הערכה סימולטני של DNA Cardiomyocyte סינתזה ploidy: שיטה Assist כימות Cardiomyocyte רגנרציה מחזור

סיכום

כימות תחלופת הקרדיומיוציטים הוא מאתגר. הפרוטוקול המתואר כאן תורם תרומה חשובה לאתגר זה בכך שהוא מאפשר כימות מדויק ורגיש של יצירת גרעיני ניאו-קרדיומיוציטים וגרעיני פלואידיה.

תקציר

למרות זאת הוא קיבל את זה בלב יש פוטנציאל מוגבל להתחדש cardiomyocytes בעקבות פציעה וכי רמות נמוכות של מחזור cardiomyocyte להתרחש במהלך הזדקנות נורמלית, כימות של אירועים אלה נותר מאתגר. מדובר בין השאר בשל הנדירות של תהליך והעובדה מקורות תאיים רבים לתרום תחזוקה שריר הלב. יתר על כן, שכפול ה- DNA בתוך cardiomyocytes לעתים קרובות מוביל cardiomyocyte polyploid ורק לעיתים רחוקות מוביל cardiomyocytes חדש על ידי חטיבת הסלולר. כדי לכמת במדויק אפליה מחזור cardiomyocyte בין תהליכים אלה היא חיונית. הפרוטוקול המתואר כאן מעסיקה תיוג nucleoside לטווח ארוך כדי לתייג כל הגרעינים שהתעוררו כתוצאה גרעינים שכפול דנ"א cardiomyocyte מזוהה על ידי ניצול בידוד הגרעינים ואת immunolabeling PCM1 שלאחר מכן. יחד זה מאפשר זיהוי מדויק ורגיש של תיוג nucleoside של גardiomyocyte אוכלוסיית גרעינים. יתר על כן, 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole תיוג וניתוח ploidy גרעינים, מאפשרת אפליה של גרעינים הניאו-cardiomyocyte מגרעינים אשר שילבו nucleoside במהלך polyploidization. אמנם שיטה זו לא יכולה לשלוט על cardiomyocyte binucleation, היא מאפשרת כימות מהיר ויציב של גרעינים הניאו-cardiomyocyte תוך התחשבות polyploidization. לשיטה זו מספר היישומים במורד זרם כוללים בחינה של הרפוי הפוטנציאלי כדי לשפר התחדשות cardiomyocyte או שבדק את ההשפעה של מחלת לב על מחזור cardiomyocyte ו ploidy. טכניקה זו היא גם תואמת עם טכניקות immunohistological במורד נוספות, המאפשרות כימותי התאגדות nucleoside בכל סוגי תאי הלב.

מבוא

בשנים האחרונות חלה ולראיות תיגר על ההנחה כי הלב הוא איבר ^1,2 הבדיל סופני, שלאחר mitotic. עם זאת, כימות של מחזור cardiomyocyte והתחדשות נותרת מאתגרת.

הקשיים בזיהוי דור cardiomyocyte נדיר במדויק תוך שימוש בטכניקות immunohistochemical סטנדרטיים גם מדווחים ^3. בנוסף, מקור הסלולר של דור cardiomyocyte נשאר לא ברור עם ראיות לתרומות על ידי התפשטות cardiomyocyte וכן התמיינות תאי גזע ^4-6. לכן, שימוש במודלים התחקות השושלת אשר דורשים ידע של פנוטיפ cardiomyocyte אבי הוא בלתי אפשרי וכימות של התפשטות מאוכלוסיה אחת, כולל שריר הלב, אינו ראוי. יתר על כן cardiomyocyte יש פוטנציאל endoreplication ללא karyokinesis (וכתוצאה מכך המכונית polyploiddiomyocyte) או karyokinesis בהעדר cytokinesis (וכתוצאה מכך cardiomyocyte binucleated) ^7,8. כימות מדויק של מחזור cardiomyocyte תלויה ביכולת להבחין בינם ובין הדור הניאו-cardiomyocyte נכון. זה יוצר סיבוכים ייחודיים משום שכפול הדנ"א וביטוי של קינאזות תלויות ציקלין ב cardiomyocytes לא בלעדי להפגין חלוקת תא נכון ^9,10.

כדי לסייע כימות של הדור הניאו-cardiomyocyte, יש לנו בשילוב טכניקה בידוד גרעינים הוקמה, וסימון אימונולוגיים של pericentriolar חומר 1 (PCM1) לזיהוי גרעינים cardiomyocyte כפי שתואר על ידי ברגמן et al. ^7,11 עם שיטות חדשניות של טווח ארוך תיוג DNA וניתוח ploidy. PCM-1 הוא חלבון centrosome שמצטבר על פני שטח הגרעין של מיוציטים בדיל, הלא אופניים. מחקרים קודמים הראו כי נוגדנים נגדPCM-1 תווית במיוחד גרעינים cardiomyocyte ^7,11 וכפי PCM1 נוצל בעבר על ידי מספר קבוצות עצמאיות לזהות ^1,12,13 cardiomyocytes כזה. בנוסף, אנו הראינו כי ביטוי PCM1 מפות כדי גרעיני cardiomyocyte שכותרתו גנטית במודל העכבר המהונדס-cre TnT ¹⁴ (איור 1 משלים).

