מאמר שיטה

ויזואליזציה של התחדשות כלי דם Parenchymal לאחר 70% חלקיות כריתה בעכברים נורמליים

DOI:

10.3791/53935

⸱

13 בספטמבר 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General, Visceral and Vascular Surgery, Jena University Hospital, 2Experimental Molecular Imaging, RWTH Aachen University, 3Fraunhofer Institute for Medical Image Computing MEVIS, 4Institute of Pathology, Klinikum Chemnitz gGmbH

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כלים המשמשים להמחשת התחדשות כלי הדם דורשים שיטות לניגוד עצי כלי הדם. סרט זה הדגים טכניקת הזרקה עדינה המשמשת להשגת ניגודיות אופטימלית של עצי כלי הדם וממחיש את היתרונות הפוטנציאליים הנובעים מניתוח מפורט של הדגימה המתקבלת באמצעות μCT וחתכים סדרתיים היסטולוגיים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הליך הזרקת סיליקון שונה שמש להדמיה של עץ כלי הדם בכבד. הליך זה כלל הזרקה ב- vivo של מתחם סיליקון, באמצעות קטטר 26 G, לתוך הפורטל או הווריד כבד. לאחר הזרקת סיליקון, האיברים היו explanted והכינו לסריקה לשעבר vivo מיקרו-CT (μCT). ההליך הזרקת סיליקון הוא מאתגר מבחינה טכנית. השיג תוצאה מוצלחת דורש ניסיון microsurgical נרחב של המנתח. אחד האתגרים של הליך זה כרוך בקביעת שיעור זלוף ההולם במתחם סיליקון. שיעור זלוף עבור מתחם סיליקון צריך להיות מוגדר על בסיס המודינמי של מערכת כלי הדם של עניין. שיעור זלוף לא ראוי יכול להוביל זלוף שלם, התרחבות מלאכותית פקיעת עצים וסקולרית.

שחזור 3D של מערכת כלי הדם התבסס על בדיקות CT ו הושג באמצעותתוכנת פרה-קלינית כגון HepaVision. איכות עץ כלי הדם המשוחזר הייתה קשורה ישירות לאיכות זלוף סיליקון. בהמשך מחושבים פרמטרים וסקולרית מעידים על צמיחה של כלי דם, כגון נפח כלי דם הכולל, חושבו על בסיס השחזורים וסקולרית. הניגודיות את העץ וסקולרית עם סיליקון מותר לעבודה-אפ היסטולוגית עוקב של הדגימה לאחר סריקת μCT. הדגימה יכולה להיות נתונה חתך סדרתי, ניתוח היסטולוגית וסריקה השקופית כולה, ולאחר מכן כדי שחזור 3D של העצים וסקולרית המבוססת על תמונות היסטולוגית. זהו התנאים ההכרחיים לצורך זיהוי של אירועים מולקולריים והפצתי ביחס עץ כלי הדם. הליך להזרקת סיליקון שונה זה יכול לשמש גם כדי לחזות לשחזר את מערכות כלי הדם של איברים אחרים. טכניקה זו יש פוטנציאל להיות מיושם באופן נרחב כדי מחקרים לגבי האנטומיה של כלי הדם וצמיחה בתוך בעלי חיים שוניםמודלים המחלה nd.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התחדשות כבדה לעתים קרובות נקבעת על ידי מדידת העלייה במשקל כבד נפח על ידי בחינה של קצב התפשטות hepatocyte 16. עם זאת, התחדשות כבדה אינה רק גרימת התחדשות parenchymal אבל גם 6 התחדשות כלי דם. לכן, צמיחה של כלי דם צריכה להיחקר נוסף באשר לתפקידה בהתקדמות של התחדשות כבדה. ויזואליזציה של מערכת כלי דם בכבד היא קריטית לקידום הבנתנו התחדשות כלי דם. רבים בשיטות עקיפות פותחו כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס של התחדשות כלי הדם בכבד. באופן מסורתי, זיהוי של ציטוקינים (פקטור הגדילה של אנדותל כלי הדם, VEGF) 14, כמוקינים ואת הקולטנים שלהם (CXCR4 / CXCR7 / CXCL12) 4 היו עמוד התווך ללימוד התחדשות כלי הדם. עם זאת, מודל 3D יחד עם ניתוח כמותי של כלי הדם יוסיף אנטומיים קריטימידע כדי להשיג הבנה טובה יותר של מערכת היחסים החשובים בין parenchymal הכבד והתחדשות כלי דם.

