הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הר שלם

8.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53968

⸱

15 במרץ 2016

 ,  , 
1Department of Geobiology, Georg-August University of Göttingen

במאמר זה

סיכום

מטרת פרוטוקול זה היא לספק למשתמשים סט של שיטות לפירוק קפסולציה בתפוקה גבוהה של עוברים וזחלים של Lymnaea stagnalis כהכנה להכלאה שלמה באתר, ולטיפולים הבאים לפני ואחרי הכלאה.

תקציר

הר שלם הכלאה באתרו (WMISH) היא טכניקה המאפשרת את הרזולוציה המרחבית של מולקולות של חומצות גרעין (לעתים קרובות mRNAs) בתוך תכשיר 'הר שלם' רקמות, או שלב התפתחותי (כגון עובר או זחל) של עניין. WMISH היא בעלת עוצמה אדירה, כי זה יכול לתרום באופן משמעותי את האפיון הפונקציונלי של הגנום מטזואניים מורכבים, אתגר נהיה יותר של צוואר בקבוק עם מבול של נתונים רצף הדור הבא. למרות הפשטות המושגית של הטכניקה הרבה זמן יש צורך לעיתים קרובות כדי לייעל את הפרמטרים השונים הגלומים לניסויים WMISH למערכות מודל הרומן; הבדלים דקים במאפייני הסלולר ביוכימיים בין סוגי רקמות שלבי התפתחות אומרים כי שיטת WMISH יחידה לא יכולה להיות מתאימה לכל המצבים. פתחנו מערכת של שיטות WMISH עבור stagnalis Lymnaea מודל חלזון מתעורר מחדש שיוצרים עקבאותות WMISH ברורים עבור מגוון של גנים, ועל פני כל שלבי ההתפתחות. שיטות אלה כוללות הקצאה של זחלים של גיל כרונולוגי ידוע חלון ד"ר מר, ההסרה ביותר של עבר זחלים מן קפסולות הביצה שלהם, היישום של טיפול proteinase-K מתאים לכל חלון ד"ר מר, הכלאה, כלאה-פוסט immunodetection צעדים. שיטות אלה מספקים בסיס שממנו את האות שהתקבל עבור תעתיקי הרנ"א נתונים יכול להיות מעודן יותר עם התאמות ספציפיות בדיקה (בדיקת ריכוז בעיקר וטמפרטורת הכלאה).

מבוא

רכיכות הן קבוצה של בעלי חיים אשר מחזיקים את האינטרס של מגוון רחב של דיסציפלינות מדעיות. למרות מגוון מורפולוגיים שלהם 1, מיני עושר (שני רק פרוקי הרגליים מבחינת מספר מינים 2) ורלוונטי למגוון רחב של מסחרי 3, רפואיות ומדעיים 4 סוגיות 5-8, קיימים מעט מאוד מיני molluscan כי יכול לטעון בשני מודלים מדעיים מאובזרים וקל לתחזוקה בסביבה להיות במעבדה. רכיכות אחד משמשת במידה רבה על ידי דיסציפלינות כגון נוירוביולוגיה 9, ecotoxicology 10 וביולוגיה אבולוציונית ולאחרונה 11,12, הוא stagnalis Lymnaea, בעיקר בגלל ההפצה הנרחבת שלה וקל קיצוניים של תחזוקה. למרות הפופולריות שלו כאורגניזם "מודל" וההיסטוריה הארוכה של שימוש על ידי ביולוגים התפתחותיים 13-19, טווח וכוח של כלים מולקולריים לרשות L. stagnהקהילה המדעית alis טמונה הרחק מאחור כי מודלים של בעלי חיים מסורתיים יותר (דרוזופילה, עכבר, קיפוד ים, נמטודות).

הרצון שלנו לפתח Lymnaea כמודל מולקולרי נובע עניין המנגנונים המולקולריים מנחה היווצרות פגז. זה הניע לנו לחדד סט של טכניקות שתאפשרנה להדמיה היעילה, עקבית ורגישה של ביטוי גנים במהלך ההתפתחות של Lymnaea. הר שלם הכלאה באתרו (WMISH) מועסק נרחב עבור מגוון רחב של אורגניזמים מודל כבר בשימוש במשך יותר מ -20 40 שנה. בתחפושות שונות שלה, שאני עורך יכול להיות מועסק על מנת לבצע לוקליזציה לוקוסים ספציפיים מרחבית על הכרומוזומים, rRNA, mRNA ו-RNAs מיקרו.

אחד האתגרים שאנחנו צריכים לטפל לפני תחילת תהליך זיקוק שיטת WMISH עבור L. stagnalis היה בסוגיית בעדינות וביעילות לחילוץ עוברים וזחלים של שלבים הנעים בין tהוא קפסולות הביצה שבה הם מופקדים. מיצוי זה, או 'decapsulation', צריך להיות מושג בצורה יעילה כדי לאסוף חומר מתאים לשיעור נתון בניסוי באתרו, ואילו באותו זמן שמירה על שלמות מורפולוגיים הסלולר. בעוד אורגניזמים מודל אחרים גם לעבור התפתחות כמוסה, בידינו אף אחת מהשיטות ודווחו מינים אלה יכולים להיות מועסקים בהצלחה ל stagnalis.

מטרות העל של שיטה זו הן אפוא: לחלץ ל stagnalis עובר זחלים מן הכמוסות שלהם באופן תפוקה גבוהה, כדי להחיל טיפולים מראש כלאה המביאות למרב את אות WMISH, להכין עוברים וזחלים עם WMISHsignals משביע רצון עבור הדמיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: השלבים הבאים מתארים את השיטה שלנו לעריכה בניסוי באתרו על במות עובריות זחל של L. stagnalis. איפה צעד כרוך בשימוש חומר כימי מסוכן זה מצוין על ידי המילה 'זהירות' וכל נהלי הבטיחות המתאימים יש לאמץ. קישורים לגיליונות נציג MSDS לכימיקלים מסוכנים ניתנים משלים קובץ 1. מתכונים לכל ריאגנטים ניתנים קובץ משלים 2.

1. אסיפה של מכשירי Decapsulation

  1. לשם כך, לחבר 20 מזרק חד פעמי מ"ל צינורות סיליקון (בקוטר פנימי של 1 מ"מ קוטר חיצוני של 3 מ"מ) באמצעות קיצוץ קצה P1,000 לגובה בלתי הולם כפי שמוצג באיור 2 א.
  2. קלטת שקופיות מיקרוסקופ רגילות צלחת פטרי גדולה הפוכה. קלטתי את צינורות סיליקון סמוכים מייד לשקופית מיקרוסקופ כפי שמוצג באיור60; 2C ו 2D.
  3. לנוח מחט זכוכית משך בשקופית מיקרוסקופ בעדינות להכניס אותו לתוך צינורות סיליקון עד קצה המחט יבלוט כ- 20% מאורכו של הגשר הקוטר הפנימי של הצינור (ראה איור 2 ג ו 2D). ברגע שהמחט נמצאת בעמדה קלט אותה למטה כדי בצלחת פטרי.
  4. אפשר את הקצה החופשי של צינור סיליקון לנוח עוד צלחת פטרי כי תאסוף את חומר decapsulated.

2. לדוגמא אוסף, קיבוע Decapsulation

הערה: כל השלבים מבוצעים ב RT אלא אם צוין אחרת.

  1. בזהירות לאסוף מחרוזות הביצית מן הקירות של אקווריום. לשם כך, השתמש חתיכת שטוח מפלסטיק גמיש כמו מרית לגרד את המחרוזת בייץ את המצע, ולהשתמש מסננת תה פלסטיק לדוג את מחרוזת הביצה צפה אל מחוץ למים. שלב ולמיין את החומר תחת מיקרוסקופ באמצעות המדריך המסופק באיור1.
  2. מניח את מחרוזת הביצה על גבי מגבת נייר ולעשות חתך אורכי לאורך המוני הביצה באמצעות מלקחי הנוצה. מגלגל את קפסולות הביצה מתוך מחרוזת הביצה להסיר כמה שיותר חומר הג'לי ככל האפשר מכל הקפסולה על ידי דוחף אותם סביב מגבת נייר באמצעות מלקחי הנוצה.
  3. באמצעות מלקחיים נוצה, להעביר את הכמוסות ביצה לתוך צלחת פטרי המכילה 5 מ"ל של מי ברז. המשך לאסוף קפסולות ביצה קרוש דה של השלבים ההתפתחותיים הרצוי לתוך המנה הזו. אסוף מספיק קפסולות מכל שלבי ההתפתחות לניסוי WMISH המתוכנן ולאחר מכן להמשיך לשלב הבא.
  4. כשעובד עם זחלים מפותחים יותר (5 ימים שלאחר מהחשוף ראשון (dpfc) ומעלה) לטשטש אותם לפני הקיבוע.
    הערה: פעולה זו תמנע שרירים מלהתקשר מה שהופך את הפרשנות של בדפוסי מכתים באתרו מאוד קשים.
    1. תירגע זחלים (בזמן שהם עדיין capsu שלהםles) בתמיסה 2% w / v של MgCl 2 • 6H 2 O למשך 30 דקות לפני קיבוע.
    2. להעריך את מידת הרפיה לאחר 30 דקות על ידי השריית בעוד זחלים כמה עדיין בכמוסות הביצה שלהם בתמיסה מקבעת וניטור תגובתם תחת מיקרוסקופ. חלקי זחלים רגועים יהיו לסגת לתוך קליפתם, בעוד זחלים רגועים לחלוטין לא יגיבו. לאחר הזחלים הללו היו רגועים להמשיך לשלב הבא.
  5. מעבירים את קפסולות ביצה בעזרת פיפטה פלסטיק נשא רחב לתוך צינור סגר המספק 10 פעמים את נפח כמוסות ביצה (למשל., 1 מ"ל של קפסולות התיישבו ידרוש צינור מ"ל 10+).
  6. לשאוב כמה שיותר נוזלים ככל האפשר מהצינור ולהחליף עם נפח של פתרון מקבע כי הוא 10x היקף קפסולות הביצה התיישבה. בעדינות לסובב את כמוסות הביצה מקבעת ב RT בפעם המתאימה לכל שלב התפתחותי (ראה איור 1).
  7. Discontinסיבוב ue ולאפשר קפסולות לשקוע לשאוב את הפתרון מקבע לתוך מיכל פסולת מתאים.
  8. שטפו את קפסולות ביצה ידי החלפת הפתרון מקבע עם בופר פוספט עם 0.1% Tween-20 (PBTw) וסיבוב ב RT במשך 5 דקות. לשאוב PBTw וחזור פעמיים.
  9. סר עובר וזחלים מ הכמוס שלהם באמצעות המנגנון (ראה סעיף 1 לפרטים נוספים) שמוצג באיור 2. צייר את הכמוסות לתוך מזרק 20 מיליליטר, לצרף את הצינורות ולאחר מכן לפזר את הכמוסות דרך הצינורות והעבירו את מחט הזכוכית אל המנה האוספת.
    הערה: בדרך כלל, הרוב (> 90%) של כל הכמוסות צריך צריך רק אחד לעבור דרך המכשיר. במקרים רבים קרום הקפסולה פגום אבל עובר וזחלים להישאר בתוך הקפסולה מהקרע. עבד מחדש את החומר הזה פשוט על ידי ציור אותו לתוך מזרק להפיג את זה שוב.
  10. אסוף את העוברים decapsulated וזחלים לתוך צינור 1.5 מ"ל באמצעות מיקרופוןropipette (א P20 עבור 0 - זחלים בן 3 יום, וכן P200 עבור זחלים מבוגרים עם סוף הקצה מנותק).
    הערה: שתיקה (עד מספר חודשים) בפרוטוקול יכול להיעשות בשלב זה. אם זה נדרש, החומר decapsuled יש לאסוף לתוך צינור 1.5 מ"ל לאחסון (המשך לשלב הבא). אחרת להמשיך מיד לפרוטוקול 3.
  11. אפשר העוברים וזחלים לשקוע לתחתית הצינור לשאוב supernatant. חלף עם 33% אתנול (EtOH) ב PBTw ולתת לשבת במשך 5 - 10 דקות. אני חוזר עם 66% EtOH ב PBTw ו 100% EtOH. לשטוף זחלים פעמים 100% EtOH ב RT. אחסן את החומר ב -20 ° C. ב 100% EtOH.
  12. כאשר מוכן להמשיך, מחדש מימה דגימות ידי הסרת 100% EtOH והחלפת עם 66% EtOH ב PBTw, ולתת לשבת במשך 5 - 10 דק '. אני חוזר עם 33% EtOH ב PBTw, ולתת לשבת במשך 5 - 10 דקות. לבסוף לשטוף עם 3x 5 שטיפות דקות של PBTw מנת להבטיח את כל EtOH מוסר.

3. proteinase-K, TEA ופוסט-fixation

הערה: אנו מוצאים ביצוע הצעדים הבאים בסלים קטנים עם רצפת רשת השיטה היעילה והעדינה ביותר להחלפה מהר הפעם פתרונות קריטיים. בעוד יכולים להתבצע האלה הביתה, אנו משתמשים סלים (בגודל בינוני) התואמים את רובוט Intavis InSituPro -Vsi טיפול הנוזלי (www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc). סלים כאלה יכולים להיות בקלות ובמהירות נע בין הבארות של צלחת בתרבית רקמה 12 היטב (TCD) כדי פתרונות החליפין, או הפתרון יכול להישאף מהבאר בעזרת פיפטה. לחלופין, כל חילופי פתרון יכול להתבצע ללא סלים אלה פשוט על ידי aspirating את supernatant מן הזחלים. במקרה זה בתנועות סיבוביות עדינות יהיה לרכז את כל העוברים וזחלים אל מרכז הצלחת המאפשר supernatant להסירו מקצה הבאר. להלן מניח שהמשתמש העסיק סלים עבור חילופי פתרון.

  1. בעזרת פיפטההעברה, עוברים וזחלים לתוך סל יושב TCD 12 היטב עם 2 מ"ל של PBTw.
    הערה:. המספר עוברי ו / או זחלים שניתן להוסיף תלויה בשלב ההתפתחותי נחקרת, אולם ככלל אצבע היא לשמור לפחות 25% של שטח הרצפה החופשי של עוברים / זחלים (כלומר, לא לגדוש את הסל).
  2. הכן סמוך היטב עם 2 מ"ל של הפתרון proteinase-K המתאים (ראה איור 1), ועוד 2 בארות עם 2 מ"ל של 0.2% גליצין כל. הזז כל סל לבאר המכיל את הריכוז המתאים של proteinase-K ומיד להתחיל העיתוי.
  3. לאחר 10 דקות להזיז כל סל לתוך גליצין 0.2% המכיל היטב דגירה במשך 5 דקות. ואז להזיז כל סל לתוך הבאר השנייה עם 0.2% גליצין דגירה במשך 5 דקות. לשטוף את גליצין עם 3x 5 חילופי דקות של 3 מ"ל PBTw.
  4. הסר את הפתרון PBTw ולטפל דגימות פעם עם מוכן טרי Triethanolamine (TEA) סולution לזהירות 5 דקות! אל להתסיס. החלף עם 3 מ"ל של תמיסת TEA מוכן טרי למשך 5 דקות. אל להתסיס. לשאוב את רוב פתרון TEA ממדגמים. מוסיפים את Triethanolamine מוכן טרי עם חומץ אנהידריד (TEAAA) פתרון דגירה במשך 5 דקות. זהירות! אל להתסיס.
  5. אופציונאלי - בעוד הצעד לעיל דוגר, להכין עוד קבוצה חדשה של פתרון TEAAA וחזור על השלב לעיל.
    הערה: הטיפול השני זה עם TEAAA הוא אופציונלי, אך עשוי לעזור לחסל את כל הרקע לחלוטין עם בדיקות נוטה לייצר ברקע.
  6. הסר את הפתרון TEAAA ידי aspirating זה מהבאר ולהחליף עם 3 מ"ל של PBTw. אל להתסיס. הסר את PBTw ולהחיל 3 מ"ל של פורמלדהיד 3.7% ב PBTw. מערבולת בעדינות מדי פעם במהלך הדגירה 30 דקות.
  7. הסר את מקבע על ידי aspirating זה מהבאר ולהחליף עם 3 מ"ל של PBTw. העברת את החומר לתוך צינור 1.5 מ"ל. RePlace PBTw עם חיץ הכלאה ו דגירה במשך 5 דקות ב RT - זהירות.
  8. מניח את הצינורות לתוך גוש חם ב RT, ולהגדיר את הטמפרטורה לטמפרטורת הכלאה הרצויה.
    הערה: טמפרטורת הכלאה היא בדיקה ספציפית ותהיה צריך להיות מותאם באופן אמפירי, אולם אנו מוצאים 55 ° C להיות טמפרטורה טובה בתחילה לדין. אפשר לחסום לבוא טמפרטורת הכלאה, ולאפשר הדגימות טרום להכליא למשך כ 15 דקות (כלומר, הזמן שנדרש כדי להכין את riboprobes, כבר אין צורך). כן כרכים נאותים (בדרך כלל 100 μl) של riboprobes המדולל. אנחנו בדרך כלל ריכוזים בדיקת בדיקה של 100 ו -500 ng / ml כמו מגוון ראשוני. אנחנו מכינים riboprobes פי 12.
  9. הסר את חיץ הכלאה ממדגמים ולהוסיף החללית במאגר הכלאה על דגימות. שכבה עם 100 μl (או נפח מספיק כדי לגבש שלב מעל כלת buffer) של שמן מינרלים.
    הערה: שמן המינרלים מונע עיבוי נרחב שיהווה במהלך שלב הכלאה הממושך. עיבוי נרחב יהיה לשנות באופן משמעותי הוא את הכימיה של הפתרון הכלה ואת הריכוז של החללית.
  10. לפגל החללית לבין היעד RNA על ידי חימום הדגימות עד 75 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, מנמיכים את חום לטמפרטורה הכלאה הרצוי. אפשר הכלאה כדי להמשיך למשך תקופה מינימלית של 12 שעות (O / N) או יותר (24 - 48 שעות).
  11. במהלך הכלאה להסיר צינור יחיד מהגוש החום, לסובב אותו במהירות בין האגודל לאצבע המורה להשעות את הזחלים מבלי להפריע את השלב הנפט, ולהחליף אותו בבלוק חום. חזור פעם אחת זה כל 6 - 12 שעות בערך.

4. חם מתרחץ immunodetection

הערה: בעוד אנו משתמשים רובוט נוזלי טיפול עבור השלבים הבאים, אלה גם יכולים בקלות להיעשות באופן ידני. במקרה זה, עובר וזחלי shoULD להישמר 1.5 מ"ל צינורות הם הכלאה ב. כל חילופי פתרון שלאחר מכן הם aspirated והוסיף עם טפטפת P1,000. כאשר מבוצע באופן ידני כל אחד מן השלבים הבאים צריכים להעסיק 1 מ"ל של כל פתרון.

  1. כרכים חומים נאותים (3 מיליליטר כל אחד עבור כל דגימה) של 4x, 2x ו 1x פתרונות לשטוף לטמפרטורת ההכלאה.
  2. לשטוף את כל הדגימות שלוש פעמים חיץ לשטוף 4x במשך 15 דקות כל אחד בטמפרטורת ההכלאה. לשטוף את כל הדגימות שלוש פעמים חיץ לשטוף 2x במשך 15 דקות כל אחד בטמפרטורת ההכלאה. לשטוף את כל הדגימות שלוש פעמים חיץ לשטוף 1x במשך 15 דקות כל בטמפרטורת ההכלאה.
  3. לשטוף את כל דגימות פעם עם חיץ 1x נתרן כלוריד נתרן ציטראט + 0.1% Tween (Tween SSC + 0.1%) בטמפרטורת ההכלאה. אפשר דגימות להתקרר RT.
  4. לשטוף את כל הדגימות פעמי Tween 1x SSC + 0.1% במשך 15 דקות חלף פתרון SSC 1x זה עם Maleic חומצת הצפה (MAB) ולתת לשבת במשך 10 דקות חזור על MAB wאֵפֶר. חלף MAB עם פתרון לחסום דגירה במשך 1.5 שעות.
  5. להחליף את הפתרון לחסום עבור פתרון נוגדנים (1: 10,000 דילול של נוגדן פתרון לחסום) ו דגירה של 12 שעות (O / N) ב RT עם תסיסה עדינה.

פיתוח צבע 5. שם

  1. לשאוב את פתרון הנוגדן ולשטוף 15 פעמים עם PBTw במשך 10 דקות כל אחד. החלף PBTw עם הצפת phosphatase 1x אלקליין (AP) ו דגירה של 10 דקות.
  2. בעוד תמורת שלב דגירה לעיל, להכין את הפתרון המכתים AP (ראה משלים קובץ 2) - זהירות. מעביר את החומר לתוך TCD היטב ולהחליף פתרון AP 1x עם פתרון מכתים AP. הערת הזמן עכשיו כך את משך זמן תגובת הצבע מתקיימת עבור ניתן להקליט. לפקח על הפיתוח של הדפוס המכתים עד אות יחס ברקע היא אופטימלית.
  3. כדי לעצור התפתחות צבע, להסיר את הפתרון מכתים 1x AP (להשליך את wast המתאיםמיכל ה), ולהחיל 2 מ"ל של PBTw וציין את השעה כרגע. לשטוף פעמיים נוספות עם PBTw במשך 5 דקות כל אחד. השתמש באחת שטיפות אלה להעביר את החומר לתוך צינור 1.5 מ"ל.
  4. הסר את PBTw וליישם 1 מ"ל של פורמלדהיד 3.7% ב PBTw להתסיס או לסובב עבור לפחות 30 דקות ב RT (זה יכול להיעשות גם O / N).
  5. יש לשטוף היטב את מקבע עם 3 שוטף של PBT (להשליך מקבע פסולת במכל פסולת מתאים). שטפו את דגימות 3 פעמים ב 50 מעלות צלזיוס במים דה מיונן.
    הערה: שטיפות אלה לחסל את המשקעים של מלחים שעלולים להיות גלויים במהלך ניקוי וצעדים ויזואליזציה.
  6. להחליט אם הדגימות צריכות להיות מותקנות בתוך בנזיל בנזואט: בנזיל אלכוהול (BB: BA, הידוע גם בשם הברור של מוריי) או גליצרול.
    הערה: אנו מעדיפים את הסולק חזק יותר BB: BA כמו L. עוברים stagnalis הם קצת אטום. דוגמאות כדי להיות מותקנות ב BB: BA תחילה עליך להיות מיובש באמצעות סדרת אתנול. דוגמאות כדי להיות מותקנות ב 60%גליצרול ניתן לתליה מייד.
  7. העברת הדגימות לתוך תמיסת ההרכבה (BB: BA או 60 גליצרול%) בעזרת פיפטה.
    הערה: כאשר גובר BB: BA זה חייב להיעשות בתוך כוס היטב (BB: BA יתמוסס פלסטיק פוליקרבונט).
  8. אפשר הדגימות כדי לנקות עבור 5 - 10 דקות, ולאחר מכן לטעון אותם לשקופית באמצעות מספר מתאים של coverslips מוערם כמו מפרידים (1 coverslip על דגימות <1 dpfc, 2 coverslips עבור דגימות> 1 dpfc).
    הערה: mounts כל ניתן הדמיה החברה באמצעות מיקרוסקופ מתחם עם אופטיקה דסק"ש.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

דפוסי מכתים נציג WMISH שמוצג באיור 3 נוצרו באמצעות הטכניקה המתוארת לעיל, ומשקפים מגוון של דפוסי הביטוי המרחבי עבור גנים המעורבים מגוון של תהליכים מולקולריים החל היווצרות פגז (גן Novel 1, 2, 3 ו -4), כדי איתות תאים תאים (DPP) לרגולציה שעתוק (Brachyury) על פני מגוון של שלבים התפתחותיים. אמנם יש לנו לא כמתנו את רמות הביטוי של גנים אלה אנו מצפים שהוא קיימים גם להשתנות באופן משמעותי, מה שמעיד כי השיטה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השיטה המתוארת כאן מאפשרת הדמיה היעילה של תעתיקי רנ"א עם הנראה רמות ביטוי שונות בתוך כל שלבי ההתפתחות של Lymnaea stagnalis. כדי להסיר עבר זחלים מן הכמוסות שלהם אנו trialed מגוון של כימיקלים, הלם אוסמוטי וטיפולים פיסיים ודווח encapsulated- אחר פיתוח אורגניזמים מודל. עם זאת, בידינו השיטה אנו מתארים כאן היא טכניקת התפוקה גבוהה רק שמסירה את הקרום קופסית הקשה מבלי לפגוע בעוברים וזחלים. בעקבות decapsulation, החומר יכול להיות מאוחסן או, או מטופלים עם משטר בשלב מסוים של prote...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים אין לי מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מימון כדי DJJ דרך JA2108 # פרויקט DFG / 2-1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מלקחיים במשקל נוצהEhlert & שותף#4181119
צינורות סיליקוןGlasgerä tebau OCHS GmbH760070
נימי זכוכיתהילגנברג1403547
12 כלי תרבית רקמותבאר Carl RothCE55.1
37% פורמלדהידCarl RothP733.1זהירות - עלול לגרום לסרטן. רעיל בשאיפה, במגע עם העור ובמקרה של בליעה. רעיל: סכנה להשפעות בלתי הפיכות חמורות מאוד בשאיפה, במגע עם העור ובמקרה של בליעה.
אתילנדיאמין חומצה טטראצטיתקרל רוטCN06.3זהירות - גורם לגירוי בעיניים. עלול לגרום לגירוי בדרכי הנשימה ובעור. הימנע מנשימת אבק. יש להימנע ממגע עם העיניים, העור והבגדים. יש להשתמש רק עם אוורור נאות
מגנזיום כלורידCarl Roth2189.1
Tween-20Carl Roth9127.1אזהרה - עלול להזיק בשאיפה. עלול לגרום לגירוי בדרכי הנשימה. עלול להזיק אם נספג דרך העור. עלול לגרום לגירוי בעור. עלול לגרום לגירוי בעיניים. עלול להזיק במקרה של בליעה.
נתרן כלוריקארל רוט3957.1
פיקול סוג 400קארל רוטCN90.1
פוליוויניל פירולידון K30 (MW 40)קארל רוט4607.1אזהרה - עלול להזיק בשאיפה. עלול לגרום לגירוי בדרכי הנשימה. עלול להזיק אם נספג דרך העור. עלול לגרום לגירוי בעור. עלול לגרום לגירוי בעיניים. עלול להזיק במקרה של בליעה.
Nuclease freeBovine סרום אלבומיןקארל רוט8895.1
זרע סלמוןקארל רוט5434.2
הפריןקארל רוט7692.1זהירות - תופעות לוואי כוללות דימום, גירוי מקומי. תגובה אלרגית אפשרית במקרה של שאיפה, בליעה/מגע. מגרה את העיניים/עור/דרכי הנשימה. רגישות יתר אפשרית. במהלך ההריון דווח כמגביר את הסיכון ללידה שקטה
פרוטאינאז-Kקארל רוט7528.1
גליציןקארל רוט3790.2
