מאמר שיטה

הכנת ג'לי 3D קולגן microchannels לחקר אינטראקציות 3D In vivo

DOI:

10.3791/53989

⸱

9 במאי 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, 2Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison, 4Morgridge Institute for Research, University of Wisconsin-Madison, 5Paul P. Carbone Comprehensive Cancer center, University of Wisconsin-Madison

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קולגן הוא רכיב ליבה של ECM, ומספק רמזים חיוניים מספר תהליכים תאיים החל הגירת בידול ושגשוגם. הניתן כאן הוא פרוטוקול להטבעת תאים בתוך הידרוג קולגן 3D, טכניקה מתקדמת יותר ליצירת מטריצות קולגן אקראי או מיושר באמצעות microchannels PDMS.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מבחינה היסטורית, רוב התהליכים התאיים נחקרו בשני ממדים בלבד. בעוד שמחקרים אלה היו אינפורמטיביים לגבי מנגנוני איתות תאים כלליים, הם מזניחים רמזים תאיים חשובים המתקבלים מהתכונות המבניות והמכניות של המיקרו-סביבה המקומית והמטריצה החוץ-תאית (ECM). כדי להבין כיצד תאים מתקשרים בתוך ECM פיזיולוגי, חשוב לחקור אותם בהקשר של מבחנים תלת מימדיים. נדידת תאים, התמיינות תאים והתפשטות תאים הם רק כמה תהליכים שהוכחו כמושפעים משינויים מקומיים בתכונות המכניות של ECM תלת מימדי. קולגן I, מרכיב סיבי ליבה של ה-ECM, הוא יותר ממרכיב מבני פשוט של רקמה. בתנאים רגילים, רמזים מכניים מרשת הקולגן מכוונים מורפוגנזה ושומרים על מבנים תאיים. במיקרו-סביבות חולות, כגון מיקרו-סביבת הגידול, רשת הקולגן עוברת לעתים קרובות עיצוב מחדש באופן דרמטי, ומדגימה הרכב שונה, תצהיר משופר וארגון סיבים שונה. בסרטן השד, מידת יישור הסיבים חשובה, שכן עלייה בסיבים מיושרים בניצב לגבול הגידול נמצאה בקורלציה לפרוגנוזה גרועה יותר של המטופל1. מטריצות קולגן מיושרות גורמות להפצה מוגברת של תאי גידול באמצעות נדידה מתמשכת2,3. להלן פרוטוקול פשוט להטמעת תאים בתוך הידרוג'ל קולגן סיבי תלת מימדי. פרוטוקול זה ניתן להתאמה בקלות לפלטפורמות רבות, ויכול לייצר באופן שחזורי מטריצות קולגן מיושרות ואקראיות לחקירת נדידת תאים, חלוקת תאים ותהליכים תאיים אחרים במיקרו-סביבה פיזיולוגית תלת מימדית מתכווננת.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תהליכים תאיים רבים נחקרו בהרחבה בשני ממדים, ובכך יצרו ידע קולקטיבי של מנגנוני איתות תאים בסיסיים. עם זאת, מחקרים אלה מזניחים רמזים תאיים חשובים המתקבלים מהתכונות המבניות והמכניות של המיקרו-סביבה התאית המקומית והמטריצה החוץ-תאית (ECM). כדי להבין טוב יותר כיצד תאים מתקשרים בהקשר פיזיולוגי, חשוב לחקור אותם במבחנים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים). ה-ECM עבור מבחנים תלת-ממדיים אלה יכול להיות נגזר מתאים או מורכב מחדש מחלבונים מטוהרים. ללא קשר למקור ה-ECM, מבחני מטריצה תלת מימדיים הוכחו כבעלי ערך רב להבנת האופן שבו תאים מנווטים ומתקשרים בתוך העולם הפיזיולוגי. לדוגמה, תאים הגדלים במטריצות תלת-ממדיות מציגים מצבי תנועה מובהקים התלויים באופי המכני של ה-ECM הסובב אותם, שאינם נצפים בניסויים דו-ממדיים4-6. יתר על כן, לתאים שגודלו בתלת מימד יש גם פחות ופחות סיבי לחץ והידבקויות מוקדיות בולטים יותר מאשר עמיתיהם הגדלים על משטחים קשים כמו זכוכית או פלסטיק7.

