Murine הינד לימב ארוך עצם Dissection ובידוד מח העצם

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול לדיסקציה של עצמות ארוכות של הגפיים האחוריות (עצם הירך והשוקה) מעכבר המעבדה. אנו מתארים עוד טכניקה מהירה לבידוד מח עצם מעצמות אלו המשתמשת בצנטריפוגה להסרת מח עצם מחלל מח העצם.

תקציר

חקר העצם ומח העצם הוא קריטי בתחומי מחקר רבים כולל ביולוגיה בסיסית של העצם, אימונולוגיה, המטולוגיה, גרורות סרטניות, ביומכניקה וביולוגיה של תאי גזע. עם זאת, למרות חשיבות העצם במצבים בריאים ופתולוגיים, מדובר באיבר שאינו נחקר במידה רבה בשל היעדר ידע מיוחד בנתיחת עצם ובידוד מח עצם. עכברים הם אורגניזם מודל נפוץ לחקר השפעות על עצם ומח עצם, מה שמחייב שיטה סטנדרטית ויעילה לדיסקציה ארוכה של עצם ובידוד מח עצם לעיבוד קבוצות ניסוי גדולות. אנו מתארים הליך דיסקציה פשוט להסרת עצם הירך והשוק המתאים ליישומים במורד הזרם, כולל אך לא רק ניתוח היסטומורפולוגי ובדיקת חוזק. בנוסף, אנו מתארים הליך מהיר לבידוד מח העצם מהעצמות הארוכות באמצעות צנטריפוגה עם זמן טיפול מוגבל, אידיאלי למיון תאים, תרבית תאים ראשונית, או מיצוי DNA, RNA וחלבון. הפרוטוקול יעיל לעיבוד מהיר של דגימות כדי להגביל את שגיאות הניסוי, והוא מתוקנן כדי למזער את השונות בין משתמש למשתמש.

מבוא

חקר עצמות ארוכות ותאי מח העצם הוא מרכזי במספר עצום של דיסציפלינות מחקר, כולל, אך לא רק, ביולוגיה של העצם, ביולוגיה של סרטן, אימונולוגיה, המטולוגיה וביומכניקה. העצם היא איבר דינמי ביותר שיחד עם הסחוס יוצר את השלד כדי לספק תמיכה מכנית מפני העמסה והגנה על האיברים הפנימיים. בנוסף, המרכיבים המינרליים של העצם מהווים כיור אחסון למולקולות האיתות הקריטיות סידן וזרחן, כמו גם גורמים אחרים¹. לבסוף, העצמות מאכלסות את מח העצם, ויחד עם אוסטאובלסטים יוצרי עצם פעילים מטבולית ואוסטאוקלסטים סופגי עצם, מספקות את נישת תאי הגזע הדרושה לתחזוקה של אוכלוסיות תאים המטופויאטיים ולימפואידים.

עצם ומח עצם מושפעים בהפרעות רבות, מה שמוביל לעתים קרובות לתפקוד לקוי של מח העצם, כאבי עצמות חמורים ושבר פתולוגי. עצם היא אתר שכיח של גרורות בגידולים מוצקים רבים, בעיקר סרטן השד וסרטן הערמונית, שבהם תאי הגידול מתקשרים ישירות עם נישת מח העצם כדי להתחיל את מעגל הקסמים של גרורות בעצמות ולעקור תאי גזע המטופויאטיים^2,3. ממאירויות המטופויאטיות כולל מיאלומה ולוקמיה מאופיינות בתפקוד לקוי של מח העצם כמו גם בחוסר רגולציה של עיצוב מחדש של עצם בריאה¹. הפרעות שלד לא ממאירות אחרות הן גם תחומי מחקר פעילים, כגון דלקת מפרקים ניוונית, אוסטאופורוזיס, עקמת ורככת. אפילו אצל אדם בריא אחרת, כשל ביומכני בעצם מוביל לשבר כואב. כל ההפרעות הללו מייצגות תחומי מחקר פעילים במטרה לזהות אמצעי מניעה ומשטרי טיפול חדשים להפחתת תחלואה ותמותה.

