מאמר שיטה

נוהל כדי להעריך את היעילות של flocculants להרחקת מפוזרי חלקיקים מן תמציות צמחים

8.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53940

⸱

9 באפריל 2016

1Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V., 2Institute for Molecular Biotechnology, RWTH Aachen University

במאמר זה

סיכום

נוהל תכנון הניסויים המוצג כאן מאפשר להעריך פלוקולנטים שונים מבחינת יכולתם לצבור חלקיקים מפוזרים בתמציות צמחים, ובכך להפחית את העכירות ואת עלויות העיבוד במורד הזרם.

תקציר

צמחים חשובים לבני אדם לא רק בגלל שהם מספקים סחורות כמו מזון, מזון וחומרי גלם, אלא יותר ויותר מכיוון שהם יכולים לשמש כפלטפורמות ייצור למוצרים בעלי ערך מוסף כמו ביו-פרמצבטיקה. בשני המקרים, ייתכן שיהיה צורך להבהיר תמציות צמחים נוזליות כדי להסיר חלקיקים. הבהרה אופטימלית מפחיתה את עלויות הסינון והצנטריפוגה על ידי הגדלת הקיבולת ואורך החיים. ניתן להשיג זאת על ידי הכנסת פולימרים טעונים המכונים פלוקולנטים, אשר מקשרים חלקיקים מפוזרים כדי להקל על הפרדת מוצק-נוזל. אין מודלים מכניסטיים של פלוקולציה לתערובות מורכבות כמו תמציות צמחים, ולכן משתמשים במקום זאת במודלים אמפיריים. כאן מתואר הליך תכנון ניסויים המאפשר סינון מהיר של פלוקולנטים שונים, אופטימיזציה של בירור תמציות צמחים והפחתה משמעותית של עכירות. מודלי החיזוי המתקבלים מאפשרים זיהוי של תנאי תהליך חזקים וקבוצות של פולימרים בעלי תכונות משלימות, למשל פלוקולציה יעילה בתמציות עם מוליכות ספציפית. התוצאות המוצגות עבור תמציות עלי טבק ניתנות להתאמה בקלות למיני צמחים או רקמות אחרות ובכך יקלו על פיתוח תהליכים חסכוניים יותר במורד הזרם עבור סחורות ותרופות שמקורן בצמחים.

מבוא

צמחים נמצאים בשימוש נרחב כדי לייצר סחורות מזון כגון מיצי פרות, אבל הם יכולים גם להיות מפותחים כמו פלטפורמות לייצור מוצרי הביו-פרמצבטיקה בעלי ערך גבוה יותר 1-3. בשני המקרים, עיבוד במורד הזרם (DSP) לעתים קרובות מתחיל עם החילוץ של נוזלים מרקמות כגון עלים או פירות, ואחריו ההבהרה של תמציות-לאדן החלקיקים 4,5. לייצור תרופות ביולוגיים, העלויות של DSP יכולות להסביר עד 80% מעלויות הייצור הכוללים 6,7 וזאת חלק משקפת את ההווה נטל חלקיקים גבוהים תמציות הוכנו בשיטות משבשות כגון המגון להב מבוסס 8,9 . למרות הבחירה הרציונלית של שכבות מסננות כדי להתאים את התפלגות גודל חלקיקים בתמצית יכולה להגדיל את הקיבולת מסננת ולהפחית עלויות 10,11, השיפור לא יכול לחרוג מתקרת הקיבולת המוחלטת המוגדרת במספר החלקיקים חייבים להישמר לכליחידת שטח מסנן להשיג הבהרה.

התקרה ניתן להרים אם פחות חלקיקים מגיעים לפני השטח של מסנני משובחי הרכבת הסינון, זו יכולה להיות מושגת אם חלקיקים מפוזרים הם מעורבבים עם פולימרים המכונים flocculants המקדמים צבירה להקים flocs הגדול 12. flocs כזה ניתן להיעזר הזרם עוד יותר על ידי מסנני שק גס ופחות יקר, הפחתת הנטל חלקיק שהגיע עדינה ומסננים עומק יקר יותר. חייבים להיות פולימרי פרופילי בטיחות מתאימים ליישומים שלהם, למשל עבור הביופרמצבטיקה הם צריכים להיות תואמים ייצור נאות (GMP), ובדרך כלל הם חייבים להיות מסה טוחנת> 100 kDa והוא יכול גם להיות ניטראלי או טעון 13. בעוד flocculants הניטראלי פועל בדרך כלל על ידי cross-linking חלקיקים מפוזרים גרימת הצבירה שלהם ויצירת flocs בקטרים> 1 מ"מ 11, פולימרים טעונים לנטרל את המטען של דחלקיקי ispersed, הפחתת המסיסות שלהם ובכך גרמו ממטרים 14.