עם זאת, החשיבות של מבחני תלת מימד קונטקסטואליים אינה מוגבלת לנדידת תאים. ניתן לחקור כמה אירועי איתות תאים אחרים רק באמצעות מבחני תלת מימד. במהלך התמיינות רקמות ותאים, נוקשות הסביבה החוץ-תאית ו-ECM מספקת אותות שיכולים להשפיע על אירועים מורפוגניים. לדוגמה, טובולוגנזה של אפיתל החלב מתרחשת רק במטריצות תלת-ממדיות עם קשיחות נמוכה, אך לא במטריצות נוקשות וגם לא בשכבות דו-ממדיות8,9. כאשר הם מתורבתים בתוך מטריצות תלת מימד נוקשות, אותם תאי אפיתל מקבלים פנוטיפ חריג עם התפשטות מוגברת ובליטות קרום התא המונעות באמצעות איתות FAK ו-ERK משתנה10. ידוע כי מסלולי איתות ותהליכים תאיים רבים אחרים מושפעים באופן דומה מהנוקשות של הסביבה התאית המקומית, ומפלי איתות אלה מדגישים את החשיבות של חקירת אירועי איתות ופנוטיפ תאי בהקשר של תכונות מכניות מקומיות מתאימות של ECM תלת מימדי.

קולגן I הוא חלבון רלוונטי במיוחד לשימוש במחקרי מבחנה מכיוון שהוא המרכיב הנפוץ ביותר ב-ECM ואחראי על רבות מהתכונות המכניות של המיקרו-סביבה התאית. בעוד שבמקור הוא נחשב לחלבון מבני בלבד, כיום ידוע שתפקידו מורכב בהרבה. הרכב סיבי הקולגן, הארכיטקטורה, הכיוון, הצפיפות והנוקשות מספקים כולם סביבה מרוכזת של מידע איתות5. במהלך התקדמותן של מחלות מסוימות, כגון דלקת כרונית וגידול, רשת הקולגן מעוצבת מחדש באופן דרמטי2,11. ליתר דיוק בסרטן השד, שקיעת קולגן מוגברת ונוקשות רקמות מלוות וככל הנראה תורמות להתקדמות הגידול. בגידולים מוקדמים אלה, רשת הקולגן הנוקשה נראית מתוחה ומיושרת יותר, כך שרוב הסיבים עוטפים את הגידולהגדל 2. ככל שהגידול מתקדם, הקולגן ממשיך להתארגן מחדש, ואזורים ברשת הסיבית הופכים מכוונים בניצב לגבול הגידול2,12. יישור מאונך משמש כסמן ביולוגי פרוגנוסטי שבו לחולים אלה יש התקדמות גרועה יותר ללא מחלה והישרדות כללית1. הסבר אחד למתאם זה הוא שהתוצאות הגרועות הן תוצאה של התפשטות מוגברת של תאי גידול באמצעות נדידת תאים מתמשכת ברשתות קולגן מיושרות3.