כדי לחקור את שפע התפקידים של העצם ומח העצם, הן בתנאים פיזיולוגיים והן בתנאים פתולוגיים, זה קריטי לחוקרים שתהיה להם שיטה סטנדרטית פשוטה ויעילה לדיסקציה של עצמות ארוכות של עכבר לעיבוד מהיר של ניסויים גדולים in vivo. פרוטוקול הדיסקציה המתואר כאן מתאים לכל ניתוחי העצמות הארוכות כולל הדמיה ex vivo, היסטולוגיה, היסטומורפומטריה ובדיקות חוזק, בין היתר. באופן דומה, שיטת בידוד מח עצם סטנדרטית עם התאוששות גבוהה של תאי מח עצם ושונות נמוכה בין משתמשים חשובה לניתוח ניסיוני כגון מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) או PCR כמותי (qPCR) כמו גם יישומים במורד הזרם כגון תרבית תאים ראשונית של תאי מח עצם.

פרוטוקול

כל העבודה בבעלי חיים אושרה על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים בהתאם להמלצות המפורטות במדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות.

1. דיסקציה של עצם ארוכה בגפה האחורית

1. המתת חסד של העכבר בהתאם להנחיות המוסדיות.
2. מקם את העכבר במצב שכיבה והצמד על ידי הצמדת כל ארבע הרגליים דרך כריות כפות העכבר מתחת למפרק הקרסול.
3. מרססים את העכבר באתנול 70%, ומטפטפים היטב את הרגליים.
4. בצע חתך קטן מימין לקו האמצע בבטן התחתונה, ממש מעל הירך.
5. הארך את החתך במורד הרגל ומעבר למפרק הקרסול.
6. משוך את העור לאחור וחתוך את שריר הארבע ראשי המעוגן לקצה הפרוקסימלי של עצם הירך כדי לחשוף את הצד הקדמי של עצם הירך ולהצמיד החוצה מהרגל, תוך הנחת הסיכה בזווית של 45 מעלות מהלוח.
7. עם להב המספריים כנגד הצד האחורי של עצם הירך, חתוך את שרירי הירך האחוריים ממפרק הברך.
8. משוך לאחור את העור ואת שרירי הירך האחורי המעוגנים לקצה הפרוקסימלי של עצם הירך כדי לחשוף את הצד האחורי של עצם הירך ולהצמיד החוצה מהרגל, תוך הנחת הסיכה בזווית של 45 מעלות מהלוח.
9. בעזרת המלקחיים, החזק את הקצה הדיסטלי של עצם הירך, ממש מעל מפרק הברך. הנח את להבי המספריים משני צידי פיר הירך לכיוון מפרק הירך, היזהר לא לחתוך לתוך עצם הירך עצמה.
10. לאחר שהגעתם לראש הירך, המסומן על ידי המספריים הנפתחים מעט, סובבו את המספריים כשהלהב העליון של המספריים נע ישירות מעל ראש הירך כדי לעקור את עצם הירך, היזהרו לא להצמיד את העצם מתחת לראש הירך.
11. אחזו בחלק העליון של פיר הירך בעזרת המלקחיים, חתכו את הרקמה הרכה מראש הירך כדי לשחרר אותה מהאצטבולום.
12. משוך את כל עצם הרגל, כולל עצם הירך, הברך והשוקה, למעלה והרחק מהגוף, וחתוך בזהירות את רקמת החיבור והשריר המחברים את הרגל לעור.
13. האריכו יתר על המידה את מפרק הקרסול והשתמשו שוב במספריים בתנועת פיתול כדי לפרק את השוקה.
14. אוחז בקצה הדיסטלי של השוקה, נזהר לא לחתוך את הגידים, משוך את השוקה למעלה והרחק מהגוף ומלוח הסיכה.
15. חתוך את כל רקמת החיבור שנותרה המחברת את העצם הארוכה לעכבר בברך.
16. הסר כל שריר או רקמת חיבור נוספת המחוברת לעצם הירך ולשוקה.
17. עבור כל יישום הדורש שהעצם תישאר שלמה (היסטולוגיה, היסטומורפומטריה, בדיקות ביומכניות וכו'), המשך עם פרוטוקולים פנימיים סטנדרטיים (כמו ^ב-4-7). כדי לבודד את מח העצם, המשך לסעיף 2.