פורממיד נטול יוניםקארל רות'P040.1אזהרה - מגרה את העיניים והעור. עלול להזיק בשאיפה, במגע עם העור ובמקרה של בליעה. עלול לגרום נזק לילד שטרם נולד. היגרוסקופי.
פורממיד סטנדרטיCarl Roth6749.3אזהרה - מגרה את העיניים והעור. עלול להזיק בשאיפה, במגע עם העור ובמקרה של בליעה. עלול לגרום נזק לילד שטרם נולד. היגרוסקופי.
טריאתנולאמיןקארל רוט6300.1זהירות - הימנע מנשימת אדים או ערפל. יש להימנע ממגע עם העיניים. יש להימנע ממגע ממושך או חוזר עם העור. יש לשטוף היטב לאחר הטיפול.
אנהידריד אצטיקארל רוט4483.1זהירות - גורם לכוויות קשות בעור ובעיניים. מגיב באלימות עם מים. מזיק במקרה של בליעה. אדים מגרים את העיניים ודרכי הנשימה
חומצה מאליתקרל רוטK304.2זהירות - מסוכן מאוד במקרה של קשר עין (מגרה), של בליעה, . מסוכן במקרה של מגע עור (מגרה), של שאיפה (מגרה ריאות). מעט מסוכן במקרה של מגע עור (מחלחל). קורוזיבי לעיניים ולעור.
בנזיל בנזואטSigmaB6630-250MLאזהרה - עלול להזיק בשאיפה. עלול לגרום לגירוי בדרכי הנשימה. עלול להזיק אם נספג דרך העור. עלול לגרום לגירוי בעור. עלול לגרום לגירוי בעיניים. מזיק במקרה של בליעה.
בנזיל אלכוהולסיגמא10,800-6אזהרה - מזיק במקרה של בליעה. מזיק בשאיפה. גורם לגירוי חמור בעיניים.
גליצרולקארל רוט3783.1
אבקת חסימהRoche11096176001
Anti DIG Fab שברי Fab AP מצומדRoche11093274910
Tris-HClCarl Roth9090.3
4-Nitro blue tetrazolium chloride בדימתילפורממיד Carl Roth4421.3זהירות - עלול לגרום נזק לילד שטרם נולד. מזיק בשאיפה ובמגע עם העור. מגרה את העיניים.
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphateCarl RothA155.3זהירות - עלול להזיק אם הוא נבלע. אין לעלות על העור, בעיניים או על בגדים. פוטנציאל לגירוי בעור ובעיניים. 
N-אצטיל ציסטאיןCarl Roth4126.1
DithiothreitolCarl Roth6908.1אזהרה - עלול לגרום לגירוי בעיניים ובעור. עלול לגרום לגירוי בדרכי הנשימה והעיכול. התכונות הטוקסיקולוגיות של חומר זה לא נחקרו במלואן.
טרגיטולסיגמאNP40Sאזהרה - עלול להזיק בשאיפה. עלול לגרום לגירוי בדרכי הנשימה. עלול להזיק אם נספג דרך העור. עלול לגרום לגירוי בעור. עלול לגרום לגירוי בעיניים. עלול להזיק במקרה של בליעה.
נתרן דודציל סולפטCarl RothCN30.3אזהרה - מזיק במקרה של בליעה. רעיל במגע עם העור. גורם לגירוי בעור. גורם לנזק חמור לעיניים. עלול לגרום לגירוי בדרכי הנשימה.
אשלגן כלוריקארל רוט6781.1
די-נתרן מימן פוספט דיהידראט (Na2HPO4• 2H2O)Carl Roth4984.1
אשלגן דימימן פוספט (KH2PO4)Carl Roth3904.1
Tri sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7• 2H2O)Carl Roth3580.1אזהרה - עלול לגרום לגירוי בעיניים, בעור ובדרכי הנשימה. התכונות הטוקסיקולוגיות של חומר זה לא נחקרו במלואן.
שמן מינרלי קארל רוטHP50.2
InSituPro-VSI Intaviswww.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc

מקורות

  1. Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools. Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).
  2. Brusca, R. C., Brusca, G. J. Invertebrates. , Sinauer. Sunderland. (2002).
  3. Food and Agriculture Organisation of the United Nations. Global Aquaculture Production 1950-2013. , Available from: http://www.fao.org/fishery/statistics/global-aquaculture-production/query/en (2013).
  4. World Health Organization. Schistosomiasis: number of people treated in 2011. Week. Epi. Rec. 88, 81-88 (2013).
  5. Henry, J. Q., Collin, R., Perry, K. J. The slipper snail, Crepidula.: an emerging lophotrochozoan model system. Biol. Bull. 218 (3), 211-229 (2010).
  6. Perry, K. J., Henry, J. Q. CRISPR/Cas9-mediated genome modification in the mollusc, Crepidula fornicata. Genesis. 53 (2), 237-244 (2015).
  7. Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between genes and synapses. Bio. Rep. 24, 475-522 (2004).
  8. Jackson, D. J., Ellemor, N., Degnan, B. M. Correlating gene expression with larval competence, and the effect of age and parentage on metamorphosis in the tropical abalone Haliotis asinina. Mar. Biol. 147, 681-697 (2005).
  9. Carter, C. J., Farrar, N., Carlone, R. L., Spencer, G. E. Developmental expression of a molluscan RXR and evidence for its novel, nongenomic role in growth cone guidance. Dev. Biol. 343 (1-2), 124-137 (2010).
  10. Rittschof, D., McClellan-Green, P. Molluscs as multidisciplinary models in environment toxicology. Mar. Pollut. Bull. 50 (4), 369-373 (2005).
  11. Liu, M. M., Davey, J. W., Jackson, D. J., Blaxter, M. L., Davison, A. A conserved set of maternal genes? Insights from a molluscan transcriptome. Int. J. Dev. Biol. 58 (6-8), 501-511 (2014).
  12. Hohagen, J., Herlitze, I., Jackson, D. J. An optimised whole mount in situ. hybridisation protocol for the mollusc Lymnaea stagnalis. BMC Dev. Biol. 15 (1), 19(2015).
  13. Raven, C. P. The development of the egg of Limnaea stagnalis. L. from oviposition till first cleavage. Arch. Neth. J. Zool. 1 (4), 91-121 (1946).
  14. Raven, C. P. The development of the egg of Limnaea Stagnalis. L. from the first cleavage till the troghophore stage, with special reference to its' chemical embryology. Arch. Neth. J. Zool. 1 (4), 353-434 (1946).
  15. Raven, C. P. Morphogenesis in Limnaea stagnalis. and its disturbance by lithium. J. Exp. Zool. 121 (1), 1-77 (1952).
  16. Raven, C. P. The nature and origin of the cortical morphogenetic field in Limnaea. Dev. Biol. 7, 130-143 (1963).
  17. Morrill, J. B., Blair, C. A., Larsen, W. J. Regulative development in the pulmonate gastropod, Lymnaea palustris., as determined by blastomere deletion experiments. J Exp Zool. 183 (1), (1973).
  18. Van Den Biggelaar, J. A. M. Timing of the phases of the cell cycle during the period of asynchronous division up to the 49-cell stage in Lymnaea. J. Emb. Exp. Morph. 26 (3), 367-391 (1971).
  19. Verdonk, N. H. Gene expression in early development of Lymnaea stagnalis. Dev. Biol. 35 (1), 29(1973).
  20. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and Detection of Rna-Dna Hybrid Molecules in Cytological Preparations. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 63 (2), 378-383 (1969).
  21. Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis. Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).
  22. Shimizu, K., Sarashina, I., Kagi, H., Endo, K. Possible functions of Dpp in gastropod shell formation and shell coiling. Dev Genes Evol. 221 (2), 59-68 (2011).
  23. Koop, D., Richards, G. S., Wanninger, A., Gunter, H. M., Degnan, B. M. D. The role of MAPK signaling in patterning and establishing axial symmetry in the gastropod Haliotis asinina. Dev. Biol. 311 (1), 200-212 (2007).
  24. Lartillot, N., Lespinet, O., Vervoort, M., Adoutte, A. Expression pattern of Brachyury in the mollusc Patella vulgata suggests a conserved role in the establishment of the AP axis in Bilateria. Development. 129 (6), 1411-1421 (2002).
  25. Jackson, D. J., Wörheide, G., Degnan, B. M. Dynamic expression of ancient and novel molluscan shell genes during ecological transitions. BMC Evol. Biol. 7 (1), 160(2007).
  26. Jackson, D. J., Meyer, N. P., Seaver, E., Pang, K., McDougall, C., et al. Developmental expression of COE. across the Metazoa supports a conserved role in neuronal cell-type specification and mesodermal development. Dev Genes Evol. 220, 221-234 (2010).
  27. Perry, K. J., Lyons, D. C., Truchado-Garcia, M., Fischer, A. H. L., Helfrich, L. W., et al. Deployment of regulatory genes during gastrulation and germ layer specification in a model spiralian mollusc. Dev. Dyn. , (2015).
  28. Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis. Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).
  29. Shimizu, K., Iijima, M., Setiamarga, D. H. E., Sarashina, I., Kudoh, T., et al. Left-right asymmetric expression of dpp in the mantle of gastropods correlates with asymmetric shell coiling. EvoDevo. 4 (1), 15(2013).
  30. Christodoulou, F., Raible, F., Tomer, R., Simakov, O., Trachana, K., et al. Ancient animal microRNAs and the evolution of tissue identity. Nature. 463, (2010).
  31. Koga, M., Kudoh, T., Hamada, Y., Watanabe, M., Kageura, H. A new triple staining method for double in situ hybridization in combination with cell lineage tracing in whole-mount Xenopus embryos. Dev Growth Differ. 49 (8), 635-645 (2007).
  32. Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev. Biol. 11 (1), 43(2011).
  33. Davison, A., Frend, H. T., Moray, C., Wheatley, H., Searle, L. J., Eichhorn, M. P. Mating behaviour in Lymnaea stagnalis. pond snails is a maternally inherited, lateralized trait. Biol. Lett. 5 (1), 20-22 (2009).
  34. Kuroda, R., Endo, B., Abe, M., Shimizu, M. Chiral blastomere arrangement dictates zygotic left-right asymmetry pathway in snails. Nature. 462 (7274), 790-794 (2009).
  35. Shibazaki, Y., Shimizu, M., Kuroda, R. Body handedness is directed by genetically determined cytoskeletal dynamics in the early embryo. Curr. Biol. 14 (16), 1462-1467 (2004).
  36. Lu, T. Z., Feng, Z. P. A sodium leak current regulates pacemaker activity of adult central pattern generator neurons in Lymnaea stagnalis. PLoS One. 6 (4), e18745(2011).
  37. Dawson, T. F., Boone, A. N., Senatore, A., Piticaru, J., Thiyagalingam, S., et al. Gene Splicing of an Invertebrate Beta Subunit (LCav-beta) in the N-Terminal and HOOK Domains and Its Regulation of LCav1 and LCav2 Calcium Channels. PLoS ONE. 9 (4), e92941(2014).
  38. Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools. Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).
  39. Gregory, T. R., Nicol, J. A., Tamm, H., Kullman, B., Kullman, K., et al. Eukaryotic genome size databases. Nuc. Acids. Res. 35 (Database issue), D332-D338 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Proteinase KRiboprobe
הר שלם
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.