כדי להבין כיצד תאים מגיבים באופן ספציפי ליישור וארגון שנצפו בהתקדמות הגידול, יש צורך ליצור מטריצות קולגן תלת-ממדיות אקראיות ומיושרות לניסויים. ישנן שלוש מתודולוגיות בסיסיות לגרימת יישור בתוך רשתות סיביות. הטכניקה הראשונה משתמשת במכשיר מעורר מתח שבו הקולגן בין שתי נקודות מכווץ או נמתח כדי ליצור יישור. סיבים המקבילים לציר הכוח נמשכים מתוחים ואילו סיבים בניצב לציר נדחסים ומכווצים. בעוד שטכניקות הנגרמות על ידי מתח מציעות בדרך כלל יישור מעולה, גישה זו דורשת ציוד מגושם שאינו ניתן להתאמה בקלות לפלטפורמות רבות3,13. לחלופין, ניתן ליצור מתח המושרה על ידי תאים על ידי הצבת פקקים מקומיים של תאים שלאחר מכן מתכווצים ומיישרים את הקולגן13. לשיטה זו יש בעיה להיות משתנה, מכיוון שפרמטרים רבים עשויים להיות כפופים לשינויים. השיטה השנייה משתמשת בחרוזים מגנטיים ובשדה מגנטי במהלך פילמור כדי לגרום ליישור קולגן13,14. ניתן להשיג תוצאות טובות משיטה זו עם ציוד לא מתוחכם, אך היא דורשת שימוש בנוגדנים או בשיטה אחרת כדי למגנט את הפולימר. לכן, זה יכול להיות מעט יקר לשימוש, והנוקשות של ג'ל הקולגן עשויה להשתנות על ידי החיבורים המוגברים ברשת. יתר על כן, החרוזים המגנטיים המשמשים בתהליך זה הם לרוב אוטו-פלואורסצנטיים, וזה בעייתי עבור ניסויי הדמיה. לבסוף, ניתן ליצור יישור על ידי תעלות מיקרופלואידיות PDMS3,15,16. בשיטה זו, יישור קולגן מושג על ידי הזרמת קולגן מפולמר דרך תעלות מיקרופלואידיות קטנות. ניתן לייצר תעלות מיקרופלואידיות אלו במספר רב של עיצובים, וניתנות להתאמה בקלות לפלטפורמות רבות. יתר על כן, הם חסכוניים מאוד מכיוון שמשתמשים בכמויות קטנות מאוד של קולגן וריאגנטים אחרים בשל גודלם הזעיר

.

מסופק כאן פרוטוקול פשוט להטמעת תאים בתוך הידרוג'ל קולגן סיבי תלת מימדי. בנוסף, ניתנת גם טכניקה מתקדמת יותר, שבה משתמשים בתעלות מיקרופלואידיות PDMS לשליטה בארגון ויישור מטריצת הקולגן. פרוטוקול זה ניתן להתאמה בקלות לפלטפורמות רבות, ויכול ליצור באופן שחזורי מטריצות קולגן מיושרות ואקראיות לחקירת נדידת תאים, חלוקת תאים ותהליכים תאיים אחרים במיקרו-סביבה פיזיולוגית תלת מימדית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. נטרול, דילול פלמור של פתרונות קולגן לחקירת 3D מבחני התכווצות סלולארית