כדי להמחיש את מערכת כלי דם בכבד, מחייב מנוגדי העצים וסקולרית, עכברים הזריקו חומר ניגוד גומי סיליקון radiopaque ישירות לתוך הפורטל או עץ כלי דם מוריד בכבד. לאחר פילמור של סיליקון explantation של האיבר, הדגימות הכבדות היו נתוני סריקת μCT באמצעות סורק CT. הסריקות הביאו ייצוגי תמונת voxel של הזרקת סיליקון דגימות 9.

עבור בקרת איכות, מערכת כלי הדם הייתה מדמיין הראשון 3D באמצעות תוכנת פרה-קלינית. פילוח בוצע על ידי קביעת סף בין עוצמת רקמות הרכה לבין עוצמת הכלי. מסכת הכלי וכתוצאה מכך הייתה דמיינה באמצעות טיוח משטח. התוכנה אפשרה גם זיהוי ידני של שני פרמטרים של vasculצמיחת ar: Vessel אורך מקסימאלי ורדיוס.

תוכנת פרה-מכן שמשה שחזור 3D של עצים וסקולרית והחישוב הבא של השטחים וסקולרית באספקה ​​או ניקוז 13. בנוסף, תוכנה זו באופן אוטומטי נקבעה פרמטרים מסוימים של צמיחה של כלי דם, כגון האורך הכולל של כל המבנים וסקולרית הגלויים הידוע גם בשם אורך הקצה המוחלט או נפח כלי כולל.

הליך סיליקון זלוף בוצע בעכברים נאיביים בעכברים שעברו 70% כריתה חלקית (PH). כבד נאספו בנקודות שונות מדידה לאחר כריתה לניתוח ההתחדשות כבדה של כלי דם ואת parenchymal בטכניקה להדמיה וכימות הנ"ל.

המטרות העיקריות של הסרט הזה הן: (1) להדגים את טכניקת ההזרקה העדינה נדרשה להשיג מנוגדים אופטימליים (2) הצגת תרומה האפשרית כתוצאת frאום ניתוח מפורט של הדגימה וכתוצאה מכך באמצעות μCT וחתכים סדרתי היסטולוגית. לאחר הצפייה בסרט זה, הקורא צריך להיות בעל הבנה טובה יותר של כיצד להזריק תרכובת סיליקון לתוך מערכת כלי דם ספציפית של תועלת תחולתה של הטכניקה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנהלים הקשורים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz ה"אבטיילונג" Tiergesundheit und Tierschutz, גרמניה. מכיוון וריד השער היה דמיין בנפרד ממערכת ורידי הכבד, חיות נפרדות דרושי העצים וסקולרית השונים.

1. ריאגנטים כן

  1. פתרון הפרין-מלוחה
    1. להוסיף 0.1 מ"ל הפרין לתוך מלוחים 10 מ"ל (5 IU / ml).
  2. תערובת תרכובת סיליקון
    1. הוסף 2 מ"ל MV-120 בצינור אחד 5 מ"ל. לדלל MV-120 על ידי הוספת diluent 3 מ"ל MV וכתוצאה מכך פתרון 40%.