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר זיהוי המדויק ורגיש של דור גרעיני cardiomyocyte ניאו בלב העכבר, ללא קשר המקור התאי (איור 1 א 'וב') תוך הדרת תיוג nucleoside זמנית בשל polyploidization מהניתוח (איור 1 ג ו-ד). אמנם שיטה זו לא יכולה לשלוט על cardiomyocyte binucleation, היא מאפשרת כימות מהיר ויציב של גרעינים הניאו-cardiomyocyte אשר נדרש עבור כימות מדויק של מחזור cardiomyocyte. יתר על כן,הוא מספק כלי מיון מהירים להעריך שינויים פוטנציאליים הדינמיקה של דור cardiomyocyte.

בעוד תיוג DNA בדרך כלל 5-Bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) כמו אנלוגי thymidine, פרוטוקול המתואר כאן משתמשת assay מבוסס 5 ethynyl-2'-deoxyuridine (EDU) כפי שהוא דורש מדרגות עיבוד פחות עבור יותר מהיר דרך-לשים ואינו דורש denaturing של DNA כדי לאפשר גילוי חיסוני, מה שהופך אותו תואם פרוטוקולי immunostaining אחרים ובכך הגדיל את היישומים במורד הפוטנציאל של השיטה.

איור 1: פועם רציף עם edu תוויות הניאו-cardiomyocytes ללא קשר אבות שלהם. (א) edu הוא שולב DNA של cardiomyocytes בעת חלוקת התא. הפצת נשק באוכלוסייה cardiomyocyte יהיה Result לעלייה, או החלפה של cardiomyocytes ולכן הוא סינתזה של DNA פרודוקטיבי (תורם תחזוקה ותיקון רקמות). (ב) edu הוא שולב DNA של ובתאים לב בעת חלוקת התא. זה יישמר בתא במהלך בידול אל שושלת cardiomyocyte. התמיינות תאי גזע זה תביא גם לעלייה במספר cardiomyocytes ולכן תורמת תחזוקה ותיקון רקמות. (C) cardiomyocytes יש פוטנציאל לעבור "לא פרודוקטיביים" שכפול הדנ"א וכתוצאה מכך ploidy cardiomyocyte גדל, אשר מזוהה עם היפרטרופיה cardiomyocyte שיפוץ שריר הלב, אך אינו מחליף cardiomyocytes האבוד. תהליך polyploidization נבדל binucleation כמו התוצאה היא cardiomyocyte עם גרעינים יחידים אשר מכיל ארבעה או יותר סטים של שני כרומוזומים הומולוגיים (> 2N). (ד) בעקבות p גרעינים רציףulse, פרוטוקול זה מתאר בידוד גרעינים וזיהוי של גרעינים cardiomyocyte ידי ביטוי PCM1 לאפשר כימות של שני ploidy cardiomyocyte ושילוב edu. ביטוי PCM1 ושילוב edu זוהה באמצעות cytometry הזרימה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

פרוטוקול

עבודה Animal הוסמכה ואושרה על ידי ועדת הבדיקה אוניברסיטת אתיקה ניוקאסל. כל הנהלים בבעלי החיים בוצעו העומדים לפי ההדרכה של הדירקטיבה 2010/63 / איחוד האירופי הפרלמנט האירופי על ההגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות.

