Murine הינד לימב ארוך עצם Dissection ובידוד מח העצם

חקר עצמות ארוכות ותאי מח העצם הוא מרכזי במספר עצום של דיסציפלינות מחקר, כולל, אך לא רק, ביולוגיה של העצם, ביולוגיה של סרטן, אימונולוגיה, המטולוגיה וביומכניקה. העצם היא איבר דינמי ביותר שיחד עם הסחוס יוצר את השלד כדי לספק תמיכה מכנית מפני העמסה והגנה על האיברים הפנימיים. בנוסף, המרכיבים המינרליים של העצם מהווים כיור אחסון למולקולות האיתות הקריטיות סידן וזרחן, כמו גם גורמים אחרים¹. לבסוף, העצמות מאכלסות את מח העצם, ויחד עם אוסטאובלסטים יוצרי עצם פעילים מטבולית ואוסטאוקלסטים סופגי עצם, מספקות את נישת תאי הגזע הדרושה לתחזוקה של אוכלוסיות תאים המטופויאטיים ולימפואידים.

עצם ומח עצם מושפעים בהפרעות רבות, מה שמוביל לעתים קרובות לתפקוד לקוי של מח העצם, כאבי עצמות חמורים ושבר פתולוגי. עצם היא אתר שכיח של גרורות בגידולים מוצקים רבים, בעיקר סרטן השד וסרטן הערמונית, שבהם תאי הגידול מתקשרים ישירות עם נישת מח העצם כדי להתחיל את מעגל הקסמים של גרורות בעצמות ולעקור תאי גזע המטופויאטיים^2,3. ממאירויות המטופויאטיות כולל מיאלומה ולוקמיה מאופיינות בתפקוד לקוי של מח העצם כמו גם בחוסר רגולציה של עיצוב מחדש של עצם בריאה¹. הפרעות שלד לא ממאירות אחרות הן גם תחומי מחקר פעילים, כגון דלקת מפרקים ניוונית, אוסטאופורוזיס, עקמת ורככת. אפילו אצל אדם בריא אחרת, כשל ביומכני בעצם מוביל לשבר כואב. כל ההפרעות הללו מייצגות תחומי מחקר פעילים במטרה לזהות אמצעי מניעה ומשטרי טיפול חדשים להפחתת תחלואה ותמותה.

כדי לחקור את שפע התפקידים של העצם ומח העצם, הן בתנאים פיזיולוגיים והן בתנאים פתולוגיים, זה קריטי לחוקרים שתהיה להם שיטה סטנדרטית פשוטה ויעילה לדיסקציה של עצמות ארוכות של עכבר לעיבוד מהיר של ניסויים גדולים in vivo. פרוטוקול הדיסקציה המתואר כאן מתאים לכל ניתוחי העצמות הארוכות כולל הדמיה ex vivo, היסטולוגיה, היסטומורפומטריה ובדיקות חוזק, בין היתר. באופן דומה, שיטת בידוד מח עצם סטנדרטית עם התאוששות גבוהה של תאי מח עצם ושונות נמוכה בין משתמשים חשובה לניתוח ניסיוני כגון מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) או PCR כמותי (qPCR) כמו גם יישומים במורד הזרם כגון תרבית תאים ראשונית של תאי מח עצם.

כל העבודה בבעלי חיים אושרה על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים בהתאם להמלצות המפורטות במדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות.

1. דיסקציה של עצם ארוכה בגפה האחורית

1. המתת חסד של העכבר בהתאם להנחיות המוסדיות.
2. מקם את העכבר במצב שכיבה והצמד על ידי הצמדת כל ארבע הרגליים דרך כריות כפות העכבר מתחת למפרק הקרסול.
3. מרססים את העכבר באתנול 70%, ומטפטפים היטב את הרגליים.
4. בצע חתך קטן מימין לקו האמצע בבטן התחתונה, ממש מעל הירך.
5. הארך את החתך במורד הרגל ומעבר למפרק הקרסול.
6. משוך את העור לאחור וחתוך את שריר הארבע ראשי המעוגן לקצה הפרוקסימלי של עצם הירך כדי לחשוף את הצד הקדמי של עצם הירך ולהצמיד החוצה מהרגל, תוך הנחת הסיכה בזווית של 45 מעלות מהלוח.
7. עם להב המספריים כנגד הצד האחורי של עצם הירך, חתוך את שרירי הירך האחוריים ממפרק הברך.
8. משוך לאחור את העור ואת שרירי הירך האחורי המעוגנים לקצה הפרוקסימלי של עצם הירך כדי לחשוף את הצד האחורי של עצם הירך ולהצמיד החוצה מהרגל, תוך הנחת הסיכה בזווית של 45 מעלות מהלוח.
9. בעזרת המלקחיים, החזק את הקצה הדיסטלי של עצם הירך, ממש מעל מפרק הברך. הנח את להבי המספריים משני צידי פיר הירך לכיוון מפרק הירך, היזהר לא לחתוך לתוך עצם הירך עצמה.
10. לאחר שהגעתם לראש הירך, המסומן על ידי המספריים הנפתחים מעט, סובבו את המספריים כשהלהב העליון של המספריים נע ישירות מעל ראש הירך כדי לעקור את עצם הירך, היזהרו לא להצמיד את העצם מתחת לראש הירך.
11. אחזו בחלק העליון של פיר הירך בעזרת המלקחיים, חתכו את הרקמה הרכה מראש הירך כדי לשחרר אותה מהאצטבולום.
12. משוך את כל עצם הרגל, כולל עצם הירך, הברך והשוקה, למעלה והרחק מהגוף, וחתוך בזהירות את רקמת החיבור והשריר המחברים את הרגל לעור.
13. האריכו יתר על המידה את מפרק הקרסול והשתמשו שוב במספריים בתנועת פיתול כדי לפרק את השוקה.
14. אוחז בקצה הדיסטלי של השוקה, נזהר לא לחתוך את הגידים, משוך את השוקה למעלה והרחק מהגוף ומלוח הסיכה.
15. חתוך את כל רקמת החיבור שנותרה המחברת את העצם הארוכה לעכבר בברך.
16. הסר כל שריר או רקמת חיבור נוספת המחוברת לעצם הירך ולשוקה.
17. עבור כל יישום הדורש שהעצם תישאר שלמה (היסטולוגיה, היסטומורפומטריה, בדיקות ביומכניות וכו'), המשך עם פרוטוקולים פנימיים סטנדרטיים (כמו ^ב-4-7). כדי לבודד את מח העצם, המשך לסעיף 2.

2. הכנת עצם ארוכה לבידוד מח עצם

1. בעזרת המלקחיים, אחוז בעצם הירך כשהפיקה פונה החוצה והקצה הפרוקסימלי (ראש הירך) כלפי מטה.
2. האריכו יתר על המידה את מפרק הברך והשתמשו במספריים בתנועת פיתול כדי לעקור את השוקה ועצם הירך.
3. חותכים כל רקמת חיבור המחזיקה את עצם הירך והשוק יחד.
4. בעזרת המלקחיים, אחוז בעצם הירך כשהצד הקדמי פונה החוצה והקצה הפרוקסימלי (קצה ראש הירך) כלפי מטה.
5. הנח את המספריים במעלה פיר הירך אל הקונדילים.
6. סובב בעדינות את המספריים קדימה ואחורה כדי להסיר את הקונדילים, הפיקה והאפיפיזה כדי לחשוף את המטאפיזה.
7. הסר כל שריר או רקמת חיבור נוספת המחוברת לעצם הירך באמצעות מלקחיים, מספריים ו-Kimwipes.
8. בעזרת המלקחיים, אחוז בשוק כשהצד הקדמי פונה החוצה והקצה הדיסטלי (קצה הקרסול) כלפי מטה.
9. אם האפיפיזה הטיביאלית שלמה, הנח את המספריים במעלה פיר השוקה אל הקונדילים.
10. סובב בעדינות את המספריים קדימה ואחורה כדי להסיר את הקונדיל והאפיפיזה כדי לחשוף את המטאפיזה.
11. הסר כל שריר או רקמת חיבור נוספת המחוברת לשוק באמצעות מלקחיים, מספריים ו-Kimwipes.

3. בידוד מח עצם

1. דחוף מחט של 18 גרם דרך החלק התחתון של צינור מיקרוצנטריפוגה של 0.5 מ"ל.
2. הנח את העצמות הארוכות (מקסימום 2 עצם הירך ו-2 שוקה) לתוך הצינור, קצה הברך כלפי מטה וסגור את המכסה.
3. קן את צינור המיקרו-צנטריפוגה של 0.5 מ"ל בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
4. צנטריפוגה הצינורות המקוננים ב-≥10,000 x g במיקרו-צנטריפוגה למשך 15 שניות.
5. ודא שמח העצם סובב מהעצמות על ידי בדיקה חזותית. העצמות צריכות להיראות לבנות וצריכה להיות גלולה חזותית גדולה בצינור הגדול יותר.
6. השליכו את צינור המיקרו-צנטריפוגה בנפח 0.5 מ"ל עם העצמות.
7. השעו את מח העצם בתמיסה מתאימה (למשל, PBS, אמצעי תרבית, מאגר FACS) והמשיכו בפרוטוקול הניסוי (בידוד DNA, RNA או חלבון, ניתוח FACS או תרבית תאים ראשונית).

הפרוטוקול המתואר כאן מותאם לדיסקציה מהירה של עצם הירך והשוקה של העכבר עם מינימום נזק לרקמת העצם. טכניקה זו מתאימה למספר ניתוחים במורד הזרם, כולל מחקרי ביומכניקה, היסטומורפומטריה (איור 1A - B) והיסטולוגיה (איור 1C)4,7. שחזור תלת מימד היסטומופומטרי מייצג (איור 1A - B) מדגים כי גם העצם המבטלת וגם המעטפת בקליפת המוח נשמרים המאפשרים כימות מדויק של הפרמטרים המבניים הסטנדרטיים עבור היסטומורפומטריית עצם, כולל מספר טרבקולרי, עובי ומרווח; נפח עצם; ועובי קליפת המוח, בין שאר המדדים8. החתך ההיסטולוגי המייצג מראה שוק קבועה ונטולת אבדן מוכתמת בפורמלין H&E (איור 1C). התמונה מדגימה את שלמות העצם המסוידת ומח העצם התאי לניתוח היסטולוגי.

הליך בידוד מח העצם שומר על הסטריליות של חלל מח העצם, בעל טיפול נמוך להפחתת זיהום, ואינו דורש חיתוך של העצם הארוכה, ובכך מפחית את אובדן תפוקת מח העצם. מח עצם זה מתאים ליישומים רבים במורד הזרם, כולל ציטומטריית זרימה5 וניתוחי PCR. נוסף על כך, הליך זה יכול לשמש לבידוד מח עצם עבור תרבית תאים ראשונית של תאי מח עצם, כולל אוסטאוקלסטים ואוסטאובלסטים (איור 2A - B)4,6.

איור 1. ניתוחים היסטומורפולוגיים והיסטולוגיים של עצם ארוכה של עכבר. שחזור מיקרו-CT תלת מימדי של שוק עכבר המראה (A) את המעטפת החיצונית של קליפת המוח ו-(B) עצם טרבקולרית (סרגל קנה מידה = 0.5 מ"מ). (C) כתם H&E היסטולוגי של טיביה נטולת אבדן וחתך (4x). התמונות באדיבות קתרין וילבכר, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון, ארה"ב. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2. תרבית תאי מח עצם ראשונית להתמיינות של אוסטאוקלסטים ואוסטאובלסטים. (A) צביעת TRAP עבור אוסטאוקלסטים מרובי גרעינים לאחר 7 ימים במדיה אוסטאוקלסטוגנית (4x). (B) פוספטאז אלקליין (צבע סגול) לאוסטאובלסטים וכתם אדום אליזרין (צבע אדום) למינרליזציה לאחר 21 יום במדיה אוסטאוגנית. התמונות באדיבות קתרין וילבכר, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון, ארה"ב. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

למחברים אין מה לחשוף.