  1. על הקרח ברדס רקמה סטרילית תרבות, לנטרל קולגן (1: 1) עם 100 HEPES מ"מ סטרילי, קר כקרח PBS 2x, pH 7.4, צינור חרוטי 15 מ"ל. מערבבים היטב עם פיפטה פלסטיק עד הפתרון הוא הומוגני מערבולות ערבוב אינן גלויות. היזהר לא להכניס בועות אוויר במהלך תהליך הערבוב. אחסן בקצרה על קרח.
  2. לדלל קולגן מנוטרל לריכוז המתאים עם התקשורת תא (כגון RPMI, DMEM, וכו ').
    1. כדי לחשב את כמות הקולגן לנטרל נדרש לפצות ריכוז הקולגן הרצוי, השתמש המשוואה N = (D * V) / (S / 2), כאשר N הוא כמות הקולגן לנטרל נדרש, D הוא ריכוז הקולגן הרצוי, V הוא הנפח הסופי של ריכוז הקולגן הרצוי, ו- S הוא tהוא החל ריכוז קולגן המניות.
    2. להעלות את כמות הקולגן לנטרל עד נפח על ידי התוספת של פתרון תקשורת תא ותא. מערבבים היטב ולאחסן על הקרח עד ומוכן להעברה.
      1. דוגמה: עבור ג'ל 2 מ"ג / מ"ל ​​בנפח ג'ל 1 מ"ל (נפח אופייני בגבס ג'ל בצלחת 6 היטב או 50 צלחת מ"מ זכוכית התחתונה), הראשון להכפיל את הריכוז הרצוי (2 מ"ג / מ"ל) על פי היקף הסופי הרצוי (1 מ"ל). קח את המספר הזה (2 מ"ג) ולחלק אותו בחצי של ריכוז המניות הרשומים על הבקבוק (9.49 מ"ג / מ"ל). במקרה זה, 0.42 מ"ל של קולגן לנטרל מדולל 0.58 מ"ל של תערובת מדיה / תא.
  3. Pipet קולגן / תא קר כקרח / מדיה התערובת לתוך או תרבות שאינם רקמות שטופלו 6-גם צלחת או צלחת תחתית זכוכית 50 מ"מ. השתמש טיפ pipet להתפזר הפתרון באופן שווה.
    הערה: חשוב להשתמש לתרבות הלא-רקמות שטופלו צלחת כדי למזער את הקובץ המצורף או צמיחה של תאים מחוץ collagen ג'ל.
  4. אפשר לפלמר בטמפרטורת החדר למשך כ 10 - 15 דקות. הג'לים צריכים לפנות אטומים על פילמור.
  5. אחרי זה הפך אטום, להעביר צלחת או צלחת ל -37 צלזיוס למשך נוספות 45 - דקות 60 כדי לסיים פילמור.
  6. אחרי 45 - 60 דקות, להוסיף 2 - 3 מ"ל של התקשורת ולשחרר ג'לים מן הצדדים של הבאר-ידי הפעלת טיפ p200 pipet סביב ההיקף של טוב או צלחת. צלחת מערבולת בעדינות כדי לשחרר את הג'ל. ג'ל קולגן צריך להיות צף בתקשורת.

2. המערבי סופג, תא המורפוגנזה וג'ל Gontractility Assay

  1. כדי להעריך את רמות החלבון, מורפולוגיה או התכווצות הסלולר ביחס ECM נוקשות, להתחיל לשפוך ג'ל קולגן, על פי ל -1.1 - 1.6, זורעים עם תאים עבור 7 - assay יום 10. לקבוע כל שיעור זריעת תאי קו בהתאם אמפירי על שיעור צמיחה ואת confluency. עבור assay 10 יום, צפיפות הזריעה יכולה לנוע בין 20,000 - 100,000 תאים / ג'ל.
  2. כדי למדודהתכווצות תא, למדוד את קוטר ג'ל באמצעות סרגל או מצלמה כל 24 שעות או על מרווח הזמן המתאים.
    הערה: בנוסף, תמונות מקבילות שנאספו מיקרוסקופ ניתן לבדוק עבור מאפיין תכונות מורפולוגיות של הקו הסלולרי זורע בתוך הג'ל, כגון מבני acini דמוי, tubules אפיתל, בליטות הסלולר, lameliapodia.
  3. כדי להעריך את רמות החלבון, lyse הג'לים ב Ripa חיץ תהליך לניתוח כתם המערבי של חלבונים בעלי עניין כמתואר ווזניאק et al. 17 ו גלאגר et al. 18.
    1. חשוב: השוואות של התכווצות בין שורות תאים, לנרמל contractility ל- DNA הכולל, אשר יכול להיות מופק הג'לים כפי שתואר על ידי לואי, et al 19, או לחלבון משתנה, משק בית (היסטונים, GAPDH, וכו ') על ידי המערב. ניתוח כתם, כמתואר ווזניאק et al. 17 ו גלאגר et al. 18. אם תאים לספור בתוך הג'ל באמצעות hemocytometer, לוודא לנרמל מספר הסלולרי לאזור ג'ל ליום הג'ל קבלנות יתרכז תאים.
  4. ג'לים Feed כל 3 - 4 ימים על ידי הסרת 1 מיליליטר של תקשורת והחלפתו 1 מיליליטר של תקשורת הטריה. הקפד להאכיל ג'לים אחרי המדידה נלקחת כמו תוספת של / סרום התקשורת טרי תגרום לעליה חדה במספר התכווצות.