הפתתה ניתן לשפר על ידי התאמת פרמטרים כגון חיץ pH או מוליכות, ואת סוג הפולימר או ריכוז, כדי להתאים את המאפיינים של תמצית 15,16. תמציות טבק pretreated עם 0.5-5.0 גרם ל -1 polyethylenimine (PEI), גדול יותר מאשר גידול פי 2 ב קיבולת עומק מסנן נמסר בתהליך 100-L טייס מידה. עלות פולימר זה פחות מ -10 € קילו -1 כך החדרתו תהליך הביאה לחיסכון בעלויות של כ -6,000 € עבור מסננים מתכלה לכל תצווה 16 או אפילו יותר כאשר הוא משולב עם עזרי מסנן מבוסס תאי 17. אף על פי כן, מודלים חזויים נדרשים להעריך את ההטבות כלכליות אפריורי של flocculants כי הכללה יכול לדרוש צעדי אחיזה של 15-30 דקות 16,18, וכתוצאה מכך עלויות השקעה נוספות לאחסוןטנקים. עם זאת, אין כיום מודלים מכניסטית זמינים שיכול לחזות את התוצאה של ניסויים כאלה בשל האופי המורכב של הפתתה. לכן, מתאים יותר עיצוב של ניסויים (DOE) הגישה 19 פותחה כמתואר במאמר זה. פרוטוקול עבור הליך האיילה הכללי לאחרונה פורסם 20.

מכשירים בקנה מידה קטנה זמינים כעת עבור הקרנת התפוקה הגבוהה של תנאים הפתתה 21. עם זאת, מכשירים אלה לא יכולים לדמות תנאים מציאותיים במהלך הפתתה של תמציות צמחים כי ממד כלי התגובה (~ 7 מ"מ עבור בארות על צלחת 96-היטב) ואת החלקיקים או flocs יכול להיות פחות מ בסדר גודל זה מזה. הדבר עלול להשפיע על ערבוב דפוסים ובכך כוח הניבוי של המודל. יתר על כן, זה יכול להיות קשה כדי להקטין תהליכים מעורבים ממטרים עקב שינויים שאינו ליניארי בהתנהגות ערבוב STA המשקעbility 22. לכן, במאמר זה מתאר מערכת הקרנת ספסל העליונה בקנה מידה עם תפוקה של 50-75 דגימות ליום, מניב תוצאות שאינן מדרגים מכרך התגובה הראשוני 20 מיליליטר לתהליך 100 L טייס מידת 16. בשילוב עם גישת איילה, זה מאפשר מודלים המנבאים לשמש אופטימיזציה תהליך ותיעוד כחלק מושג איכות-ידי עיצוב.

השיטה המתוארת להלן עשויה גם להיות מותאמת ל תרופות ביולוגיות מיוצרות בתא תהליכי התרבות מבוססת, שבו flocculants גם נבחנים ככלי לחיסכון בעלויות 23. זה יכול גם לשמש מודל המשקע של חלבוני היעד מ תמצית גולמית כחלק מאסטרטגית טיהור, כפי שמודגם עבור β-glucuronidase מיוצר קנולה, תירס וסויה 24,25. תיאור מפורט של תכונות flocculant ניתן למצוא במקום אחר 16,26 וזה חשוב לוודא כי concentr הפולימרations הם או רעיל או מתחת לרמות מזיקות במוצר הסופי 11.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. לפתח אסטרטגיה ניסויית הולמת

  1. זהה את הפרמטרים הסביבתיים תהליך שרלוונטיים עבור ההליך הפתתה שיוקם או אופטימיזציה, כלומר אילו גורמים יש את ההשפעה החזקה ביותר על הפתתה. בדרך כלל, ישנם מספר פרמטרים כגון כך גישת DOE כמתוארת לאחרונה 20 הכרחיים בשל העדר מודלים מכניסטית.
    1. פרמטרים בחרו (גורמים) מבוססים על נתונים בספרות 12, ידע מוקדם וניסיון עם המערכת. גורמים אופייניים כוללים pH חיץ, מוליכות חיץ, זמן דגירה וטמפרטורה וכן סוג פולימר וריכוז 15,16,27.
    2. השתמש תזכור אותו (ראה סעיף 1.1) כדי להגדיר טווחים משמעות עבור כל אחד גורם ורמות מספריות עבור גורמי קטגורים.
    3. הגדר את תוצאות הניסוי (תגובות) להיות פיקוח להשתמש כדי להעריך את היעילות של הפתתה. בהתאם למערכת, זויכול להיות עכירות תסנין או supernatant, מהירויות שיקוע, גודל מצטבר או היכולת של מסנן עוקב 16,23,28-30.
    4. ודא המבחנים המשמשים למדידת התגובות הם כמותית, חזקים דיר / לשחזור כך שנתונים באיכות גבוהה וכתוצאה מכך ניתן augmented עם ניסויים שבוצעו מאוחר יותר או על ידי מפעיל אחר.
  2. בחר סוג DOE אריג מספר הגורמים להיחקר ואת מידת הידע צבר כבר על המערכת. השתמש בספרות זמינה לזהות סוג DOE מתאים 20.
    1. בחר עיצוב הקרנה אם יש מעט מידע על מערכת הפתתה להיחקר, מספר רב של פרמטרים חייב להיות מוקרן או מעט מאוד ידוע על טווח משמעותי עבור הפרמטרים. עיצובי הקרנה אופייניים הם עיצובי עצרת מלאים שבר. כלול נקודות מרכז בעיצוב אם הפרמטרים צפויים להיות להם השפעה שאינה ליניארי, למשל רווי מעל סף מסוים 19.
    2. בחר מתודולוגיה משטח תגובה (RSM), עיצוב מורכב המרכזי למשל (CCD) 31 או 32,33 אופטימלי, אם רק כמה גורמים עם טווח ידוע צריכים להתאפיין בדיוק.
  3. הגדר את האיילה עם תוכנה מתאימה, הבטיחה איכות קריטריונים אפריורי כמו השבריר של מרחב תכנון הם נפגשו 20.

