שיטות לחקר Mrp4 המכילים מכלולים Macromolecular בחוק הסדרת פיברובלסטים הגירה

Summary

MRP4 מסדיר אירועי איתות נוקלאוטיד תלוי מחזוריים שונים, כולל תפקיד הובהר לאחרונה נדידת תאים. אנו מתארים גישה ישירה, אך רבה לפענח את המטרות המולקולריות במורד הזרם של MRP4 וכתוצאה מכך ההזדהות של interactome MRP4 ייחודי שמנגן תפקידי מפתח בוויסות מכוונת-הקנס של הגירה פיברובלסטים.

Abstract

Multidrug התנגדות חלבון 4 (MRP4) הוא חבר של המשפחה קלטת ATP-מחייב של מובילי הממברנה הוא טרנספורטר בזרימת אנדוגני של נוקלאוטידים מחזורית. על ידי ויסות ריכוז נוקלאוטיד מחזורי תאי, MRP4 יכול לווסת אירועים הסלולר נוקלאוטיד התלוי מחזוריים מרובים כולל נדידת תאים. בעבר, הראינו כי בהעדר MRP4, תאי פיברובלסטים מכילים רמות גבוהות יותר של נוקלאוטידים מחזורי תאי והוא יכול להעביר מהר יותר. כדי להבין את המנגנונים של ממצא זה, אימצנו גישה ישירה עדיין רב פנים. ראשית, אנחנו מבודדים מתחמי חלבון אינטראקציה הפוטנציאל של MRP4 ממערכת התא MRP4 יתר ביטוי באמצעות immunoprecipitation ואחריו-ספקטרומטריית מסה. לאחר זיהוי חלבונים ייחודיים interactome MRP4, השתמשנו שנינות ניתוח נתיב (IPA) כדי לחקור את התפקיד של אינטראקציות בין חלבונים אלה בהקשר של העברת אותות. אנו הבהרנו את פותפקיד tential של מתחם חלבון MRP4 נדידת תאים ו- F יקטין מזוהה כמתווך עיקרי של השפעת MRP4 על נדידת תאים. מחקר זה גם הדגיש את תפקידה של cAMP ו- cGMP כמו שחקני מפתח תופעות הנדידה. באמצעות מיקרוסקופ גבוהה תוכן, בצענו מבחנים-נדידת תאים ו ציינו כי השפעת MRP4 על הגירת פיברובלסטים הוא בוטל לחלוטין על ידי שיבוש cytoskeleton יקטין או העיכוב של קינאז תלוי cAMP (PKA). כדי להמחיש איתות מודולציות בתא נודד בזמן אמת, השתמשנו חיישן מבוסס סריג למדידת פעילות PKA ומצאנו, בנוכחות פעילות PKA מקוטבת יותר ליד הקצה המוביל של נודדות Mrp4 ^{- / -} פיברובלסטים, לעומת Mrp4 ^{+ / +} פיברובלסטים. זה בתורו עלה היווצרות תקטין קליפת מוח augmented בתהליך של הגירה. הגישה שלנו מאפשרת זיהוי של החלבונים הפועלים במורד MRP4 ומספקת לנו עם מעללאור מנגנון המעורבים בויסות MRP4 תלוי הגירה פיברובלסטים.

Introduction

נדידת תאים היא תהליך רב שלבים מסובך. מחקרים הראו כי במהלך תאי הגירה מקוטבים לתוך מובילים ונגררים קצוות. על ידי שמירה על תאי מטריקס, את הקצה המוביל מספק את המתיחה הדרוש לגוף התא להתקדם. לבסוף, משחרר הנגרר לקצה המצורף האחורית ומשלים את ^1,2 מחזור ההגירה.