2. הכנת עצם ארוכה לבידוד מח עצם

1. בעזרת המלקחיים, אחוז בעצם הירך כשהפיקה פונה החוצה והקצה הפרוקסימלי (ראש הירך) כלפי מטה.
2. האריכו יתר על המידה את מפרק הברך והשתמשו במספריים בתנועת פיתול כדי לעקור את השוקה ועצם הירך.
3. חותכים כל רקמת חיבור המחזיקה את עצם הירך והשוק יחד.
4. בעזרת המלקחיים, אחוז בעצם הירך כשהצד הקדמי פונה החוצה והקצה הפרוקסימלי (קצה ראש הירך) כלפי מטה.
5. הנח את המספריים במעלה פיר הירך אל הקונדילים.
6. סובב בעדינות את המספריים קדימה ואחורה כדי להסיר את הקונדילים, הפיקה והאפיפיזה כדי לחשוף את המטאפיזה.
7. הסר כל שריר או רקמת חיבור נוספת המחוברת לעצם הירך באמצעות מלקחיים, מספריים ו-Kimwipes.
8. בעזרת המלקחיים, אחוז בשוק כשהצד הקדמי פונה החוצה והקצה הדיסטלי (קצה הקרסול) כלפי מטה.
9. אם האפיפיזה הטיביאלית שלמה, הנח את המספריים במעלה פיר השוקה אל הקונדילים.
10. סובב בעדינות את המספריים קדימה ואחורה כדי להסיר את הקונדיל והאפיפיזה כדי לחשוף את המטאפיזה.
11. הסר כל שריר או רקמת חיבור נוספת המחוברת לשוק באמצעות מלקחיים, מספריים ו-Kimwipes.

3. בידוד מח עצם

1. דחוף מחט של 18 גרם דרך החלק התחתון של צינור מיקרוצנטריפוגה של 0.5 מ"ל.
2. הנח את העצמות הארוכות (מקסימום 2 עצם הירך ו-2 שוקה) לתוך הצינור, קצה הברך כלפי מטה וסגור את המכסה.
3. קן את צינור המיקרו-צנטריפוגה של 0.5 מ"ל בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
4. צנטריפוגה הצינורות המקוננים ב-≥10,000 x g במיקרו-צנטריפוגה למשך 15 שניות.
5. ודא שמח העצם סובב מהעצמות על ידי בדיקה חזותית. העצמות צריכות להיראות לבנות וצריכה להיות גלולה חזותית גדולה בצינור הגדול יותר.
6. השליכו את צינור המיקרו-צנטריפוגה בנפח 0.5 מ"ל עם העצמות.
7. השעו את מח העצם בתמיסה מתאימה (למשל, PBS, אמצעי תרבית, מאגר FACS) והמשיכו בפרוטוקול הניסוי (בידוד DNA, RNA או חלבון, ניתוח FACS או תרבית תאים ראשונית).

תוצאות

הפרוטוקול המתואר כאן עבר אופטימיזציה לנתיחה מהירה של פמור (עצם הירך) וטיביה (עצם השוק) של עכבר עם מינימום נזק לרקמת העצם. טכניקה זו מתאימה למספר ניתוחים המשכיים, כולל מחקרי ביומכניקה, היסטומורפומטריה (איור 1A - B) והיסטולוגיה (איור 1C)^4,7. שחזור תלת-ממדי מייצג ב-micoCT להיסטומורפומטריה (איור 1A - B) מדגים כי הן העצם הספוגית (cancellous bone) והן המעטפת הקורטיקלית נשמרות, מה שמאפשר כימות מדויק של פרמטרים מבניים סטנדרטיים להיסטומורפומטריה של העצם, כולל מספר טרבקולות, עוביהן והמרווח ביניהן; נפח העצם; ועובי קורטיקלי, בין יתר המדדים⁸. חתך היסטולוגי מייצג מראה טיביה מקובעת בפורמלין ומנוונת סידן, צבועה ב-H&E (איור 1C). התמונה מדגימה את השמירה על שלמות העצם המסיידת ושל מח העצם התאי לצורך ניתוח היסטולוגי.

הליך בידוד מח העצם שומר על סטריליות חלל מח העצם, כרוך במניפולציות מעטות להפחתת זיהומים, ואינו דורש חיתוך של העצם הארוכה, ובכך מפחית את אובדן תנובת מח העצם. מח עצם זה מתאים ליישומים רבים בהמשך, כולל ציטומטריית זרימה (flow cytometry)⁵ ואנליזות PCR. בנוסף, ניתן להשתמש בהליך זה כדי לבודד מח עצם לתרבית ראשונית של תאי מח עצם, כולל אוסטאוקלסטים ואוסטאובלסטים (איור 2A - B)^4,6.

איור 1. ניתוחים היסטומורפולוגיים והיסטולוגיים של עצם ארוכה בעכבר. שחזור microCT תלת-ממדי של טיביה (שוקה) של עכבר המראה את (A) הקליפה הקורטיקלית החיצונית ואת (B) העצם הטראבכולרית (סרגל קנה מידה = 0.5 mm). (C) צביעת H&E היסטולוגית של טיביה שעברה דה-קלציפיקציה וחיתוך (4x). התמונות Courtesy של Katherine Weilbaecher, Washington University School of Medicine, USA. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2. תרבית תאי מח עצם ראשוניים להבדלה של אוסטאוקלסטים ואוסטאובלסטים. (A) צביעת TRAP לאוסטאוקלסטים רב-גרעיניים לאחר 7 ימים במצע אוסטאוקלסטוגני (4x). (B) צביעת Alkaline phosphatase (צבע סגול) לאוסטאובלסטים וצביעת alizarin red (צבע אדום) למינרליזציה לאחר 21 ימים במצע אוסטאוגני. התמונות באדיבות של Katherine Weilbaecher, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון, ארה"ב. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

אנו מציגים שיטה פשוטה ויעילה להסרת עצמות ארוכות אחוריות של עכבר ובידוד מח עצם לאחר מכן. שיטה זו שומרת על השלמות המבנית והתאית הגבוהה של העצמות ומח העצם ויש לה זמן טיפול נמוך, מה שממזער את הסבירות לשבר הנגרם על ידי המשתמש או ניקוד עצם שעלולים להשפיע על ניתוחים במורד הזרם. בנוסף, שיטת הצנטריפוגה לבידוד מח עצם אינה מחייבת חיתוך העצם כדי לחשוף את חלל מח העצם או נוזל כדי לשטוף את מח העצם, מה שמפחית נקודות זיהום פוטנציאליות. יתר על כן, טכניקת הצנטריפוגה היא בעלת תפוקה גבוהה יחסית עם זמן מעשי נמוך יותר משיטות אחרות, ובכך מפחיתה את זמן העיבוד.

שונות גבוהה טבועה במחקרי עכברים in vivo עקב שונות פנוטיפית גבוהה מעכבר לעכבר. על מנת למקסם את ההשפעה המחקרית של מחקרי עכברים יקרים ועתירי עבודה, קריטי למזער את שגיאת הניסוי הטכנית^9,10. הזמן מהקרבת בעלי חיים ועד לניתוח במורד הזרם או קיבוע רקמות מציג שונות ניסויית שעשויה להתגבר על שינויים עדינים ולהפחית הבדלים גדולים בין קבוצות. לכן, עיבוד מהיר של דגימות חיוני לניתוח נתונים מדויק. טכניקות ניתוח העצם הארוכות ובידוד מח העצם המתוארות כאן מותאמות לעיבוד מהיר של בעלי חיים ודגימות כדי להפחית את השונות הטכנית.

ניתן ליישם פרוטוקול זה באופן נרחב בתחומי מחקר רבים, כולל חקירת רקמת העצם עצמה או חקירת תאי מח העצם. בנוסף, גישה פשוטה זו לדיסקציה ארוכה של עצם תאפשר לחוקרים בתחומים קשורים לחקור ישירות את תרומות העצם על מנת להרחיב את הידע שלנו על תפקוד לקוי של מח העצם בפתולוגיות שאחרת לא נחקרו.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Pinboard Pinboard
מספריים
לדיסקציה 70% אתנול
מלקחיים
Kimwipes	קימברלי-קלארק	34120
16 גרם מחט
1.5 מ"ל צינור
0.5 מ"ל צינור
מיקרוצנטריפוגה מיקרוצנטריפוגה

דיסקציהמיקרוצנטריפוגהמיקרוצנטריפוגה