1. מינהל edu

1. ממיסים edu תמיסת מלח סטרילית (0.9% w / v) בריכוז סופי של 12.5 מ"ג / מ"ל.
   1. מחממים את הפתרון 40 ° C ו מערבולת כדי להתמוסס לחלוטין. אחסן מספיק edu / מלוחים ב 4 ° C להזריק כל העכברים במחקר המאפשר 6 זריקות יומיות.
      הערה: בדרך כלל מעל 6 עכברים נדרשים עבור כל קבוצת ניסוי. עם זאת, חישובי כוח יש לבצע מחקרים עצמאיים.
2. לשקול עכברים בודדים. חשב את נפח נדרש לנהל 100 מיקרוגרם / גרם של פתרון edu / מלוחים כל עכבר (8 μl של פתרון המניות edu לכל גרם).
3. צייר את volum המתאיםדואר של edu / מלוחים לתוך מזרק אינסולין עם מחט 25 G.
4. בצע הזרקה (IP) זריקות תוך טיפול בעכברים באמצעות טכניקות משרד הפנים אישר.
   1. מניח עכבר על מכסה הכלוב. משוך בעדינות בחזרה על בסיס הזנב בתקיפות לתפוס את העכבר על ידי בעורפו.
   2. לחשוף את הבטן להזרקה על ידי החזקת העכבר עם האצבע המורה והאגודל סמוך לבסיס של הראש להטות את הראש של החיה לאחור לכיוון הרצפה.
   3. נגב את הבטן עם פתרון אלכוהול 70%. אתר את קו האמצע של בעלי החיים ברבע ימני תחתון. להזריק את פתרון edu / המלוח לתוך החיה לתוך ברבע הימני התחתון.
   4. להזריק עכברים עם פתרון edu / מלוח ולהקליט את הזמן של היום.
5. חזור על שלבי 1.2 כדי 1.4 הזמני של יום, במשך 6 ימים רצופים.
   הערה: כפקד שלילי edu נדרש להגדיר את gating עבור ניתוח התזרים cytometric, להזריק בעידן נוסף, מגדר בניסוי ההתאמהעכבר ed עם נפח שווה של תמיסת מלח ללא edu. זה יספק את השליטה הנדרשת (אין שליטה edu). שליטה זו יש לכלול עבור כל מחקר כדי לאפשר וריאציות בקבוצות של ריאגנטים cytometer להגדיר.

2. לבבות קציר

1. בגיל 24 שעות לאחר הזרקת 6 ^th edu, להקריב בעכברים באמצעות פריקת צוואר רחם (או לוח זמנים חלופי 1 ביתי אשר שיטה).
2. מניחים חיה להקריב בתנוחה אופקית ולעשות חתך בעור מהבטן באמצע כדי הסרעפת עם מספריים כירורגיות.
3. חותכים את הסרעפת, והחזקה של עצם החזה משם מחלל הגוף, לחתוך בילטרלי כדי לחשוף את הלב.
4. הרם את הלב מעט וחותכים את כלי הדם הגדולים של דרכי יצוא לנתח את הלב מתוך חלל בית החזה.
5. מיד למקם כל הלב כדי צינור צנטריפוגות בודדות 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל PBS מקורר עד 4 ° C.
6. העבר לבבות ספarate 10 ס"מ צלחות פטרי, באמצעות אזמל לחתוך כל הלב בשני בכיוון sagittal ולשטוף את הלב על ידי כיווץ בעדינות עם זוג מלקחיים. ואז להחליף את PBS להסיר דם רב ככל האפשר. חזור על פעולה זו פעמיים.
7. מניח את שני החלקים של כל לב לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר אותו אדם.
8. המשך לשלב 3 או לחילופין דגימות חנות -80 ° C כמפורט צעדים 2.9 ו 2.10.
9. באמצעות מחט 25 G, לעשות חור קטן במכסה צינור microcentrifuge כדי למנוע את המכסה מעל הפתיחה בשל הרחבת גזי כשהלב מעובד.
10. לייבל כל צינור microcentrifuge ומניחים במיכל חנקן נוזלי להקפיא.

3. גרעיני דיסוציאציה ו Cardiomyocyte תיוג גרעינים

הערה: תיוג גרעיני דיסוציאציה cardiomyocyte גרעינים זה מותאם מזו של ברגמן ואחות ^'11 בצע נוהל זה על כל הדגימות מוזרקות.עם edu ו מלוחים מוזרק (אין שליטה edu) כביקורת שלילית. ראה טבלה מס '1 על המתכון של הפתרונות הנדרשים כדי לבצע שלבים אלה.

1. עבור כל הלב כדי להיות מנותח, להציב 36 מ"ל של 1% BSA / פתרון PBS לתוך צינור ultracentrifuge, דגירה במשך 30 דקות, להשליך את הפתרון ולאחר מכן ולאפשר לאוויר יבש.
   הערה: צינור זה משמש בשלב 3.6.
2. מניחים לבבות קפואים הפרט על צלחת 10 מ"מ על הקרח ופשטי- באמצעות אזמל המאפשר את ליבם להפשיר במהלך תהליך מתייפייף.
3. מניחים לבבות טחון לתוך 15 מ"ל של תא הצפת תמוגה בתוך שפופרת 50 צנטריפוגות מ"ל ו homogenize עם homogenizer החללית במשך 15 שניות ב -25,000 סל"ד בטמפרטורת החדר.
4. הוסף 15 מיליליטר נוסף של תא הצפת תמוגה אל הצינור צנטריפוגה ומעביר 40 מיליליטר dounce עם עלי אישור גדול. בצעו 10 משיכות עם העלי ולסנן דרך 100 מיקרומטר אז 40 מיקרומטר תא מסננת לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ"ל.
5. צנטריפוגה במשך 10 דק 't 700 XG ב 4 ° C ולהסיר את supernatant.
6. Resuspend גלולה הגרעיני 25 מיליליטר של תמיסת סוכרוז שיפוע שכבה בגרעיני התאים המכילים פתרון על גבי 10 מיליליטר של תמיסת סוכרוז שיפוע טריה בצינור ultracentrifuge הערוך 3.1.
7. צנטריפוגה ב 13,000 XG במשך שעה 1 ב 4 ° C באמצעות הרוטור צינור ונדנדה.
8. בעקבות צנטריפוגה, לבטל את supernatant ו resuspend גלולה גרעינים ב -1,300 μl של חיץ אחסון הגרעינים צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge ותווית PCM1.
9. הסר 300 μl של ההשעיה לצינור microcentrifuge חדש ולהוסיף 700 μl של חיץ אחסון גרעינים טריים. לייבל הצינור הזה כשליטה ISO.
10. להוסיף אנטי PCM1 בריכוז סופי של 8 מיקרוגרם / מ"ל ​​אל הצינור microcentrifuge שכותרתו PCM1 ולהוסיף נוגדנים לשלוט אלוטיפ הארנב IgG בריכוז של 8 מיקרוגרם / מ"ל ​​אל הצינור microcentrifuge שכותרתו שליטה ISO.
11. דגירת הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. בעקבות incubation, צנטריפוגות ב XG 700 במשך 10 דקות, לבטל את supernatant, להחליף עם 1 מ"ל של חיץ אחסון גרעינים טריים, גלולה ו צנטריפוגות שוב במשך 10 דקות ב g 700 x. בטל supernatant ולהחליף עם 1 מ"ל של חיץ אחסון גרעינים טריים.
12. הוסף 1 μl של F (ab ') 2 שבר IgG נגד ארנב עיזים (H + L) נוגדנים (FITC או צבע ירוק ניאון שווה ערך) כדי להשיג ריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / מ"ל.
    הערה: שימוש F (ab ') 2 נוגדן שבר מקטין את פוטנציאל התיוג הלא ספציפי של תאים חיסוניים כולל מקרופאגים ותאי B.
13. צינורות לעטוף בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור דגירה במשך שעה 1 ב 4 ° C..

4. איתור של edu התאגדות

1. מדולל 10x מרוכז תגובת edu חיץ 1:10 עם מים ללא יונים.
2. צנטריפוגה PCM-1 ו השעיות גרעינים שכותרתו שליטה ISO ב 700 XG במשך 10 דקות, לבטל את supernatant ו resuspend גלולה גרעינים ב 1 מ"ל של1% BSA / פתרון PBS. שטוף את כדור הגרעינים פעמים.
3. לאחר שטיפה של דבר, לבטל את supernatant ולהחליף עם 100 μl של מקבע edu.
4. גלישת צינורות בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
5. שטפו את דגימות פעמיים עם 1 מ"ל של 1% BSA / פתרון PBS, צנטריפוגות ב XG 700 ו דגירה עם פתרון permeabilization מבוססי saponin 1x בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
6. הכן קוקטייל תיוג edu 1x (טבלה 2). מינימום של 2 תגובות יידרשו לכלול את כל שליטה edu.
7. הוסף 500 μl של קוקטייל תיוג 1x edu ישירות מדגם המכיל גרעינים כבר 100 μl של פתרון permeabilization מבוססי saponin 1x דגירה בטמפרטורת החדר המוגן מן האור למשך 30 דקות.
8. צנטריפוגה ב XG 700 ו resuspend ב 1 מ"ל של 1% BSA / PBS וחזור על שלב זה עוד פעמיים.
9. צנטריפוגה ב 700 XG, להשליך supernatant ולהחליף עם 400 μl של פתרון מכתים DNA (ראה טבלה של חומרים).

שם של המגיב

1. תא הצפת תמוגה

0.32 M סוכרוז

10 mM Tris-HCl (pH = 8)

5 מ"מ CaCl 2

5 אצטט מגנזיום מ"מ

2.0 mM EDTA

0.5 מ"מ EGTA

1 מ"מ DTT

2.Sucrose Gradient פתרון

2.1 M סוכרוז

10 mM Tris-HCl (pH = 8)

5 אצטט מגנזיום מ"מ

1 מ"מ DTT

3. למאגר אחסון גרעינים (NSB)

0.44 M סוכרוז

10 mM Tris-HCl (pH = 7.2)

70 מ"מ KCl

10 מ"מ MgCl 2

1.5 מ"מ spermine

טבלת 1: מרכיבי חיץ גרעיני בידוד מתכון לכל החוצצים המופיעים בפסקה פרוטוקול 3 (דיסוציאציה גרעינים וסימון גרעיני cardiomyocyte)..

ניתוח 5. תזרים Cytometric

הערה: בצע זרימת cytometry על גרעינים מבודדים כפי שתואר לעיל ^7,11,15.

