקות. בשלב זה יש לבצע גבולות סביב קטע רקמה עם עט מחסום הידרופובי.
3. לתקן את הרקמה עם 4% PFA במשך 15 דקות ואחריו לשטוף עם PBS.
4. לטבול את הרקמה ב 0.3% Triton X-100 / PBS במשך 10 דקות ואחריו לשטוף עם PBS.
5. דגירה המדגם עם 50 מיקרוגרם / פתרון μl proteinase K עבור 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. ואז דגירה סעיפים רקמה עם triethanolamine ו אנהידריד אצטית עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, ואחריו לשטוף עם PBS. אין לשטוף PBS נדרשת בין טיפול proteinase K ו triethanolamine / טיפול אנהידריד אצטית.

הכלאה 4.

1. שטפו את הרקמה ביסודיות incuבייט בסעיף רקמות עם חיץ הכלאה ל -2 עד 3 שעות בטמפרטורת החדר. בדרך כלל 120 חיץ הכלאה μl הוא מספיק כדי לכסות את קטע רקמה.
2. לדלל 5'-DIG שכותרתו בדיקה LNA כדי הריכוז הסופי של 3 PM ב 120 פתרון הכלאה μl. ככל ריכוז המניות בדרך כלל הוא 40 ng / μl, להוסיף 3 μl של המניה ל -120 μl חיץ הכלאה ו דגירה התערובת על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
3. קטע רקמת דגירה עם הלילה חללי על 54 מעלות צלזיוס (Tm) בתא לח. בדרך כלל 120 μl הוא מספיק כדי לכסות חלק אחד. צור לחות באמצעות שתי מגבות נייר רטובות. הגודל האידיאלי של החדר הוא 10 אינץ 'על 8 אינץ'.
4. הערה:'אני עשוי להיות שונה עבור מירנה שונה. 54 ° C הוא אזכורים עבור miR-489.

5. חומרא Wash

1. שטוף את הרקמה עם 5x SSC עבור 7 דקות (לאחר שלב הכלאה, תנאים חינם RNase אינם נחוצים עוד?).
2. שטפו את השנינות קטע רקמהh 1x SSC עבור 7 דקות פעמיים ב 57 ° C.
3. שטפו את קטע רקמה עם SSC 0.2X עבור 7 דקות ב 57 מעלות צלזיוס.
4. שטפו את קטע רקמה עם SSC 0.2X עבור 7 דקות בטמפרטורת החדר.
5. קטע רקמה מדגירים PBS במשך 10 דקות.

6. חסימה

1. דגירה קטע רקמה עם חסימת חיץ בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 בתא לח (כדי להפוך חיץ חסימת להוסיף 2 FBS מ"ל, 10 μl של Tween-20 ו -3 μl של BSA ב -18 מ 'של PBS. חסימת חנות חיץ ב 4 מעלות צלזיוס).

7. דגירה נוגדן ראשוני ופיתוח

1. לדלל 1: 300 נוגדן אנטי DIG-AP בחסימת מאגר דגירת קטע הרקמה עם נוגדן ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
2. שטוף את החלקים עם חיץ לשטוף 3 פעמים, במשך 5 דקות כל אחד (חיץ שמספק ערכת פיתוח).
3. לפתח את קטע הרקמה עם ערכה מסחרית עבור phosphatase אלקליין שמייצר אור פלורסנט CY-3.
4. שטף את החלק עם חיץ לשטוף למשך 5 דקות. סעיף הכתם עם 100 μl של 2.5 ng / לצבוע Hoechst μl במשך 5 דקות ואחריו לשטוף 5 דקות עם חיץ לשטוף.
5. הר הקטע עם הרכבת חיץ על פי הפרוטוקול של היצרן. השתמש 15 μl לכל קטע רקמה ולנגב פתרון הרכבה מוגזם עם רקמת לנגב. חותם את השקופית עם לק ברור למנוע דולף.
6. שימו מיקרוסקופ פלורסנט סעיף משתמש עם 10X עדשה כך שסך כל ההגדלה היא 100X.

תוצאות

רקמת סרטן שד אדם שמשה כדי לקבוע ביטוי מירנה-489. צינור בלוטת חלב ותאי אפיתל נמצאו להביע מירנה-489 גבוהות משמעותי רמות מאשר רקמת גידול סמוכה בשני חולים (איור 1A ו -1 B). זה מראה בבירור כי ביטוי מירנה-489 אבד רקמת גידול, דבר המצביע על פעילות מדכאת גידול של מירנה-489. כדי להמשיך לאשר את הממצאים, רקמת הגידול לבין רקמות בריאות סמוכות מאותו החולה הושוו. כפי שנצפה באיור 2 א ו -2, רקמות בר...

דיון

מטרת המחקר הנוכחי הייתה לקבוע את רמת הביטוי מירנה ברקמות סרטן השד באמצעות מירנה הכלאה באתרה. יש לציין כי בניסוי זה, כל התנאים היו אופטימיזציה עבור רקמת סרטן השד. אופטימיזציה נוספת עשויה להידרש סוגי רקמות אחרות. כל הפתרונות חייב להיעשות עם מים DEPC וכל מכולות לשמש יש לשטוף עם מים מטופלים DEPC ובהמשך autoclaved. אפילו קל זיהום RNase יכול להפריע את התוצאה הסופית של הניסוי. כפי מירנה הוא רצף קצר מאוד, יש צורך להשתמש חללית LNA כדי להקל הכלאה טובה יותר עם המטרה. יתר על כן, לאחר...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ELF-97	טכנולוגיית חיים	E6604
50x Denhard't	טכנולוגיית חיים
t-RNA	רוש	109541	להרכיב מחדש במי DEPC
הרינג זרע DNA	פרומגה	D1815
חסימת רוש	Roche	11096176001
RVC	Fisher	50-812-650	לפני השימוש סובב אותו ב-16.1 RCF וקח supernatant
בדיקה miR-489	Exiqon	38599-01
BSA Roche ללא נוקלאז
נוגדן ראשוני-אנטי DIG	Roche
דיאתיל פירוקרבונט	סיגמא	1609478

75001871145411093274910