2. מכינים את הניסויים הפתתה

figure-protocol-1
איור 1: עבודת הפתתה תמצית צמח: סולם תהליך (משמאל) בקנה מידה מעבדתי (מימין). לאחר מיצוי חלבון עם מאגרים מימיים, חלקיקי נדחי פסולת תא ייצברו לפי התוספת של flocculants. המצרפים הוסרו מכן על ידי מפל של סינון תיק ועומק ואת היכולת של אלהמסננים יחד עם turbidities תסנין ניתן להשתמש ישירות למדוד את היעילות של הפתתה.

  1. לפתח נחל עבודה ניסויית כללי (איור 1).
    1. השתמש מערכת לפינוי שתוצאתו החלוקה באותו גודל החלקיקים הצפויה (או כבר ציינו) בקנה מידת היישום הסופי, למשל homogenizer מיוחד. במידת האפשר, לעצב דגם מוקטן למטה של חולץ כמתואר עבור המגון של עלי טבק 10.
    2. הגדר את כרכים לחלץ בשימוש במהלך הניסויים הפתתה (פה 20 מ"ל). בחר נפח המאפשר מספר חלקיקים נציג להיות נוכח כלי התגובה, ניסויים הפתתה למשל aliquots 20 מיליליטר ניב תוצאות לשחזור וניתן להרחבה עבור תמציות טבק המכילים ~ 7% [w / v] מוצק 34 וגדלי חלקיקים של ~ 0.5 מיקרומטר ~ 3 מ"מ 16.
    3. עיצוב כל פעולות ניטור-הפתתה הפוסט כך הEY מייצג את היקף היישום הסופי, מסננים בחרו למשל עם אותה התנהגות כושר הסינון כמו אלה המשמשים את היקף הייצור.
  2. ולטפח את הצמחים שמהם התמציות תיגזרנה.
    1. השתמש באותו קו הצמח, כאן Nicotiana tabacum cv. Petit הוואנה SR1, ותנאי טיפוח אשר ישמשו במהלך ייצור כפי שתוארו לעיל 33.
    2. אם מניות להאכיל אחרים תעובדנה, להכין מלאי מזון אלה, כך שהם מייצגים את היקף היישום הסופי, למשל להשתמש מאגרים אותנטיים, לקחת בחשבון את כל שלבי דילול במהלך התהליך ולדבוק ה- pH ומוליכות הצפויות, כאן pH 7.5 ו 30 MS מוליכות -1 ס"מ.
  3. כן Utilities הסינון, ומכשירי ניטור-עכירות וכלי דגימה.
    1. חותכים את חומרי סינון על הגדלים הנדרשים, כאן 15 x 15 ס"מ 2, אם הם לא מוכנים לנולומד e. ודא כי כל מכשירי הניטור והניתוח הם פונקציונליים ואת כל תווית דוגמיות.
    2. למרות אלה הם משימות פשוטות, להכין פריטים אלה בזמן כדי לוודא שהם לא יגרמו הפרעות במהלך הניסויים הפתתה בפועל. למנוע עיכובים כי הם יכולים להפריע את התוצאות נתונות הפתתה כי היא תהליך תלוי-זמן.
  4. הכינו פתרונות המניות flocculant. זהירות: בציוד מגן אישי מתאים בעת טיפול flocculants, כפפות למשל. החומרים יכולים להיות מסוכנים (תוויות מפגע על פי לאירופה UE 67/548 / CEE, 1999/45 / CE כוללים N, Xi או Xn). הימנע אבק עיין גיליונות נתוני בטיחות חומרים. עבודה מתחת למכסה המנוע קטר.
    1. בחר ריכוז המניות לכל flocculant, כאן 80.0 גרם ל -1 לשני flocculants PEI ששימשו. ריכוזים בחרו גבוהים ככל האפשר, כדי למנוע דילול מדגם בעת הוספת flocculant, אשר יפחית Concentra החלקיקיםtion ובכך להשפיע יעילות הפתתה.
    2. חשבון עבור כל דילול מראש המשקף את הניסוח של היצרן של הפולימר, למשל אם הפולימר מסופק כבר בתור 50% מימיים [w / v] פתרון. פתרונות המניות flocculant של 4-8% [w / v] נמצאו להיות המתאים ביותר עד כה.
    3. בהתחשב הנקודות שנדונו לעיל, לוודא את ריכוז flocculant אינו יוצר פתרון צמיג מאוד מעכב pipetting, דבר עלול לגרום טעויות מפני ריכוז flocculant הסופי אינו מותאם כראוי.