1. ראשית, ליצור עלילה המתאר פיזור קדימה (FSC) ואת הצד פיזור (SSC) כדי לאפשר אפליית גרעינים מן ההריסות (איור 2 א).
2. צור העלילה להפלות גרעינים יחיד מתוך אגרגטים (תרשים 2B) על ידי התוויית 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) (DAPI) אזור (3-405 / 450/50-א) לעומת גובה (33-405 / 450 / 50-H). ודא thaך * 3-405 / 450/50-אות נאסף על בקנה מידה ליניארי לאפשר קביעה נכונה של תוכן DNA.
3. ליצור עלילה המתארת ​​488/535/30 א '(PCM-1) לעומת SSC ולהציג אירועים בלבד משער הגופייה שנוצר 5.2 כדי להעריך ביטוי PCM-1 באוכלוסיית הגופייה.
4. הפעל את מדגם שליטת אלוטיפ כדי להקים שער חיובי PCM-1 (איור 2 ג). הפעל כמות קטנה של PCM1 שכותרתו מדגם לאמת את PCM1 להביע עמדה האוכלוסייה gating.
5. ליצור עלילה המתארת ​​SSC-A vs 405/450/50-A (כדי לזהות DAPI). בחלקה זו, תצוגת גופייה רק ​​גרעינים להביע PCM1, באמצעות השערים שנוצרו 5.3. השתמש עלילה זה כדי ליצור שער hierarchal נוסף המכיל רק 2N גרעינים (איור 2 ד).
6. ליצור עלילה המתאר 488/535/30 א לעומת 1-633 / 660/20-א 'עד תאפשר זיהוי של תיוג edu של PCM1 להביע האוכלוסייה cardiomyocyte. הצגת גרעינים רק שהוא גופייה, P CM1 + ו- 2N באמצעות gating לעיל.
7. מדגם לב לברוח אין שליטת edu כדי להגדיר את השער החיובי edu (האיור 2E). צור את השער המתאים תאי EDU +.
8. גופיית שיא ולכמת, להביע 1 PCM, גרעיני 2N כי שלבו edu.
9. חישוב אוכלוסייה זו כאחוז הגופייה הכוללת, גרעיני PCM1 +. זה יספק את שיעור דור גרעינים-cardiomyocyte ניאו, בתקופת דופק 7 יום edu, כאחוז גרעיני cardiomyocyte הכולל.
   הערה: כפי DAPI מחייב DNA הוא stoichiometric את עוצמת הקרינה היא יחסי לכמות של DNA. לקבוע ploidy מבוסס על עוצמת 405/450/50-אות, כפי שתואר לעיל ^7.
10. כדי להעריך את ploidy בתוך האוכלוסייה cardiomyocyte הכולל להשתמש העלילה הוקמה בשנת 5.5 ואסטרטגיה gating מבוסס על DNA ריכוז ^7.

/files/ftp_upload/53979/53979fig2.jpg "/>
איור 2:. Gating אסטרטגיה לכמת cardiomyocyte edu התאגדות ploidy (א) גרעינים מופלים מן ההריסות מבוססות על פיזור קדימה (FSC) ולפזר בצד (SSC). (ב) שער ליניארי נוצר אוכלוסיית גרעיני הגופייה מזוהית מבוססים על תיוג DAPI וגובה 405/450/50 vs אות אזור. (C) gating פלורסנט מאפשר הפרדת הגרעינים cardiomyocyte (PCM-1-חיובי) ו-cardiomyocyte הלא (PCM-1-שלילי) גרעינים מרקמות הלב. Intensity (D) של האות DAPI משמש כדי לקבוע ריכוז דנ"א ploidy גרעינים ובכך האוכלוסייה cardiomyocyte PCM1 +. בשנת העכבר> 80% של גרעיני cardiomyocyte הם דיפלואידי (2n). (E) gating פלורסנט מאפשר הפרדת 2N, גרעינים cardiomyocyte אשר שילבו edu (PCM + / EDU + = 0.9%) מ 2N, cardiomyocytes אשר לא שולבו edu (PCM + חינוכיות). כל הצעדים מפורטים בפרוטוקול 5.0. בדוגמה המוצגת מן MDX ^{-. /} עכברים ^y על רקע C57 / BL10 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

תוצאות

שיטה זו מאפשרת כימות של התאגדות edu מוגברת בשל חלוקת גרעיני cardiomyocyte תוך פיקוח על polyploidization המוגברת. באמצעות assay מבוסס BrdU, הראינו בעבר כי הלב יונקים מגיב לאובדן cardiomyocyte כרונית, במודל עכבר MDX של ניוון שרירים דושן, עם התחדשות של שריר הלב החדש. השתמשנו בשיטות המתוארות כאן כדי להמשיך ולאמת את הממצאים שלנו שפורסמו וכדי להדגים את התועלת של הפרוטוקול. על פי הפרוטוקול המתואר; מבוגר (12 בן שבוע) עכברי bl10 MDX ושליטה היו פעמו עם זריקה יומית אחת edu למשך 7 ימים, שדווח בעבר כדי לאפשר ניתוח סטטי בין ^5,13 קבוצות ניסוי. ניתוח immunohistological הלבבות פעמו מדגים את הנוכחות של PCM1 להביע cardiomyocytes אשר שילבו edu (איור 3 א). עם זאת, הנתונים שהתקבלו usinיכול להתפרש שלא כהלכה גרם שיטות immunohistological, כמו סוגי תאים אחרים אשר שילבו edu ניתן בטעות כמפר cardiomyocytes. דוגמה לכך באה לידי ביטוי משלים איור 1 א 'וב'. זאת ועוד שיטות immunohistological אינן מבחינות polyploidization מחלוקה גרעינית. תזרים cytometry הניתוח המפורט בפרוטוקול זה מאפשר הכימות המהיר של חטיבה הגרעינית cardiomyocyte בעכברי MDX ובקרה, תוך הדרת תאים אשר שלבו edu בשל polyploidization. בדומה נתונים שפורסמו בעבר ^13, ניתוח הראה עלייה בשיעורי דור גרעינים הניא-cardiomyocyte בלבבות עכבר MDX לעומת גיל מתאים שולטים (1.2% לעומת 0.17%; איור 3 ו- C).

איור 3: כימות edu שכותרתו cardiomyocytes ב wildtype ולבבות MDX. (א) תמונה של תחזיות מחסנית Z שנלקחו 40 מיקרומטר חלקים עבים של לבבות MDX. PCM-1 גרעיני cardiomyocyte להביע (ירוק) אשר מאגד edu (אדום). החץ הצהוב מצביע edu שכותרתו cardiomyocytes. I ו- II מציין הפרט edu שכותרתו cardiomyocytes שמוצג מטוס- Z. גרעינים שכותרתו עם DAPI (כחול) (B ו- C) cytometry זרימה של גרעינים בודדים מראה מגרשים נציג 12-13 בשבוע סוג בר הישן (C57 / BL10) ועכברים MDX (MDX ^{- / y} על רקע C57 / BL10). (ב) היסטוגרמה מראה עוצמת DAPI ואפליה בין 2N ו> 2N גרעינים. מגרשים (C) מראים התאגדות edu באוכלוסיית גרעיני 2N cardiomyocyte כאשר נותח כמפורט בפרוטוקול זה. עבור כל העכברים Edu היה מנוהל במשך שבוע 1 מ 12 שבועות של גיל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 1 משלים:. PCM-1 הוא סמן ספציפי עבור גרעיני cardiomyocyte באמצעות הפרוטוקול המתואר גרעינים נותקו מן העכבר המהונדס הכפול המיוצר על ידי חציית TNT-cre עכברים ¹⁴ עם קו הכתב הרגיש ROSA ^{NT / NG} cre ^16. בהפעלת cre העכבר וכתוצאה בשליטת Troponin T האמרגן (TNT) מוביל ביטוי בלתי הפיך של GFP עם הוא מקומי הגרעינים. גרעינים שכותרתו עם שליטת אלוטיפ (ISO) מדגים את היכולת לזהות את אוכלוסיית גרעיני cardiomyocyte להביע GFP (488/530/30-א). תיוג של גרעינים עם אנטי PCM1 (נוגדנים משני זוהו על ידי 633-660 / 20-A) מדגים את מתאם ביטוי PCM1 עם cardiomyocy להביע GFPאוכלוסיית גרעיני te. בדוגמה זו 98.8% של גרעיני cardiomyocyte כפי שהוגדרו על ידי פעילות הפרומוטר TNT, מסומנים על ידי נוגדן PCM1. אנא לחץ כאן להורדת משלים איור 1.

איור 2 משלים:. אתגרים לכימות חידוש cardiomyocyte ידי טכניקות immunohistological (א) תמונה 2D מציגה שני PCM-1 גרעינים להביע cardiomyocyte (ירוק) אשר נראה להיות מתויג גם עבור edu (אדום). חצים צהובים עולים מה שנראה cardiomyocytes אשר שלב edu. זאת בשל את שיתוף לוקליזציה לכאורה הביטוי PCM1 וסימון edu כאשר דמיינו באמצעות הדמיה 2-מימדית. (ב) היטל 3 ממדים של תמונה זו מזהה את edu שכותרתו תאים אינם cardiomyocytes אבל הם תאים שאינם cardiomyocyte שמעל PCM1 להביע גרעיני cardiomyocyte. C57 / עכברים BL10 לאחר 12 שבועות של גיל המשמשים בניסויים. אנא לחץ כאן כדי להוריד איור 2A משלים. אנא לחץ כאן להורדת משלים איור 2B.

מרכיבי תגובה	מספר התגובות
	2	5
PBS	875 μl	2.19 מ"ל
מגן נחושת	20 μl	50 μl
יזיד picolyl צבע פלואורסצנטי	5 μl	12.5 μl
תגובה מדוללתחיץ ערוך 4.1	100 μl	250 μl
עוצמת התגובה סה"כ	1 מ"ל	2.5 מ"ל

טבלה 2: edu מרכיב קוקטייל. מתכון קוקטייל תיוג edu הנדרש בפרוטוקול סעיף 4 (איתור התאגדות edu).

דיון

כדי לכמת במדויק מחזור cardiomyocyte מבחני התחדשות יש להבחין בין הדור cardiomyocyte נכון וחילוק DNA פרודוקטיבי. מחקרים רבים ממשיכים פשוט להתעלם אירועים בלתי יצרניים אלה, לכימות התפשטות cardiomyocyte אך ורק דרך הביטוי של נִיעוּת cyclin וסמני מחזור התא. עד כה שיטה אחת המאפשרת הכימות המדויק של מחזור cardiomyocyte תוך פיקוח על אירועים בלתי יצרניים אלה נשאר מרומז. בפרט הוא נשאר קשה להסביר polyploidization cardiomyocyte התורמת עד ~ 65% של שכפול הדנ"א cardiomyocyte ^13. לכן כדי לסייע כימות המדויק של דור cardiomyocyte פתחנו פרוטוקול המאפשר כימותים החזקים של שיעורי גרעיני ניאו cardiomyocyte תוך הדרת שכפול הדנ"א שתוצאתו ploidy המוגברת. למרות בפרוטוקול זה לא יכול אפליה בין סוגים הניאו-cardiomyocytetion ו cardiomyocyte דו-התגרענות, ניתן להשתמש בו במהירות ובאופן מדויק לחשב את הגבול העליון (והיוו ploidy) של הדור cardiomyocyte. פרוטוקול זה ולכן מספק כלי הקרנה להעריך שינויים אפשריים בשיעורי דור cardiomyocyte ו polyploidization במודלי מחלה או להעריך את היעילות הפוטנציאלית של רפויים. לאחר שינויים בשער של דור גרעינים-cardiomyocyte ניאו מזוהה באמצעות פרוטוקול זה מחקרים מאוחרים יותר ניתן להשתמש כדי לבדוק אם זה עקב שינויים דורות cardiomyocyte של מספר התגרענות cardiomyocyte, כפי שתוארו לעיל ^2,13,17,18. אלה כוללים את שימוש דינמיקת התגרענות cardiomyocyte כימות היסטולוגית בתקופת הדופק או מנתח סעיפי רקמות המתקבל חי פעמיו edu כדי להשוות התאגדות edu באוכלוסיות cardiomyocyte mononucleated ו multinucleated.

בשל הרמות הנמוכות של מחזור cardiomyocyte זהפרוטוקול עושה שימוש זריקות מרובות של edu פני תקופה של 7 ימים. זה גם מאפשר "רודף" של כל מקורות הסלולר הפוטנציאל של דור cardiomyocyte ומתיר כימות של דור גרעיני cardiomyocyte המצטבר במשך פרק זמן זה. בהתאם המחקר, זמן זה עשוי להיות מותאם כדי להתאים את הרמות החזויות של דור cardiomyocyte. עבור כימות מדויק ההתאגדות edu בגרעינים cardiomyocyte, קיים הכרח כי אין תיוג הלא ספציפית של גרעינים עם נוגדנים משני המשמשים לאיתור תגובתיות PCM-1. לכן יהיה זה נבון לבצע ניסויי טיטרציה נוגדנים משני נוספים על מנת לייעל את ההיבט הזה של הפרוטוקול, במיוחד אם נוגדנים משני חוץ מזה הציעו בפרוטוקול זה הוא לשמש. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בביטוי PCM-1 לזהות גרעיני cardiomyocyte. אמנם זה מהווה סמן cardiomyocyte הוקמה, סמנים חלופיים שניתן להשתמש בהם כדי לאמתנתונים; אלה כוללים נוגדנים ספציפיים עבור לב Troponin T אשר זוהה בחלקו מקומי גרעיני cardiomyocyte ^1. בדומה לכך, חלבונים מקומיים גרעיניים חלופיים ניתן להשתמש כדי לזהות ולכמת התאגדות edu באוכלוסיות גרעינים אחרות מזה של cardiomyocytes. חשוב כי כל הגרעינים cardiomyocyte כי עוברים פעיל מיטוזה מודרים מן הניתוח, כמו גורלם של סינתזת ה- DNA הזה אינו ידוע ועלול לגרום גם חלוקת התא או ploidy מוגברת. PCM1 הוא מפורק בשלב M של מחזור התא ולכן cardiomyocytes שעברו מיטוזה לא יזוהה על ידי ביטוי PCM1. בנוסף, כל הגרעינים בשלב S של מחזור התא צריך להיות מחוץ לניתוח שלאחר מכן. זו יכולה להיות מושגת על ידי gating את כל הגרעינים בעוצמה DAPI מעל האוכלוסייה 2N כולל אלה עם עוצמת DAPI בין 2N ו 4N אוכלוסיות.