2. הזרקת סיליקון מערכת פורטל הוורידים

  1. פיום
    1. מניחים את העכבר בתא אינדוקציה הרדמה לטשטש את זה עם 2% isoflurane ו 0.3 L / min חמצן.
    2. תקן את העכבר מורדם על שולחן הניתוחים באמצעות קלטת עם שאיפה מתמדת של 2% הםoflurane וחמצן 0.3 ליטר / דקה. בדוק את רפלקס נסיגה הבוהן קמצוץ של העכבר ולהתחיל במבצע אם רפלקס נעדר.
    3. ביצוע חתך רוחבי על הבטן באמצעות מספריים עבור שכבת העור וכן coagulator חשמלי עבור שכבת השריר. הזז את המעיים אל הצד השמאלי באמצעות טיפי כותנה ולכסות את המעיים עם גזה מלוחה ספוג.
  2. החדרת צנתר
    1. לנתח וריד השער תחת מיקרוסקופ באמצעות מיקרו-מלקחיים. מניחים תפר משי אחד 6-0 מתחת וריד שער extrahepatic, מרחק כ 1 מ"מ עד הסתעפות שלה ולקשור אותו באופן רופף לשימוש מאוחר יותר.
    2. להזריק פתרון הפרין-מלוח מוכן באמצעות וריד פין (זכר) או וריד נבוב נח (נקבה) עבור heparinization המערכתית במשך 5 דקות.
    3. הכנס את מד 26 (26 G) קטטר עם מחט לווריד פורטל ולתקן אותה עם מלחציים
  3. הפרין-מלוח פתרון זלוף סיליקון תרכובת
    1. סול הפרין-מלוח טעןution ב מזרק 5 מ"ל ולהדליק המכשיר זלוף. מלאו את הקטטר מלא עם פתרון הפרין-מלח כדי למנוע בועות אוויר.
    2. חבר צינור רחבת הקטטר ולתקן אותם בחוזקה. התחל זלוף מלוחים הפרין עם שיעור זלוף של 0.4 מ"ל / דקה.
    3. תפר משי מראש להציב ולקשור 6-0 בכפול לתקן את הקטטר וחסימת זרימת הדם מן הווריד הטחול וריד mesenteric. Euthanatize את העכבר על ידי exsanguination דרך זלוף בהרדמה.
    4. יש לשטוף את הכבד באמצעות מי מלח במהלך ההליך זלוף כולו כדי לשמור אותו לח.
    5. להוסיף 0.1 מ"ל סוכן ריפוי לתוך הצינור MV-120. שנת מזרק מלוח הפרין כדי מזרק סיליקון.
    6. התחל זלוף סיליקון עם שיעור זלוף של 0.2 מ"ל / דקה במשך כ 1 דקות כדי ולמלא מראש את מערכת קטטר וכדי למלא את מערכת וריד השער. עצור זלוף סיליקון כאשר הכלי על המשטח להכחיל.
  4. דְגִימָה
    1. שמור את הכבד in-situ until הסיליקון הוא polymerized מלא לאחר כ 15 עד 30 דקות. לנתח רצועות חיבור כבד ואיברים סמוכים בזהירות כדי לשמור כבד פגע. Explant הכבד והכניס אותו לתוך פורמלין עבור קיבעון.

3. הזרקת סיליקון מערכת הוורידים כבדיה

  1. בצע laparotomy כפי שבוצעה בשלב 2.1 ולחשוף שדה הניתוח באופן מלא.
  2. החדרת צנתר
    1. לנתח וריד השער תחת מיקרוסקופ באמצעות מיקרו-מלקחיים. מניחים תפר משי אחד 6-0 מתחת וריד שער extrahepatic, מרחק כ 1 מ"מ עד הסתעפות שלה ולקשור אותו באופן רופף לשימוש מאוחר יותר.
    2. להזריק פתרון הפרין-מלוח מוכן באמצעות וריד פין (זכר) או וריד נבוב נח (נקבה) עבור heparinization המערכתית במשך 5 דקות.
    3. הכנס אחד 26 G קטטר (צנתר 1) עם מחט לווריד פורטל ולתקן אותה עם מהדק. הכנס 26 אחר קטטר G (קטטר 2) עם מחט לתוך וריד נבוב נח ולתקן אותה עם מלחציים.
    4. ולקשור את ענפי וריד נבוב נח (כוללים ורידי כליות שמאל וימין) ואת הקצה הדיסטלי שלה באמצעות 6-0 סינטטי, monofilament, תפר פוליפרופילן nonabsorbable.
  3. הפרין-מלוח פתרון זלוף סיליקון תרכובת
    1. טען תמיסת מלח-הפרין מזרק 5 מ"ל ולהדליק המכשיר זלוף. מלאו קטטר 1 לחלוטין עם פתרון הפרין-מלח כדי למנוע בועות אוויר. חבר צינור רחב קטטר 1 ולתקן אותה בחוזקה. התחל זלוף מלוחים הפרין בשיעור של 0.4 מ"ל / דקה.
    2. תפר משי מראש להציב ולקשור 6-0 בכפול לתקן את הקטטר וחסימת זרימת הדם מן הווריד הטחול וריד mesenteric. Euthanatize את העכבר על ידי exsanguination דרך זלוף בהרדמה.
    3. יש לשטוף את הכבד באמצעות מי מלח במהלך ההליך זלוף כולו כדי לשמור אותו לח. להוסיף 0.1 מ"ל סוכן ריפוי לתוך הצינור MV-120. שער הפרין מלוח מזרק עם מזרק סיליקון.
    4. מניחים מהדק על suprahepatic נחות וריד נבוב להכשיל את היצוא של הכבד.
    5. חבור את הצינור הרחב קטטר 2 ולהתחיל זלוף סיליקון עם שיעור זלוף של 0.2 מיליליטר / דקה במשך כ 2 דקות כדי להגיע נפח כלי דם בכבד אובייקטיבי כפי שדווח. עצור זלוף סיליקון כאשר הכלי על המשטח להכחיל.
  4. דְגִימָה
    1. לנתח רצועות כבדות להימנע מכל פגיעה בכבד. Explant הכבד והכניס אותו לתוך פורמלין עבור קיבעון.

סריקה 4. Micro-CT (μCT)

כדי לסרוק המדגם הכבד explanted באמצעות μCT, השלבים הבאים נדרשים.

  1. קח המדגם הכבד מתוך פתרון הקיבעון. מניחים את הכבד על המיטה μCT. שים את המיטה μCT עם המדגם הכבד לתוך μCT.
  2. רוכשת topogram לפני תחילת הסריקה. השתמש subscan אחד למדגם הכבד הקטן והשני subscans עבור מדגמים גדולים.
  3. בחר81; פרוטוקול CT עם רזולוציה גבוהה (למשל, HQD-6565-390-90). פרוטוקול זה רוכש 720 תחזיות עם 1,032 x 1,012 פיקסלים במהלך סיבוב מלא אחד עם זמן הסריקה של 90 שניות לכל סריקת משנה. התחל את הסריקה μCT.

5. סעיפים סידורי היסטולוגית

  1. הטמע את הדגימה הכבדה פרפין בכללותו לאחר סריקת μCT. חותכים מדגם פרפין כולו למקטעים 4μm, והתוצאה היא סדרה של 2,000 עד 2,500 חלקים.
  2. סעיפי כתם עם טכניקה מכתימה מתאימה לדמיין אירועים מולקולריים של עניין כגון Ki-67 כסמן התפשטות HMGB1 כסמן של ניזק איסכמי. לקבוע רצף של מכתים בגין לשאלה מדעית.
  3. השתמש בסורק שקופיות שלם digitalize בסעיפים המוכתמים.
  4. בצע עץ 3D-מחדש של כלי דם (ים) (כבר ריאלי) ולדמיין-הפצת 3D של אירועים מולקולריים בגין לעץ וסקולרית (מחקר בתהליך).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קריטריוני איכות

איכות הזרקת סיליקון אפשר לשפוט בעין בלתי מזוינת במהלך ההליך. הכלי הקטן על פני שטח כבדים למלא בהדרגה עם התרכובת הכחולה. אם מבנה כלי הדם הנורמלי נצפה על פני השטח הכבדים, איכות הזרקת גומי סיליקון הייתה טובה. אם נפח זלוף היה די בכל אלה, הספינות הקטנות על פני השטח הכבדים לא מולאו במלואן. לעומת זאת, במהלך המילוי שנגרם קרע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הניגודיות את עץ כלי הדם על ידי הזרקת סיליקון וסריקה μCT כבר הציג מודלים הגידול ומודלים מחלה נוירולוגית לעתים קרובות כדי ללמוד את התקדמות angiogenic 5,7,8,10. שיפורים במתודולוגיה של הזרקת סיליקון נעשו במחקר הנוכחי המאפשרים הדמיה לכימות צמיחה של כלי דם לאחר כריתה חלקית בעכברים.