    4. השתמש באותו ריכוז המניות לכל flocculants אם אפשר כי זה יקל על ההתקנה של ערכת pipetting (2.5) ובכך להקטין את הסיכוי לטעויות.
    5. התאם את ה- pH ומוליכות של כל פתרון המניות flocculant כדי להתאים את התנאים של תמציות, כאן MS pH 4-10 ומוליכות 15-55 ס"מ -1. הכן מניות בודדות במשך flocculant יחיד אם מ 'עפרות מערכה אחת של תנאי pH ו / או מוליכות נבחנת הפולימר.
    6. הכינו פתרונות המניות flocculant טרי, לא יותר מ 48 שעות לפני השימוש. למרות הפתתה יכול להיגרם עם מניות פולימר מאוחסנות במשך יותר מ 4 שבועות, את היעילות עלולה לרדת בשל הידרוליזה פולימר בערכי pH גבוהים מדי או נמוכים מדי. עיין בתיעוד של היצרן לפרטים נוספים.
    7. ודא כי הפרמטרים שנבחרו עבור האיילה יכולים להיות מותאמים בדיוק עבור כל דגימה במהלך הניסוי, למשל להבטיח יש אמבטיות חימום / קירור לרשות להתאים לטמפרטורות דגירה, כאן 4 ° C, 20 ° C ו- 37 ° C. אם ערבוב במהלך הפתתה הוא במסגרת הניסוי, וודא שההתקן ערבוב הוא נציג של הסקאלה היישום הסופי מבחינת פרמטרים קריטיים כגון תשומות כוח.
  5. המרה בתוספת DOE לתוך תכנית Pipetting.
    1. המרת ריכוזי flocculant השונים להיות tesטד לתוך כרכים של פתרון המניות כי יתווספו דגימות התמצית: לחלק את ריכוזי flocculant הסופיים על ידי ריכוז המניות ולהתרבות על פי היקף המדגם המשמש בניסויים הפתתה. זהה את נפח סופי וכתוצאה הגדול, למשל אם 20 מ"ל של מדגם מעורבב עם מקסימום של 2 מ"ל פתרון המניות flocculant זה יהיה 22 מ"ל.
    2. חישוב כמויות של כרית ההון הנדרשת כדי לשמור על אותו נפח סופי בכל aliquots הפתתה מבוסס על הנפח הגדול ביותר של המניה flocculant להתווסף, למשל אם 0.75 מ"ל של המניה flocculant יש להוסיף מדגם מכן 1.25 מ"ל של חיץ נדרש לשמור על נפח דגימה הסופי של 22 מ"ל (2.5.1).
    3. לסכם את הכרכים של פתרון מניות flocculant עבור כל תנאי פולימר הפתתה לחשב את הכמויות המוחלטות של פתרון מניות דרושים האיילה.
  6. עלי טבק קציר ולהכין את חלץ.
    1. הסר את לאה שישה העליונהves (או רב ככל שעולים בהוראות התהליך) מצמח טבק של גיל מתאים, למשל 6 שבועות, ולהעביר מערכת לפינוי מתאימה כגון homogenizer או בורג בעיתונות.
    2. הוספת שלושה כרכים של חיץ החילוץ לכל ביומסה גרם, למשל 300 מ"ל ל -100 גרם, ומערבלים במשך 8 דקות.
    3. הכן תמציות פרט עם המאגרים המתאימים אם נבדקות pH ו / או מוליכות שונות. הנה, זה כרוך שמאחד את החומר הצמחי עבור 3 x 30 שניות בבלנדר או מסחטה 34.
    4. לחלופין, להכין את התמצית באופן מייצג את התהליך תחת חקירה.
  7. Aliquot לחלץ ואת מוסיף את ההצפה.
    1. ידני וביסודיות לבחוש תמצית במהלך ההליך כולו כדי להבטיח הדגימות הן הומוגניות עם חלוקה שווה של חלקיקים.
    2. דווקא לחלק את התמצית בקרב צינורות התגובה מראש שכותרתו באמצעות אחסון,20 מ"ל כאן בכל כלי. עצמי עומד 50 מ"ל צינורות לפשט טיפול והם אידיאליים עבור 20 דגימות מיליליטר.
    3. מוסיף את עוצמת הקול של כל חיץ חילוץ נדרש בכדי לשמור על נפח סופי הקבוע עבור כל צינור תגובה בודד באמצעות פיפטה מתאימה.