קיטוב נייד עבור נדידת תאים יעילה מוסדר על ידי פרדה מרחבית של איתות תאית. שליחים משניים סלולריים, כמו קייטנה, לתווך המידור של אירועי האיתות הנדרשים ^3,4 נדידת תאים כיוונית מכוילות. הצטברויות מועדפות של מחנה קינאז התלוי cAMP פעילות PKA בחוד החנית ממלאות תפקידים מרכזיים נדידת תאים כיוונית ^5,6. על ידי phosphorylating GTPases הקטן כגון מצע רעלן בוטולינום C3 ראס קשור (RAC) ובקרת חלוקת תא חלבון 42 homolog או Cdc42, PKמפעיל חלבון יקטין הקשורים 2/3 (ארפ 2/3) בחוד החנית ואת הגורם להיווצרות lamellipodia ^7-9. PKA גם phosphorylates סוכן אנטי מכסה, vasodilator מגורה phosphoprotein (VASP), ובכך מסדיר את מחזורי תנודתית של רחבת הממברנה הכחשה ^10,11.

בתאים, רמות cAMP מוסדרות שלושה תהליכים עיקריים: א) סינתזה ידי cyclase adenylate, ii) שפלה ידי phosphodiesterases, ו- III) תחבורת ידי מובילים בזרימת קרום נכנס ^3. חלבון 4 התנגדות multidrug (MRP4), חבר קסטת מחייב ATP (ABC) המשפחה של מובילי קרום, מתפקד טרנספורטר בזרימת אנדוגני של נוקלאוטידים מחזורי. לכן, MRP4 יכול לווסת את רמות cAMP תאיות cAMP תלוי הסלולר איתות ^11-13. בעבר הראינו כי Mrp4 ^{- / -,} פיברובלסטים מכילים רמות גבוהות יחסית של נוקלאוטידים מחזורית ולהעביר ג מהרompared כדי Mrp4 ^{+ / +} פיברובלסטים ^14. גם דיווחנו השפעה בי-פאזית נוקלאוטידים מחזורי על הגירה פיברובלסטים. בהתבסס על מחקרים קודמים קביעתנו כי Mrp4 ^{- / -} פיברובלסטים מכילים cAMP מקוטב יותר במהלך הנדידה, שיערנו כי תקנה MRP4 בתיווך זה של הגירה פיברובלסטים הוא cAMP תלויים. על מנת להבין את המנגנון במורד הזרם, לקחנו גישה ישירה עדיין רב פנים.

כדי לזהות את החלבונים הקשורים ב הגומלין עם MRP4, אנו immunoprecipitated מתחמי macromolecular המכילים MRP4 מתאי HEK293 כי מעל להביע MRP4. באמצעות ספקטרומטר מסה, זיהינו חלבונים MRP4 אינטראקציה מרובים וניתח הקישוריות שלהם באמצעות ניתוח נתיב שנינות (IPA). IPA הוא כלי שימושי כדי לנתח אינטראקציות בין חלבונים (הן מבניות ותפקודיות) ולחקור תרומתם הפיזיולוגית ופתולוגיים בפרטאירועים על סמך הספרות וראיות ניסיוני ^15,16. IPA ציין כי F- יקטין היא מטרה במורד זרם עיקרית של MRP4 בהקשר של נדידת תאים שבו cAMP ו- cGMP הוא המפתח מולקולות איתות ^17. נתונים אלה אושרו עוד יותר על ידי מיקרוסקופ גבוה תוכן. מיקרוסקופיה גבוהה תוכן יכול ללכוד ולנתח התנהגויות התא כגון נדידת תאים באופן יותר נוח, מדויק תפוקה גבוהה ^18. נתוני מיקרוסקופיה גבוהי תוכן הראו כי השפעת MRP4 על הגירת פיברובלסטים הוא בוטל לחלוטין על שיבוש cytoskeleton יקטין או העיכוב של PKA ^17.

בנוסף, השתמשנו תהודה העברת אנרגיה פורסטר (סריג) מבוסס חיישן PKA לפקח על הדינמיקה PKA ב תאים נודדים בזמן אמת. חיישנים קינאז מבוסס סריג בדרך כלל מורכבים של פפטידים מצע זירחון הספציפיים המוקפים CFP ו fluorophores YFP ^19-21. pmAKAR3 הוא משופר ואותיmbrane ממוקד חיישן PKA מבוסס סריג המכיל הקשורים-forkhead מושלם 1 (FHA1) ואת רצף מצע PKA ^5,22 LRRATLVD. זירחון של pmAKAR3 ידי עליות למקטע קטליטי PKA סריג אות בין CFP ו YFP ^19. קלטי תחום שינוי שומנים לתוך החיישן שממקדים אליו קרום הפלזמה לניטור דינמיקת PKA, במיוחד על תא קרום ^23.

שימוש pmAKAR3, הראינו כי את הקצה המוביל של נודדות Mrp4 ^{- / -} פיברובלסטים הציג פעילות PKA מקוטבת יותר Mrp4 ^{+ / +} פיברובלסטים, אשר בתורו הגדיל את ההיווצרות יקטין קליפת המוח בחוד החנית של התא ^17. יחד, אירועים אלה גרמו קיטוב הסלולר טוב נדידת תאים כיוונית מהר בהעדר MRP4. הגישה הספציפית וישירה שלנו זיהתה מטרות במורד מפתח עבור MRP4 ומספקת חשוב, אבל כמומנגנון עדיין לא נחקר לרגולצית MRP4 תלוי הגירה פיברובלסטים.

Protocol

1. ניתוח נתיב שנינות

1. מערך נתוני החלבון-interactome העלאה
   1. הכנס את החלבונים / גני העניין בגיליון אלקטרוני עם מזהי הגן הייחודיים שלהם (רצוי סימני הגן ומספרים מזהים גנים כפי שנתקבל עם נתונים ספקטרומטריה).
   2. הקצאת עמודה אחת בגיליון האלקטרוני עבור מספר מזהה ג'ין ועמודה אחת ערך תצפיתי (למשל., מקפלים-שינוי או p-value). בחר באפשרות 'מכילה כותרת עמודה' כדי להציג את כותרות העמודות.
   3. העלה את הנתונים על IPA ידי לחיצה על הלשונית במערך להעלות בחירת הגיליון האלקטרונית שהוזכר לעיל. בחר את כרטיסיית התבנית הגמישה, ובחר את הקטגוריה המתאימה של מזהת גן.
      הערה: תבנית גמישה של בסיס הנתונים מתגברת מפרטי הפורמט להעלאה.
   4. לאחר הנתונים מופיעים, בחר עמודות מזהות והתבוננות. ודא שכל של חלבונים (interactome MRP4 כפי שהוגדרו על ידי-sp המוניתectrometry) ממופה על ידי סימון על כרטיסיית סיכום נתונים. בסיס הנתונים מוכן כעת לניתוח הרצוי.
2. ניתוח נתונים
   הערה: יתוארו השימושים החלקיים של תכונות IPA כי נוצלו לצורכי מחקר זה.
   1. לאחר העלאת interactome MRP4 עם שמות הגן שלהם בתור מזהים ייחודיים, לחץ על חדש ובחר ניתוח הליבה בתפריט השמאלי העליון של התוכנה IPA.
   2. הגדר את ערך הביטוי הפסקות עבור עוצמת בהתאם לסוג הניסוי (ערך אינטנסיביות של 100 מומלץ לניתוח).
   3. חשבתי את מתקפל השינוי בהבעה בעת הכנת בסיס הנתונים אם תנאים מלאי ניסיוני מעורבים ולכלול בו כחלק קובץ הנתונים אם ניתוח השוואה לבצעו (ערך חתוך של 1.5 שינוי לקפל בדרך כלל מומלץ לניתוח ).
      הערה: לאחר השלמת ניתוח הליבה, חלקים רבים של ניתוחים ניתן להשיג. בלשונית הראשונה מציגה את הסיכום של הדואר ניתוחים הכולל ומציע מסלולי הקנונית עליונים, רגולטורים במעלה זרם, פונקציות מולקולריות תאיות, ורשתות בין יתר; כל מחושב בהתבסס על רמת הביטחון (ערך p) מסודרים בסדר עולה של ערך p.
   4. פתח את המסלולים הקנונית הגדולים (באמצעות אפשרות המסלול הפתוחה) רשתות מולקולריות גדולות כמו זה באופן ציורי להראות לדבר צלב, חופפים, והשפיע מסלולי איתות.
      תסתכל על הרשימה של המסלולים קנוני כי הם מעורבים מבוססים majorly על p-value (p <0.05 נחשב משמעותי).
      הערה: הערכים משמעות עבור מסלולים הקנונית מחושבים על ידי בדיקה מדוקדקת של פישר עם זנב ימני. המשמעות מציינת את הסתברות התאגדות של מולקולות מן הנתונים עם המסלול הקנונית על ידי מקריות בלבד.
   5. אשר את חלבוני הקלט (interactome MRP4 כפי שהוגדר על ידי-ספקטרומטריית מסה) מרשימת החלבונים המעורבים בכל מסלול.
      הערה: שימוש OPTIO זהn, זה היה נראה כי רשת איתות cytoskeleton הסלולר תקטין היא מסלול המושפעים העיקרי ואיך חלבוני הקלט מוצאים שם את מקומה (איור 1). גישה זו מסייעת לזהות אילו רשתות מולקולריות תהיינה קשורות באופן הדוק מושפעות חלבוני הבדיקה.
   6. השתמש בכרטיסיית הרשת בניתוחים לזהות מחלות ופונקציות העליונות שמקושרות פוטנציאלי לרשת חלבון מסוימת בהתבסס על המספר של מולקולות מוקד.
      הערה: ערך ציון ניתן על בסיס החלבונים הידועים כי נקבעים כחלק למשל רשת, הרכבת הסלולר ורשת ארגון, באמצעות ידע בספרות וראיות ניסיון ולהתמקד מולקולות שמזוהות מן הנתונים ולהיות חלק ממערך ניהול נכסים. . מעתה, הרשת מקבלת מסונן מלכתחילה מבוסס על מספר מולקולות מוקד.

מיקרוסקופי גבוה תוכן 2.

1. הכנת תאים
   הערה: כל עבודת תרבית תאים נעשית מתחת למכסת מנוע תרבית תאים האופקית-זרימה.
   1. השתמש 96 גם microplates עבור assay ריפוי הפצע.
   2. מעיל microplate עם פתרון פיברונקטין 1% (מחדש ב- PBS), ולשמור את הצלחת CO ₂ באינקובטור סטנדרטי ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
   3. Remove Mrp4 ^{- / -} ו Mrp4 ^{+ / +} עכבר פיברובלסטים עובריים (MEFs) גדל ב צלוחיות תרבות 25 סמ"ר התא מן האינקובטור, לשטוף פעם 1 עם PBS, trypsinize התאים למשך 5 דקות באמצעות 1 מ"ל של תמיסת 4x טריפסין-EDTA.
   4. שוטפים את התאים עם בינוני שלם (DMEM המכיל 10% FBS ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין) resuspend אותם 5 מ"ל של מדיום מלאה.
   5. לשאוב את הפתרון פיברונקטין מבארות. ספירת תאים באמצעות hemocytometer וזרעי 30,000 תאים (מספר הסלולרי צריך להיות מותאם המבוסס על סוג תא) לתוך כל טוב.
   6. לגדל את התאים מפגש 100% בסטנדרטCO ₂ באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
2. פצע יצירה
   1. ודא כי כל הבארות מלאות פתרון. מלאו בארות בשימוש עם PBS כדי למנוע נזק לכלי ביצוע הפצע (למשל., WoundMaker).
   2. לאחר אישור מפגש תא 100%, למקם את צלחת 96-היטב בתוך הכלי והופך פצע על צלחת בסיס המתכת ולחץ על הגוש הפיני 96-גם למטה.
   3. שוטף את התאים שלוש פעמים עם PBS להסיר את כל תאים וחלצו ולהוסיף 100 μl של בינוני מלא.
   4. מוסיפים את תרכובות הבדיקה - H-89 (50 מיקרומטר; 1: 1,000 דילול עם התקשורת להשלים באמצעות 50 המניות מ"מ DMSO) או Latrunculin B (1 מיקרומטר; 1: 1,000 דילול עם התקשורת להשלים באמצעות מניות 1 מ"מ DMSO) בשלב זה .
   5. מניחים את הצלחת assay בתוך הקורא על 37 מעלות צלזיוס ולפקח הגירה לאורך תקופת הניסוי.
3. נדידת תאי ניטור
   הערה: נדידת תאים היה פיקוח באמצעות יחסי ציבור מיקרוסקופ ותוכנהovided עם מערכת מיקרוסקופיה גבוהה תוכן. השימוש 96 גם microplates מבטיח כי הפצעים מנוטרים באופן אוטומטי על ידי מיקרוסקופ ונרשמו ע"י התוכנה.
   1. הגדר את התוכנה כדי לסרוק את צלחת assay כל שעה עבור מבחני הגירה באמצעות כרטיסיית סריקת לוח זמנים. בחר שעה התחלה לפחות 15 דקות לאחר הצבת צלחת assay בתוך הקורא לאפשר איזון לפני ההדמיה.
   2. בחר את המגש ולבחור סוג אונייה (microplate 96-היטב) וסוג ניסוי (פצע Scratch).
   3. בחר מטרת 10X ולבחור פרמטרי הדמית שלב ניגודיות. בחר את הבארות שצריכות לסריקה באמצעות אפשרות דפוס סריקת עריכה.
   4. ציין את קבוצות טיפולים וכל משכפל ידי בחירת כרטיסיית המאפיינים והקמת מפת צלחת. סריקה ניתן לעצור בכל עת על בסיס תנאי הניסוי.
4. ניתוח נתונים
   1. לאחר הסריקה נעשית, בחר את כרטיסיית תצוגת כלי עבור צלחת assay. Go אל שירות עבודת ניתוח עבודת ניתוח חדש השקה בחרי.
   2. גדר פצע שריטה כסוג עבודה ובחר את טווח הזמן עבור (נקודת זמן 0 כדי 24 שעות נקודת זמן) ניתוח.
   3. בחרו את הבארות להיבחר לניתוח על ידי לחיצה בודדת על הבאר ולוחצות על 'אישור' כדי ליזום את הניתוח. לאחר הניתוח מתבצע, גרפי לדמיין צפיפות פצע יחסית (RWD) נתונים עבור כל טוב בכל נקודת זמן באמצעות יצוא לאפשרות הגרף.
   4. הצג את סט תמונת שלב ניגודיות של כל טוב מתאים-בנקודות זמן שונות באמצעות לשונית תמונת נוף. בחר באר המבוקש על ידי לחיצה על מפת הצלחת, לבחור נקודת זמן מסוימת מכרטיסיית טווח הזמן ולחץ על כרטיסיית תמונת נוף.

3. העברת אנרגיה פורסטר תהודה (סריג)

1. הכנת תאים
   1. מעיל 35 מ"מ צלחות עם רצפת זכוכית עם 100 μl של 1% פתרון פיברונקטין (כמפורט בסעיף 2.1) ולשמור אותםCO ₂ באינקובטור סטנדרטי ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
   2. לשאוב את הפתרון פיברונקטין מהצלחות ומספרי זרע שווים של HEK293 תאים (10,000 תאים / צלחת) בינוני מלא.
   3. לגדל את התאים מפגש 60-70% ב המנות מצופה פיברונקטין תחתית זכוכית CO ₂ באינקובטור סטנדרטי ב 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
2. transfection
   1. בצע את כל transfections חולף באמצעות מגיב transfection מסחרי לפי הוראות היצרן.
   2. Aliquot 250 μl של מדיום מלא לשתי מבחנות צנטריפוגה סטרילי נפרדות 1.5 מיליליטר לכל צלחת 35 מ"מ.
   3. הוסף 2 מיקרוגרם של ה- DNA (pmAKAR3 או pmAKAR3-ת"א) בצינור אחד ו -5 μl (2.5 לקפל את ריכוז ה- DNA) של מגיב transfection בצינור אחר.
   4. דגירה צינורות במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להעביר את ה- DNA מדולל לתוך הצינור מגיב המכילים transfection.
   5. מערבבים היטב לדגור על 37° C למשך 30 דקות אחרות.
   6. לשאוב את המדיום off התאים ולשטוף אותם פעם עם PBS. הוסף 1 מ"ל של מדיום אנטיביוטיקה ללא DMEM F-12 המכיל 10% FBS אל התאים.
   7. להוסיף 507 μl של המצומד DNA-שומנים עם תקשורת התאים כל צלחת, ומערבבים בעדינות, ולשמור בחממה ₂ CO ב 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. השתמש 2 מיקרוגרם של ה- DNA (1 מיקרוגרם / מניות μl) ו -5 שומני μl עבור 10,000-50,000 תאים כל צלחת.
3. Live- תא הדמיה
   1. לאחר 48 שעות של transfection, להסיר בינוני צמיחה לשטוף את התאים 2 פעמים עם תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS, מחומם מראש ב 37 מעלות צלזיוס). הוספת נפח סופי של 1.9 מ"ל HBSS לתאי רחץ לעגן אותן על מערכת מיקרוסקופ הפוכה רחב בתחום הדמיה סריג בתוך מחוייט 37 ° C שמרה קאמרית.
      הערה: במערכת זו, האור עירור מסופק על ידי מנורה 300 W קסנון נחלש עם מסנן צפיפות ניטרלי עם 50% אור transmissיוֹן.
   2. השתמש אובייקטיבי 60X. ידני להתמקד התאים ולהגדיר שדה אופטימלי מבט באמצעות מיקרוסקופ. הפעל את השדה שנבחר מבט על מסך המחשב באמצעות פוקוס האפשרות "F" על התוכנה. לביצוע מדידות סריג, בחר את ערכת המסנן הנאה (מסנן CFP / YFP להגדיר עם מסנן עירור 430/25 ננומטר, קרן splitter dichroic כפול, ושני מסנני פליטה (470/30 ננומטר עבור CFP ו 535/30 ננומטר עבור סריג) באופן ידני.
   3. דמיין קרינה על ידי הבדיקה ראשונה על אפשרות ערוץ CFP / YFP / הסריג ואחריו לחיצת כרטיסיית פלואוריד פתוחה. לשפר את עוצמת האות על ידי שימוש באפשרות התעצמות בלשונית המצלמה.
   4. בחר את התאים המבטאים pmAKAR3 או pmAKAR3-ת"א הימנעות הרוויה של עוצמת האות. השתמש בחלון ללכוד ליזום מדידת סריג.
   5. בחר באפשרות הזמן לשגות והתקנת סריקה בזמן למשך 30 דקות עם 30 מרווח שניות. סמן את אפשרות הסריג ולהגדיר את זמן החשיפה ב 100 msec. הזן את תווית תמונההעיתונות ד להתחיל ליזום את המדידה.
   6. לאחר חמש נקודות זמן הקמת הבסיס, להוסיף 25 מיקרומטר של forskolin (5 μl של 10 מיקרומטר המניות באתנול, מדולל עם 100 μl של HBSS) על התאים מבלי להפריע את הצלחת לפקח על תאים עבור סכום כולל של 30 דקות.
4. ניתוח נתונים
   הערה: מודול חישוב ratiometric השתמש לניתוח נתונים.
   1. הקש על הכלי לבחירה בצד השמאלי של חלון התמונה ולבחור מלבן מוצק מן התפריט הנפתח. גרור את המלבן על שדה התמונה חופשי בשטח תא קליק ימני על זה כדי להגדיר אותו כרקע לצורך רקע החיסור.
   2. עבור אל המסכה ולהשתמש 'ליצור מסכה חדשה' אפשרות. עבור אל הכלי לבחירה ולבחור עט מן התפריט הנפתח לצייר מסכה ידנית סביב התא כדי לבחור אותו עבור מדידה. בחר לפחות 4-6 תאים לכל מצב.
   3. בחר בכרטיסיית המסכת ולבצע סטטיסטיקת מסכה.
   4. בדוק 'מסכה שלמה', פועל להרחבת אפשרות צולבת ואת סריג מנורמל תורם בחר (N-סריג) (סריג / CFP). ערך N-הסריג הוא נציג של פעילות PKA על קרום התא.
   5. תוספת חותם זמן, נראה- up בר שולחן בקנה מידה באמצעות ההסברים.

Results

כדי לחקור את ההשפעה של MRP4 על הגירה פיברובלסטים, השתמשנו assay ריפוי פצעי ניצול מיקרוסקופיה גבוה תוכן ^14. פצעים מדויקים נעשו על משטחים ומחוברים של MEFs המבודד משני Mrp4 ^{- / -} או Mrp4 ^{+ / +} עכברים, ותמונות צולמו 1 במרווחי hr למשך 24 שעות. צפינו שיעור הגירה גבוה עבור Mrp4 ^{- / -} MEFs לעומת Mrp4 ^{+ / +} MEFs (איור 2).

Discussion

נדידת תאים היא תהליך מורכב הממלא תפקידים חיוניים באירועים פיזיולוגיים חשובים רבים כולל ריפוי פצעים^1,2. נדידת תאים חריגה עלולה לגרום לאירועים קטסטרופליים, כגון גרורות גידול ואנגיוגנזה^24,25. לכן, נדרשת ויסות מכוון של נדידת התאים כדי לשמור על תפקוד תקין של הגוף.

באמצעות מיקרוסקופיה בעלת תוכן גבוה¹⁸, הראינו כי MEFs חסרי MRP4 נודדים מהר יותר בהשוואה לפיברובלסטים מסוג^{פרא 14}. בניגוד לבדיקת פצע השריטה הקונבנציונלית, המיקרוסקופיה כאן מבצעת את בדיקת ריפוי הפצע...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ליפופקטמין 2000	Invitrogen (קרלסבד, קליפורניה)	11668-027
DMEM	Invitrogen (קרלסבד, קליפורניה)	11965-092
IncuCyte Zoom	Essen BioScience
96-well IncuCyte Image-Lock מיקרו-צלחות	Essen BioScience	4493
Latrunculin B	Sigma-Aldrich (סנט לואיס, מיזורי).	מלאי L5288	ב-DMSO
H-89	Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY)	מלאי BML-EI196	ב-DMSO
35 מ"מ כלים עם תחתית זכוכית	(תאגיד MatTek; אשלנד, מסצ'וסטס)	P35G-1.5-20-C
פיברונקטין	סיגמא-אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי).	F1141
Opti-MEM מדיית סרום מופחתת	Invitrogen (קרלסבד, קליפורניה)	31985-088
מערכת מיקרוסקופיה FRET	מיקרוסקופ הפוך אולימפוס (IX51)
מצלמת CCD	Hamamatsu, יפן	ORCA285
תוכנת SlideBook 5.5	חדשנות הדמיה חכמה (דנבר, קולורדו)
תוכנה לניתוח נתיב ההמצאה	IPA, QIAGEN רדווד סיטי,
פורסקולין	טוקריס (אליסוויל, מיזורי).	מלאי 1099	ב-100% EtOH
DMEM F-12	Invitrogen (קרלסבד, קליפורניה)	11330-057
HBSS	Invitrogen (קרלסבד, קליפורניה)	14025-134
Excel	Microsoft
PBS	Invitrogen (קרלסבד, קליפורניה)	10010-023
תמיסת טריפסין/EDTA (TE)	Invitrogen (קרלסבד, קליפורניה)	R-001-100
פניצילין-סטרפטומיצין	Invitrogen(קרלסבד, קליפורניה)	15140-122