דור 3. PDMS microchannels עבור יישור סיבי קולגן

הערה: כדי ליצור מטריצות קולגן מיושר, תבנית עבור microchannels PDMS (איור 2 א) דורש מאסטר סיליקון SU-8 עשה דרך-ליתוגרפיה רך 15.

  1. כדי להפוך ערוצי PDMS, לערבב PDMS ביסודיות בכוס חד פעמית עם מקל מלאכה. לקבלת מאסטר סיליקון 6 אינץ ', לערבב 20 גרם של בסיס אלסטומר עם 2 גרם של סוכן ריפוי.
  2. דה-גז התערובת PDMS על ידי הנחת כוס חד פעמי בתא ואקום בלחץ ואקום של550 מ"מ כספית. דה-גז 1 - 1.5 שעות.
  3. בעוד דה-בגז את PDMS, להכין את המאסטר סיליקון למילוי. הכן ידי הצבת סדין נקי של סרט שקיפות על פלטה חמה ואחריו אדון סיליקון. ודא כי עובש microchannel פונה כלפי מעלה.
    הערה: במהלך ליהוק PDMS וריפוי, המאסטר סיליקון יהיה דחוק בין שתי יריעות של סרט שקיפות.
  4. לאחר ה -1 - 1.5 שעות, להסיר את PDMS בגז דה מהאולם ואקום, ולאט לאט ויוצקים מעל את המאסטר סיליקון.
    חשוב: הימנע בועות אוויר. ממשיכים לזרום במרכז הורים, ולאפשר את כוח המשיכה כדי להפיץ אותו באופן שווה.
    הערה: ירידת PDMS לא צריכה להאריך את כל הדרך עד לקצה של המאסטר.
  5. לאחר PDMS כבר שפכו על המאסטר, להחיל גיליון שני של סרט שקיפות על גבי אדון סיליקון PDMS. בזהירות, לגלגל את גיליון שקיפות השני למטה על גבי האדון PDMS / סיליקון כדי למנוע בועות אוויר. אל תמהר. PDMS יש עכשיו להתפשט באופן שווה oמאסטר Ver.
  6. בעדינות להניח סדין גומי על גבי שקיפות, ואחריו גיליון 1/8 "אקריליק.
  7. מוסיפים שלוש 10 lb משקולות על גבי גיליון אקריליק. בתחילה, המשקולות תהיינה "לצוף". לאפשר להם להתיישב ולייצב לפני שתמשיך.
  8. גדר טמפרטורת פלטה חשמלית ל -70 PDMS C ו- מרפא 4 שעות. אפשר להתקרר במשך מינימום של 1 hr נוסף לפני מטריד.
  9. בזהירות לקלף גיליון העליון של שקף מן הרקיק, ולהסיר את הערוצים עם מלקחיים.
  10. חנות בצלחת ללא אבק עד מוכן לשימוש.