3. Flocculate הצמח מחלץ עם פולימרים שונים

  1. פיפטה נפח נדרש פתרון מניות flocculant, כאן 0.1-2.0 מיליליטר, על הדגימות ברצף כפי שצוין על ידי סדר ההפעלה האקראית של האיילה. לערבב ביסודיות כל דגימה מיד לאחר תוספת של flocculant ידי מדריך אינטנסיבי רעד במשך בדיוק 20 שניות.
    1. במידת הצורך, להתאים את זמן הרעד במשך מניות להאכיל אחרים, כדי להבטיח ערבוב יסודי, אבל בהחלט להבטיח פעמי ערבוב עקביות עבור כל הדגימות. יש לזכור כי ממושכת ערבוב עלול לגרום לשיבוש בלתי הפיך של flocs ויישומי כוח עקבית במהלך רועד יכול לעוות את תוצאות הפתתה.
  2. אופציונלי: שנה את ההליך המתואר לעיל עבור יישום בו זמני של שניים או יותר flocculants.
    1. אפשרות 1: במקום פולימר יחיד להוסיף תערובת של שניים או יותר flocculants, כאן PEI ו chitosan. השתמש שילובי flocculant שהוגדרו Doe. לשלב את היחס וריכוזים המוחלטים של הפולימרים כפרמטרים בודדים במהלך התקנת האיילה (1.1).
    2. אפשרות 2: הוסף שניים או יותר פולימרים ברצף כדי לחלץ.
      1. השתמש ריכוזי פולימר היחידים, הסוג שלהם, ואת זמן הדגירה בין כל בנוסף לחלץ, כמו גורמים נוספים במהלך התקנת Doe.
      2. גם להשתמש בגישה זו כדי לבדוק אם החיבור החוזר של פולימר יחיד יכול לשפר הפתתה. השתמש תוספת בשלבים לדמות התוספת האיטית של flocculant, למשל ארבעה שלבים, כל מנית 0.25 מיליליטר 80 גרמו ל -1 flocculant הוספת סרטון דק 20 מיליליטר נפח מעל 4 יכולה לחקות התוספת של flocculant עםקצב הזרימה של -1 דקות 0.25 מ"ל.
      3. בכל המקרים, לזהות נפח דגימה סופי מרבי חדש עבור התקנה זו על ידי הוספת הכמויות המרביות של כל flocculants אל נפח הדגימה, כאן עדיין 22 מיליליטר, ולחשב את הכמויות נדרשות פתרונות מאגרי מניות flocculant עבור התאמת עוצמת קול במידת צורך.
  3. דגירה דגימות עבור פעמים שהוגדרו Doe, בדרך כלל 3-30 דקות, כדי לאפשר היווצרות floc. ודא שכל תנאי הדגירה אחרים, טמפרטורה למשל, נקבעת על פי DOE.
  4. להתבונן היווצרות floc המסמך. רשום את ההתקדמות של היווצרות floc כנדרש, למשל כמו מ"מ של floc ליישוב לדקה ידי מדידת גובה של מוצקים התיישבו. במידת הצורך, להאריך הפתתה עבור תקופת זמן ממושכת כגון לילה.
  5. סנן את חלץ Flocculated.
    1. השתמש חומרי סינון הכין קודם לכן (2.3) כדי להבהיר את תמצית flocculated לאחר המתאיםזמן דגירה באמצעות אחסון דגימות flocculated דרך החומר המסנן לתוך צינור כלי שיט או תגובה נקיה.
      1. אין מחדש להשעות את flocs התיישבו לפני סינון ולהחיל את תמצית עם בקצב של ~ 300 מ"ל דקות -1 עד הפילטר, המקביל ל 3-4 שניות למדגם 20 מ"ל.
      2. אשר את הביצועים של צעד הסינון אם חומר שונה משמש ניסויי ספסל העליונים לעומת בתהליך הסופי מבחינת כושר סינון, למשל על ידי מדידת התפלגות גודל החלקיקים בשני סוגי מדגם 11.
    2. לנתח את התסנין מבחינת עכירות ו / או התפלגות גודל חלקיקים כפי תקנים המתאימים באמצעות נדרש, למשל turbidimeter.
    3. אופציונלי: לחזור על ניתוח לאחר פעמים דגירה ממושכת, למשל 12-24 שעות, כדי לחקור את היווצרות או יצירה מחדש של flocs יציב.
  6. ניתוח הדגימות בהתאם לתחומי Prתגובות דואר מוגדרת (1.1.3).
    1. קח דגימות מן filtrates ולנתח אותם פרמטרים בתגובה נוספים, כגון ריכוזי חלבונים יעד שונים או מוצרים יקרי ערך.
    2. אופציונלי: נתח את retentate (בעיקר מוצקים) עבור אותם פרמטרים כדי לסגור את מאזן מסה של התהליך. בפרט, לכמת את השפעת flocculants על התאוששות נוזלית על ידי השוואת מוצקי משקל הנותר לאחר דגימות מטופלים או שלא טופלו flocculant.
  7. אשר את איכות הנתונים ולהעביר את התוצאות לתוכנת Doe.
    1. חפש ערכים חריגים בנתוני התגובה שנאספו, ערכים גבוהים למשל במפתיע.
    2. ודא כי כל הנתונים בתגובה מיושרים כראוי עם תנאי הניסוי המתאימים להם.
    3. מעביר את התוצאות לתוך תוכנת DOE ולוודא הציווי בטווח הסטנדרטי אקראי אינם מתערבב.