ישנם מספר שלבים קריטיים הדורשים תשומת לב כדי להשיג איכות זלוף טוב. heparinization קודם כל, המערכתי מומלץ מאוד לפני השטיפה כבדה ע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מכירים במימון של משרד החינוך והמחקר הגרמני (BMBF) באמצעות רשת הביולוגיה המערכתית "כבד וירטואלי", מספרי המענקים 0315743 (ExMI), 0315765 (UK Jena), 0315769 (MEVIS). המחברים מודים גם לפרנק שוברט על התמיכה הטכנית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
PERFUSOR® VIB.BRAUN87 222/0
Pipetus®-akkuHirschmann9907200
PipetsGreiner606180
מספריים מיקרו כליםמדעיים עדינים (F· S· L)מס' 14058-09
micro serrefineFine Science Tools (F· S· L)מס' 18055-05
מוליך מיקרו מהדקיםכלי מדע עדינים (F· S· L)מס' 18057-14
מיקרו מלקחיים ישריםכלים מדעיים עדינים (F· S· L)מס' 00632-11
מיקרו מלקחיים מעוקליםכלים מדעיים עדינים (F· S· L)מס' 00649-11
מחזיק מחטכלים מדעיים עדינים (F· S· L)מס' 12061-01
מזרק 1 מ"לB.Braun9161406V
מזרק 5 מ"לB.Braun4606051V
קווי הארכה וחיבורB.Braun425600030 ס"מ, פנימי ו-oslash; 1.2 מ"מ
6-0 משי (Perma-Hand Seide)Ethicon639H
6-0 proleneEthicon8711H
מיקרופיל ® מדלל MVFLOW TECH, INC
Microfil® MV - 120FLOW TECH, INCMV - 120 (כחול)
חומר ריפוי MVFLOW TECH, INC
Heparin 2500 IE/5 מ"לRotexmedicaETI3L318-15
SalineFresenius Kabi Deutschland GmbHE15117/D DE
Imalytics תוכנה פרה-קליניתהדמיה מולקולרית ניסיונית, RWTH אוניברסיטת אאכן, גרמניה
HepaVisionFraunhofer MEVIS, ברמן, גרמניה
NanoZoomer 2.0-HT  סורק שקופיות דיגיטליHamamatsu Electronic Press, יפן C9600
טומוסקופ דואו CT CT Imaging GmbH, Erlangen, גרמניהTomoScope®   סינרגיה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bearden, S. E., Segal, S. S. Neurovascular alignment in adult mouse skeletal muscles. Microcirculation. 12 (2), 161-167 (2005).
  2. Brown, R. P., Delp, M. D., Lindstedt, S. L., Rhomberg, L. R., Beliles, R. P. Physiological parameter values for physiologically based pharmacokinetic models. Toxicol.Ind.Health. 13 (4), 407-484 (1997).
  3. Dai, D., et al. Elastase-Induced Intracranial Dolichoectasia Model in Mice. Neurosurgery. , (2015).
  4. Ding, B. S., et al. Inductive angiocrine signals from sinusoidal endothelium are required for liver regeneration. Nature. 468 (7321), 310-315 (2010).
  5. Downey, C. M., et al. Quantitative ex-vivo micro-computed tomographic imaging of blood vessels and necrotic regions within tumors. PLoS.One. 7 (7), 41685(2012).
  6. Ehling, J., et al. CCL2-dependent infiltrating macrophages promote angiogenesis in progressive liver fibrosis. Gut. , (2014).
  7. Ehling, J., et al. Micro-CT imaging of tumor angiogenesis: quantitative measures describing micromorphology and vascularization. Am.J.Pathol. 184 (2), 431-441 (2014).
  8. Ghanavati, S., Yu, L. X., Lerch, J. P., Sled, J. G. A perfusion procedure for imaging of the mouse cerebral vasculature by X-ray micro-CT. J.Neurosci.Methods. 221, 70-77 (2014).
  9. Gremse, F., et al. Hybrid microCT-FMT imaging and image analysis. J.Vis.Exp. (100), (2015).
  10. Jing, X. L., et al. Radiomorphometric quantitative analysis of vasculature utilizing micro-computed tomography and vessel perfusion in the murine mandible. Craniomaxillofac.Trauma Reconstr. 5 (4), 223-230 (2012).
  11. Melloul, E., et al. Small animal magnetic resonance imaging: an efficient tool to assess liver volume and intrahepatic vascular anatomy. J.Surg.Res. 187 (2), 458-465 (2014).
  12. Schwier, M., Bohler, T., Hahn, H. K., Dahmen, U., Dirsch, O. Registration of histological whole slide images guided by vessel structures. J.Pathol.Inform. 4 ((Suppl)), 10(2013).
  13. Selle, D., Preim, B., Schenk, A., Peitgen, H. O. Analysis of vasculature for liver surgical planning. IEEE Trans.Med.Imaging. 21 (11), 1344-1357 (2002).
  14. Shergill, U., et al. Inhibition of of VEGF- and NO-dependent angiogenesis does not impair liver regeneration. Am.J.Physiol Regul.Integr.Comp Physiol. 298 (5), 1279-1287 (2010).
  15. Sueyoshi, R., Ralls, M. W., Teitelbaum, D. H. Glucagon-like peptide 2 increases efficacy of distraction enterogenesis. J.Surg.Res. 184 (1), 365-373 (2013).
  16. Wei, W., et al. Rodent models and imaging techniques to study liver regeneration. Eur.Surg.Res. 54 (3-4), 97-113 (2015).
  17. Xie, C., Wei, W., Zhang, T., Dirsch, O., Dahmen, U. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. J.Vis.Exp. (92), e51955(2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MicroCTKi 67HepaVision

מאמרים קשורים