4. הכנות PDMS microchannels לשימוש

  1. ערוצי מקום במהופך על שקפים חדשים, נקיים. יציאות כל נקי (איור 2b) באמצעות תנועה מעגלית עם מלקחיים חדים. הסר את כל שברי PDMS.
  2. ערוצים נקיים באמצעות פיסת אריזת קלטת כמו מטלית טקטיקה. החל קלטת השטח של הספסל (הצד הדביק כלפי מעלה), ולאחר מכן להגדיר o ערוץהעליון n. לחץ כלפי מטה על ערוצים עם קצה מעוגל של מלקחיים כדי להבטיח מגע טוב. סור וחזור משני הצדדים עד פסולת גלויה מוסר.
  3. העברת ניקה, הכינו ערוצי PDMS לתוך חרוטי 50 מ"ל עם 70% EtOH. וורטקס במהירות מרבית למשך 30 שניות. בטל EtOH ולהחליף EtOH 70% טרי. חנות ב 70% EtOH עד מוכן לשימוש.
  4. במנדף בתרבית רקמה ושימוש בטכניקות ספטית, להעביר את ערוצי PDMS לכוס או מכסה זכוכית נקי וסטרילי מנות תחתית. שים את הפינוק מעלה UV צד בערוץ עד EtOH התאדה.
  5. לאחר יבש, להעיף את PDMS כך הערוצים הם פונים כלפי מטה לכיוון coverglass. לחץ על PDMS הערוץ כלפי מטה על הזכוכית כדי להפוך את חותם טוב. הוספת תיקון של PDMS סטרילי כדי לכסות / לסגור את הנמל למרכז (נמל B, איור 2b). ולאפשר לו להתייבש ביסודיות לפני שתמשיך.
  6. טרום המעיל הפנימי של הערוץ עם קולגן 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​מים סטריליים. כדי מעיל, למקם טיפה 100 μl על החלק העליון של channאל, ולצייר דרך עם ואקום. אחרי השעה 1 ב 37 C, ערוצי העברה מלאים פתרון ציפוי קולגן כדי מקרר. צ'יל למשך כ 15 - 30 דקות.
  7. הסר פתרון ציפוי קולגן עם aspirator או pipet, ולהתחיל הכנה קולגן.

5. הכנת קולגן לשימוש ב microchannels

  1. על קרח, לנטרל קולגן (1: 1) עם 100 קר כקרח HEPES מ"מ ב 2x PBS, pH 7.4. מערבבים היטב עד הומוגנית (לפרטים נוספים, ראה סעיף 1.1).
  2. לדלל קולגן מנוטרל על הריכוזים המתאימים עם תקשורת תא (לפרטים נוספים, ראה סעיף 1.2). דגירה במשך 15 דקות על קרח.
  3. במקביל, צמרמורת רכוב ערוצים על קרח.
    הערה: המטרה היא לקבל את כל הרכיבים הדרושים לתהליך ערוץ ב 4 C או מתחת. הטמפרטורה וזמן קולגן התגרענות כמה פרמטרים עיקריים לתהליך פילמור, ועלולה להיות נקודת ההתחלה עבור אופטימיזציה נוספת, במידת הצורך.
  4. counתאי T עם hemacytometer ו resuspend על צפיפות הזריעה המתאימה בשלב זה. על מנת להקל על חישובים, resuspend ל 3 - 1 מיליון תאים / מ"ל. (לפרטים נוספים, ראה גם סעיף 2.1).
  5. לאחר תאים נספרו ו -15 דקות עברו, המשך קולגן לשפוך.