4. הערכההאיילה

  1. השתמש בכלים לניתוח נתונים המובנים של תוכנת משרד האנרגיה לפתח מודל לים כפי שתואר לעיל 20.
    1. בחר מצב שינוי נתונים ראוי אם נדרש כדי להקל בניית מודל, כאן להיכנס 10. יחס גדול מ -10 עבור ערך בתגובה קטן מול גדול מציין כי שינוי נתונים ייתכן שיידרש. זהה את השינוי המתאים ביותר תוך שימוש בכלים סטטיסטיים המתאימים, למשל מגרש Box-Cox 35.
    2. בחר מודל בסיס (i) מתאים למשרד החינוך הפדרלי הנבחר (1.2) ו- (ii) מסכים עם ידע קודם על המערכת תחת חקירה מבוססת על הניתוח השונה (ANOVA) כלים של תוכנת האיילה, למשל פולינום מסדר שני לעתים קרובות מתאים יותר אל האפקט שנצפה זמן דגירה מ פולינום מסדר ראשון.
    3. הסר גורמים מודל מבוטל, עמ 'למשל> 0.05, או אינטראקציות גורם איטרטיבי על ידי ביטול הבחירה אותם,reby הפחתת המורכבות של מודלים והגדלת כוח הניבוי שלה.
    4. אשר את איכות המודל על ידי השוואת R 2, מותאם R 2 וחזה R 2 יחד עם עלילת ההסתברות הנורמלית של שאריות studentized, שאריות-vs-ריצה, חזה-vs-בפועל Box-קוקס מגרש 36. כל ערכי R 2 צריכים להיות בטווח של 0.2.
    5. ודא כי המודל הסופי מסכים עם הנחות היסוד של הפיזיקה התרמודינמיקה, למשל אין ריכוזים שלילי הם חזו.
  2. להשתמש במודל כדי לחזות תנאים נוחים ביותר עבור המערכת תחת חקירה, כאן עכירות נמוכה.
    1. בחר את התגובות החשובות ביותר והמדינות המועדפות עליהם, למשל עכירות מינימאלית. מערבב את הבחירות האלה על ידי מקסום פונקציה כדאית או כלים דומים, אשר תכונות מובנות של חבילות תוכנת מספר איילת 36.
    2. בהתאם o ביישום המיועדf המודל, אישור בחר פועל כדי לוודא את התנאים האופטימליים ו / או כוח הניבוי של המודל באופן כללי, למשל אם התנאים צפויים להיות טוב ביותר לא היה חלק האיילה הראשונית לבחור בם ניסויים ומעקב.

5. לשפר את הדגם ולבדיקת כוח הניבוי

  1. לצמצם את מרחב תכנון הראשוני לתנאי הפעולה הרצויים ביותר, עכירות נמוכה למשל בטווח 0-1,000 יחידות עכירות nephelometric (NTU), המבוססת על תחזיות המודל (4.2).
  2. הגדרת איילה חדשה בטווח מחירים זה, כולל רק גורמים אלה זוהו משמעותיים או רלוונטיים (4.1.2)).
    הערה: גורם יכול להיות משמעותי מבחינת ניתוח מודל אבל לא רלוונטי לתהליך, כלומר השפעתו על תגובה היא <1% בהשוואה לזו של גורמים אחרים.
  3. חזור על שלבים 1-5.2 עד איכות של תחזיות המודל תואם את requirements, למשל סטיית התקן של המודל כפי שצוין על ידי התוכנה מספקת ליישום המיועד. שנה את האסטרטגיה ניסיון אם נדרש חזרות אלה, למשל להשתמש רק flocculant אחד העידון.
  4. העבר ולאשר את התוצאות מהמודל בקנה המידה עד מידת הטייס או היקף ייצור סופי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הפתתה של תמצית טבק עם פולימרים שונים

השיטה המתוארת לעיל שמשה בהצלחה לפתח תהליך של הפתתה של תמציות טבק במהלך הייצור של נוגדנים חד שבטיים (HIV-נטרול נוגדני 2G12) לבין חלבון פלואורסצנטי (DsRed) (איור 1) 16, ומאז הועברה לחלבונים אחרים כולל לקטינים, מועמדים חיסון למלריה חלבונים היתוך (נתונים שלא פורסמו). בדרך כלל, היישום של f...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ההיבט החשוב ביותר שיש להביא בחשבון בעת הגדרת איילה לאפיין הפתתה חלקיקים הוא שהתכנון חייב עקרונית להיות מסוגל לזהות ולתאר את ההשפעות הצפויות או אפשריות 36,38, למשל השפעת pH, סוג הפולימר וריכוז פולימר 16. לכן, חשוב להעריך את החלק היחסי של מרחב תכנון (FDS) לפני תחילת הניסויים בפועל. FDS הוא השבריר של מרחב הניסיוני הרב-ממדי (מכוסה על ידי גורמי העיצוב, pH למשל), אשר במסגרתו ניתן לזהות הבדלים מוגדרים מראש בין שתי תוצאות ניסוי נתונות מערכת של השתנו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