למרות זאת הוא יותר ויותרקיבל שהלב את היכולת להחליף cardiomyocytes במהלך הזדקנות נורמלית לבין פגיעה חריפה הבאה, את המקור ואת מידת הפוטנציאל הזה נשאר שנוי במחלוקת. בנוסף, שיעורים מפורד ממחזור cardiomyocyte דווחו ^1,7,20-22. זה עשוי להיות בין השאר בשל קשיים טכניים לאתר במדויק וכימות הדור הניאו-cardiomyocyte ^19. עד כה רוב המחקרים התבססו רק על השימוש בניתוח היסטולוגית והזיהוי של cardiomyocytes באמצעות ביטוי של חלבונים cytoplasmic, כולל חלבונים של sarcomere, כימות של מחזור cardiomyocyte והתחדשות ^2,4,23,24. השימוש בשיטות אלה כדי לזהות את הביטוי של סמני התפשטות, או כפי שהודגם כאן, השילוב של אנלוגים thymidine יכול לגרום בקלות מזיהוי השגויה של סוגי תאים לבביים אחרים כמו cardiomyocytes. בעוד השימוש הדמיה confocal 3D יכול לעזור כדי להקל על בעיות אלה השיטות אסה יקרות זמן רב. מעניין לציין, כי הפרוטוקול המתואר כאן מדגים הדור גרעינים-cardiomyocyte ניאו מתרחשת בקצב של 0.17% בשבוע. זה עולה בקנה אחד עם זרימת אחרים cytometry מחקרים המבוססים הוכחת שיעורי תחלופה שבועית של עד 0.13% ^5. למרות שזה מפתה להסיק שיעורי מחזור שנתיים על פי נתונים אלו, כמו במחקרים קודמים ^2,5,25,26, זו אינה מתאימה כמו ושיעור העזיבה הם דינמיים במהלך זמן חיים של חיה ^13.

לשיטה זו מספר היישומים הפוטנציאליים כוללים בחינה של הרפוי הפוטנציאלי כדי לשפר התחדשות cardiomyocyte או שבדק את ההשפעה של מחלת לב על מחזור cardiomyocyte ושיעורי polyploidization cardiomyocyte.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.32 מ' סוכרוז	סיגמא	84100
10 מ"מ Tris-HCl (pH = 8)	סיגמא	T3253
5 מ"מ CaCl2	Sigma	c5086
5 מ"מ מגנזיום אצטט	סיגמא	M-5661
2.0 מ"מ EDTA	סיגמא	E5134
0.5 מ"מ EGTA	סיגמא	63779
1 מ"מ DTT	Sigma	D0632
70 מ"מ KCl	Sigma	P9541
10 מ"מ MgCl2	Sigma	M8266
1.5 מ"מ זרע	סיגמא	85590
איזוטיפ ארנב IgG- ChIP כיתה	abcam	abc7415
ארנב אנטי-PCM-1 נוגדן	סיגמא	HPA023374
Alexa Fluor 488 F(ab')2 שבר של נוגדן IgG (H+L) נגד ארנב עזים	מסנני תאים	A-11070
70 μ m ו-100 μ מ	פישר סיינטיפיק	11597522, 11517532
זכוכית דונס (40 מ"ל) ועלי מרווח גדול	סיגמא	D9188-1SET
EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)	טכנולוגיות חיים	A10044
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 זרימה ציטומטריה ערכת בדיקת	חיים	טכנולוגיות חיים C10634	ערכה זו כוללת  ריאגנטים נדרשים לחתך, מאגר תגובת EdU,  תמיסת חדירה מבוססת ספונין של EdU והריאגנטים הנדרשים לקוקטייל התיוג של EdU.
ערכת CyStain DNA 2 שלבים,	Sysmex Partec	05 5005	ערכה זו כוללת  ריאגנטים הנדרשים לתיוג DAPI (תמיסת צביעת DNA)
הומוגני בדיקה, למשל , TissueRuptor	Qiagen	9001273
TissueRuptor בדיקות חד פעמיות	Qiagen	990890
אולטרה-צנטריפוגה	Sorvall
Facscanto II	BD Biosciences
, דופן דקה, פוליפרופילן. 38.5 מ"ל, 25 x 89 מ"מ	בקר Beckman Coulter	326823
Bovine	סיגמא	A2153