6. לשפוך בציר microchannels אקראי קולגן

  1. לפני ציור קולגן בצינורות, להתאים ולהגדיר לחץ ואקום עם רגולטור ואקום מוטבע. לחץ אבק מספק כוח כדי לעודד ו לשלוט על קצב זרימת קולגן, אשר קובע את מידת יישור.
    1. עבור מטריצות אקראיות או unaligned, משתמש בערוץ רחב (x הרחב 3mm 200 מיקרומטר גבוה) עם לחץ ואקום של 10 מ"מימ כספיים או פחות.
    2. עבור מטריצות מיושרות, השתמש תעלה צר (1 מ"מ רחב x 200 מיקרומטר גבוה) עם לחץ ואקום של 60 מ"מ כספי או יותר.
  2. הסר ערוץ רכוב מקרח ומניחים על משטח נקי, מחוטא של h זרימה למינריתood.
  3. לעבוד במהירות לטעון 120 - 150 μl של קולגן לנטרל ליציאה (איור 2b).
  4. צייר קולגן דרך הערוץ על ידי הצבת 25 מ"ל pipet המצורפת קו ואקום מעל ג הנמל (איור 2b). צייר קולגן באמצעות בתנועה אחידה. חשוב: לקבלת מטריצות אקראיות או unaligned, לצייר קולגן לאט ברחבי הערוץ (כ 0.5 - 1 מ"מ לשנייה), ולהפסיק ברגע שהוא מגיע בסופו של דבר. עבור מטריצות מיושרות, לצייר את הקולגן ברחבי במהירות רבה יותר, אך היזהר כדי למנוע בועות אוויר.
  5. מוציאים בזהירות קולגן עודף מאזור הנמל עם pipetman או aspirator p200.
  6. מניח טלאי PDMS סטרילית על שני יציאות A ו- C. כל היציאות צריכות להיות מכוסות כעת.
  7. לאחר 2 - 3 דקות, להסיר תיקון מרכז PDMS (B port) ולהוסיף 3 - 2 μl של תאים (5 - 10 אלף תאים) ליציאת המרכז. אפשר לפלמר חלקית (להפוך אטום) בטמפרטורת החדר למשך עוד 10 - 15 דקות.
  8. אחרי 10- 15 דק ', העברה ל -37 צלזיוס למשך 15 נוספות - 30 דקות כדי לסיים פילמור. סר מכסה PDMS ולהוסיף תקשורת לכסות את תרבות תאי ערוץ לחלוטין לפי צורך. תאים יכולים להיות מוזן על ידי הסרת מ"ל של המדיה הישנה, ​​והחלפתו עם מ"ל של המדיה החדשה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעוד מבחני 3D ניתן לעשות זאת בתוך אותה הנוקשות של ג'ל קולגן, שינוי הקשיח ג'ל ניתן להשתמש כדי לקבוע כיצד התאים יגיבו לשינויים מכאניים microenvironment הסלולר שלהם. הידרוג קולגן נוקשה מוגדר כג'ל שבו התאים המוטבעים אינם מסוגלים מקומית להתכווץ קולגן שמסביב. ההתכווצות הפנימית של תאים מסוגים שונים היא ייחודית, ולכן עדיף להתחיל עם עקומת contractility פשוט להקים ריכוז הקולגן כי יהיה המורגש תואם ונוקשה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ג'ל קולגן 3D הם תוספת רבת ערך בארגז הכלים שלנו כדי להבין כיצד תאים לפרש ולהגיב microenvironment המקומית שלהם. כתב יד זה ספק פרוטוקול בסיסי מאוד להטבעת תאים בתוך מטריצת קולגן 3D, וכדי ליצור מטריצות reproducibly עם סיבי קולגן אקראיים או מיושרים. פרוטוקולי שניהם עובדים פלטפורמות וישימות היכן isoforms קולגן השונה, crosslinkers, או חלבונים מטריקס אחרים ניתן להוסיף פוטנציאלי בעת פילמור. זה גם קל לשנות את הפלטפורמות להעריך זמנים ונקודות קצה שונים עבור ביטוי גנים וייצור חלבון. הדמיה, ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים אין לחשוף

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות UO1CA143069 מספרים מענק, R01CA142833, R01CA114462, RO1CA179556, T32-AG000213-24, ו T32-GM008692-18 למימון עבודה זו. אנחנו גם מכירים ג'רמי Bredfelt ו Yuming ליו של לוקוסים לפיתוח וסיוע בניתוח CT-FIRE.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קורנינגקולגן זנב עכברוש בריכוז גבוה354249
ערכת אלסטומר SylGard184קורנינגNC9285739אלסטומר לתעלות PDMS
HEPESFisherBP310עבור מאגר נטרול HEPES
KCl פישרBP366עבור מאגר נטרול HEPES
KH2PO4FisherBP362עבור מאגר נטרול HEPES
Na2HPO4FisherS374עבור מאגר נטרול HEPES
NaClFisherBP358עבור מאגר נטרול HEPES
היטל נויבאואר המציטומטר משופרפישר15170-208ספירת תאים 6 בארות
צלחת תרבית שאינה רקמה קורנינג351146
צלחת תחתית זכוכית 50 מ"מMatTekP50g-1.5-30-f
Bel-Art פלסטיק מייבש ואקום Bel-ArtBel-ArtF4200-2021תא הסרת גז
לסרט שקיפות PDMS 3Mpp2950סרט פלסטיק למזיגת תעלות pdms
ThermoScientific CimaRecThermoScientific HP141925פלטה חמה לריפוי מיקרו-ערוצים PDMS
ווסת ואקוםדיוקרפואי PM3100ווסת ואקום למיקרו-ערוצי קולגן
8 אינץ' x 8 אינץ' יריעת גומיאמזון - גומי-קלסיליקון -יריעת גומי 60A למזיגת מיקרו-ערוץ PDMS
8 אינץ' x 8 אינץ' x 0.125 אינץ' יריעת אקריליקיריעות פרספקסשל אמזוןלמזיגת מיקרו-ערוצי PDMS
משקולות 10 ק"גמשקולת אמזוןCAPלמזיגת מיקרו-ערוצים PDMS
15 מ"ל צינורות חרוטייםפישר352097
50 מ"ל צינורות חרוטייםפישר352098
צנרת פלסטיקנקודה מדעית229202B, 229206B ו-667225B2  מ"ל, 5  מ"ל ו-25  מ"ל
70% EtOHפישרNC9663244

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. Am J Pathol. 178, 1221-1232 (2011).
  2. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4, 38(2006).
  3. Riching, K. M., et al. 3D collagen alignment limits protrusions to enhance breast cancer cell persistence. Biophys J. 107, 2546-2558 (2014).
  4. Even-Ram, S., Yamada, K. M. Cell migration in 3D matrix. Curr Opin Cell Biol. 17, 524-532 (2005).
  5. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. J Cell Biol. 188, 11-19 (2010).
  6. Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197, 439-455 (2012).
  7. Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Curr Opin Cell Biol. 14, 633-639 (2002).
  8. Wozniak, M. A., Desai, R., Solski, P. A., Der, C. J., Keely, P. J. ROCK-generated contractility regulates breast epithelial cell differentiation in response to the physical properties of a three-dimensional collagen matrix. J Cell Biol. 163, 583-595 (2003).
  9. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
  10. Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage. Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).
  11. Tlsty, T. D., Coussens, L. M. Tumor stroma and regulation of cancer development. Annu Rev Pathol. 1, 119-150 (2006).
  12. Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11(2008).
  13. Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization. Biophys J. 95, 5374-5384 (2008).
  14. Guo, C., Kaufman, L. J. Flow and magnetic field induced collagen alignment. Biomaterials. 28, 1105-1114 (2007).
  15. Sung, K. E., et al. Control of 3-dimensional collagen matrix polymerization for reproducible human mammary fibroblast cell culture in microfluidic devices. Biomaterials. 30, 4833-4841 (2009).
  16. Lee, P., Lin, R., Moon, J., Lee, L. P. Microfluidic alignment of collagen fibers for in vitro cell culture. Biomed Microdevices. 8, 35-41 (2006).
  17. Wozniak, M. A., Keely, P. J. Use of three-dimensional collagen gels to study mechanotransduction in T47D breast epithelial cells. Biol Proced Online. 7, 144-161 (2005).
  18. Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 10, Unit 10 18(2008).
  19. Liu, X., Harada, S. DNA isolation from mammalian samples. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 2, Unit 2 14(2013).
  20. Roeder, B. A., Kokini, K., Sturgis, J. E., Robinson, J. P., Voytik-Harbin, S. L. Tensile mechanical properties of three-dimensional type I collagen extracellular matrices with varied microstructure. J Biomech Eng. 124, 214-222 (2002).
  21. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. J Biomed Opt. 19, 16007(2014).
  22. Bischel, L. L., Beebe, D. J., Sung, K. E. Microfluidic model of ductal carcinoma in situ with 3D, organotypic structure. BMC Cancer. 15, 12(2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PDMS

מאמרים קשורים