יש המחבר אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

ברצוני להודות לד"ר תומאס רדמאכר על אספקת זרעי הטבק המהונדסים ולאיברהים אל עמדי על טיפוח צמחי הטבק. ברצוני להודות לד"ר ריצ'רד מ. טווימן על הסיוע בעריכה ולפרופ' ד"ר ריינר פישר על הדיונים הפוריים. עבודה זו מומנה בחלקה על ידי המענק המתקדם של מועצת המחקר האירופית "Future-Pharma", הצעה מספר 269110, Fraunhofer-Zukunftsstiftung (קרן העתיד של Fraunhofer) והתוכניות הפנימיות של Fraunhofer-Gesellschaft במסגרת מענק מס. משוך 125-600164.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2100P נייד טורבידימטרHach4650000טורבידימטר
2G12 נוגדןPolymunAB002נוגדן
ייחוס Biacore T200GE Healthcare28-9750-01מכשיר SPR
BP-410Furh2632410001מסנן תיק
Catiofast VSHBASF79002360Flocculating Agent
צנטריפוגה 5415DEppendorf5424 000.410צינור צנטריפוגה
15 מ"לשפופרתתגובה 2017106 לבומדיק
50 מ"לצינור תגובה1110504 לבומדיק
ChitosanCarl Roth GmbH5375.1חומר פלוקולציה
Design-Expert(R) 8Stat-Ease, Inc.תוכנת n.a.DoE
דיסודיום פוספטCarl Roth GmbH  4984.3 רכיב מדיה
Ferty 2 MegaKammlott5.220072דשן
פורמה -86C מקפיא ULT מקפיאThermoFisher88400
מקפיא חממהצמחים
גרודן קוביות צמר סלעים 10 x 10 ס"מגרודן102446בלוק צמר סלעים
HEPESCarl Roth GmbH9105.3רכיב מדיה
K700P 60DPall5302305עומק מסנן
שכבת KS50P 60DPallB12486עומק שכבת סינון
MiraclothLabomedic475855-1Rבד סינון
MultiLine Multi 3410 IDSWTWWTW_2020pH meter / מד מוליכות
Osram מגניב לבן 36 WOsram4930440מקור אור
PhytotronIlka Zelln.a.לגידול צמחים
Polymin PBASF79002360חומר פלוקולציה
POLYTRON PT 6100 DKinematica11010110מכשיר הומוגניזציה עם כלי להב מותאם אישית
חלבון ALife טכנולוגיות10-1006חלבון קושר נוגדנים
נתרן כלוריCarl Roth GmbHP029.2סינרגיה של רכיב מדיה
HTBioTekSIAFRTקורא לוחות פלואורסצנטי
TRISCarl Roth GmbH4855.3רכיב מדיה
Tween-20Carl Roth GmbH9127.3רכיב מדיה
VelaPad 60PallVP60G03KNH4בית מסנן
Zetasizer Nano ZSMalvernZEN3600DLS מדידת התפלגות גודל חלקיקים
העומד בפני עצמו n.a.n.a.לגידול

מקורות

  1. Godfray, H. C. J., et al. Food Security: The Challenge of Feeding 9 Billion People. Science. 327, 812-818 (2010).
  2. Fischer, R., Schillberg, S., Buyel, J. F., Twyman, R. M. Commercial aspects of pharmaceutical protein production in plants. Curr. Pharm. Des. 19, 5471-5477 (2013).
  3. Pastores, G. M., et al. A Phase 3, multicenter, open-label, switchover trial to assess the safety and efficacy of taliglucerase alfa, a plant cell-expressed recombinant human glucocerebrosidase, in adult and pediatric patients with Gaucher disease previously treated with imiglucerase. Blood Cells Mol. Dis. 53, 253-260 (2014).
  4. De Paepe, D., et al. A comparative study between spiral-filter press and belt press implemented in a cloudy apple juice production process. Food Chem. 173, 986-996 (2015).
  5. Buyel, J. F., Twyman, R. M., Fischer, R. Extraction and downstream processing of plant-derived recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 33, 902-913 (2015).
  6. Wilken, L. R., Nikolov, Z. L. Recovery and purification of plant-made recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 30, 419-433 (2012).
  7. Buyel, J. F. Process development trategies in plant molecular farming. Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).
  8. Hassan, S., Keshavarz-Moore, E., Ma, J., Thomas, C. Breakage of transgenic tobacco roots for monoclonal antibody release in an ultra-scale down shearing device. Biotechnol. Bioeng. 111, 196-201 (2014).
  9. Hassan, S., van Dolleweerd, C. J., Ioakeimidis, F., Keshavarz-Moore, E., Ma, J. K. Considerations for extraction of monoclonal antibodies targeted to different subcellular compartments in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 6, 733-748 (2008).
  10. Buyel, J. F., Fischer, R. Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves. Biotechnol. J. 9, 415-425 (2014).
  11. Buyel, J. F., Fischer, R. Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants. Bioengineered. 5, 138-142 (2014).
  12. Gregory, J., Barany, S. Adsorption and flocculation by polymers and polymer mixtures. Adv. Colloid Interface Sci. 169, 1-12 (2011).
  13. Zhou, Y., Franks, G. V. Flocculation mechanism induced by cationic polymers investigated by light scattering. Langmuir. 22, 6775-6786 (2006).
  14. Runkana, V., Somasundaran, P., Kapur, P. C. Mathematical modeling of polymer-induced flocculation by charge neutralization. J. Colloid Interface Sci. 270, 347-358 (2004).
  15. Hjorth, M., Jorgensen, B. U. Polymer flocculation mechanism in animal slurry established by charge neutralization. Water Res. 46, 1045-1051 (2012).
  16. Buyel, J. F., Fischer, R. Flocculation increases the efficacy of depth filtration during the downstream processing of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco. Plant Biotechnol. J. 12, 240-252 (2014).
  17. Buyel, J. F., Opdensteinen, P., Fischer, R. Cellulose-based filter aids increase the capacity of depth filters during the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins. Biotechnol. J. 10, 584-591 (2014).
  18. Yasarla, L. R., Ramarao, B. V. Dynamics of Flocculation of Lignocellulosic Hydrolyzates by Polymers. Ind. Eng. Chem. Res. 51, 6847-6861 (2012).
  19. Montgomery, D. C. Design and Analysis of Experiments. , John Wiley & Sons Incorporated. (2007).
  20. Buyel, J. F., Fischer, R. Characterization of complex systems using the design of experiments approach: transient protein expression in tobacco as a case study. J. Vis. Exp. , e51216(2014).
  21. Espuny Garcia Del Real, G., Davies, J., Bracewell, D. G. Scale-down characterization of post-centrifuge flocculation processes for high-throughput process development. Biotechnol. Bioeng. 111, 2486-2498 (2014).
  22. Rathore, A. S., Sofer, G. Process Validation in Manufacturing of Biopharmaceuticals, 3rd edn, Vol. 1. , Taylor & Francis. (2012).
  23. Kang, Y., et al. Development of a Novel and Efficient Cell Culture Flocculation Process Using a Stimulus Responsive Polymer to Streamline Antibody Purification Processes. Biotechnol. Bioeng. 110, 2928-2937 (2013).
  24. Menkhaus, T. J., Eriksson, S. U., Whitson, P. B., Glatz, C. E. Host selection as a downstream strategy: Polyelectrolyte precipitation of beta-glucuronidase from plant extracts. Biotechnol. Bioeng. 77, 148-154 (2002).
  25. Holler, C., Vaughan, D., Zhang, C. M. Polyethyleneimine precipitation versus anion exchange chromatography in fractionating recombinant beta-glucuronidase from transgenic tobacco extract. J. Chromatogr. A. 1142, 98-105 (2007).
  26. Buyel, J. F., Fischer, R. Synthetic polymers are more effective than natural flocculants for the clarification of tobacco leaf extracts. J. Biotechnol. 195, 37-42 (2014).
  27. Pearson, C. R., Heng, M., Gebert, M., Glatz, C. E. Zeta potential as a measure of polyelectrolyte flocculation and the effect of polymer dosing conditions on cell removal from fermentation broth. Biotechnol. Bioeng. 87, 54-60 (2004).
  28. Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco. Biochem. Eng. J. 88, 162-170 (2014).
  29. Wang, S., Liu, C., Li, Q. Impact of polymer flocculants on coagulation-microfiltration of surface water. Water Res. 47, 4538-4546 (2013).
  30. Menkhaus, T. J., Anderson, J., Lane, S., Waddell, E. Polyelectrolyte flocculation of grain stillage for improved clarification and water recovery within bioethanol production facilities. Bioresour. Technol. 101, 2280-2286 (2010).
  31. Mune, M. A. M., Minka, S. R., Mbome, I. L. Optimising functional properties during preparation of cowpea protein concentrate. Food Chem. 154, 32-37 (2014).
  32. Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnol. Bioeng. 109, 2575-2588 (2012).
  33. Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination. Biotechnol. Bioeng. 110, 471-482 (2013).
  34. Buyel, J. F., Fischer, R. A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers. Process Biochem. 50, 859-866 (2014).
  35. Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. DOE Simplified: Practical Tools for Effective Experimentation. Vol. 1. 1, Taylor & Francis. (2000).
  36. Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. Response Surface Methods Simplified. , Productivity Press. (2005).
  37. Buyel, J. F., Fischer, R. Generic chromatography-based purification strategies accelerate the development of downstream processes for biopharmaceutical proteins produced in plants. Biotechnol. J. 9, 566-577 (2014).
  38. Myers, R. H., Montgomery, D. C., Anderson-Cook, C. M. Response Surface Methodology: Process and Product Optimization Using Designed Experiments. , Wiley. (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים