הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניתוח Transfection siRNA ו Emsa על Cytotrophoblasts Villous אדם המבודד טרי

10.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53995

⸱

20 בספטמבר 2016

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Quebec in Montreal, 2Department of Pharmacology and Therapeutics, McGill University, 3Department of Clinical Sciences, University of Montreal

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה transfecting siRNA ב cytotrophoblasts villous אדם המבודד טרי באמצעות microporation וזיהוי מתחמים-חלבון ה- DNA בתאים אלה. תאי transfected יכולים להיות במעקב על ידי כתם מערבי Emsa מנתח בזמן תרבות 4 ימים.

תקציר

ציטוטרופובלסטים ראשוניים אנושיים הם מקור שימושי מאוד לתאים ראשוניים לחקר תפקודי שליה ומנגנוני ויסות ולהבנת מחלות הקשורות להריון. בפרוטוקול זה, ציטוטרופובלסטים ראשוניים אנושיים שבודדו טריים מהשליה באמצעות פרוטוקול DNase/trypsin סטנדרטי עוברים מיקרופובלס עם RNA מפריע קטן (siRNA). גישה זו סיפקה יעילות רבה יותר לטרנספקציה של siRNA בהשוואה לשיטה מבוססת ליפופקציה. לאחר מכן ניתן לנתח תאים שעברו טרנספקציה על ידי כתם מערבי סטנדרטי בתוך מסגרת זמן של 3-4 ימים לאחר הטרנספקציה. בנוסף, באמצעות ציטוטרופובלסטים ראשוניים מתורבתים, ניתוח Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) עבר אופטימיזציה ובוצע על תמציות מימים 1 עד 4. השימוש בתאים ראשוניים מתורבתים אלה והפרוטוקול המתואר מאפשרים להעריך את ההשלכות של גנים ספציפיים וגורמי שעתוק בתהליך התמיינות הציטוטרופובלסט לשכבת תאים דמוית סינציטוטרופובלסט. עם זאת, טווח הזמן המוגבל המותר בתרבית מונע שימוש בשיטות הדורשות זמן רב יותר, כגון יצירת אוכלוסיית תאים יציבה. לכן בדיקה של אוכלוסיית תאים זו דורשת פרוטוקולי העברת גנים אופטימליים ביותר.

מבוא

תפקוד לקוי של השליה האנושית קשור להתפתחות של מספר מחלות הקשורות להריון כמו רעלת הריון והגבלת גדילה תוך רחמית 1. מרכיב תאים חשוב של השליה הוא הטרופובלסטים, אותם ניתן לסווג כציטוטרופובלסטים חוץ-וויליים או וילוסיים. עם האיחוי, ציטוטרופובלסטים וילוסיים מתמיינים עוד יותר לשכבת הסינציטיוטרופובלסט, מבנה תאים רב-גרעיני בעל תפקיד חשוב בחילופי עובר-אימהות וייצור הורמונים 2. ציטוטרופובלסטים ראשוניים אנושיים ועמיתיהם המובחנים מייצגים דגימות ביולוגיות חשובות ומאפשרים לחוקרים לחקור מספר תהליכים הקשורים לשליה, כגון איחוי תאים, בתרבית. יתר על כן, נמשכים מאמצים ניכרים לזהות סמנים שיאפשרו ניהול מתאים וישפרו טיפולים מונעים ספציפיים למחלות הקשורות להריון. מעבדות מבודדות באופן שגרתי ציטוטרופובלסטים אנושיים ראשוניים משליה טרייה, תוך שימוש בהליך בידוד סטנדרטי המבוסס על עיכול טריפסין של villi שליה 3. מכיוון שציטוטרופובלסטים מתורבתים מאבדים את יכולתם להתרבות ולהתמיין במהירות בשכבה דמוית סינציטוטרופובלסטים על תרבית 4, יש צורך בשיטות טרנספקציה יעילות מאוד וגישות ניתוח אופטימליות. מחקרים קודמים קבעו תנאים אופטימליים לטרנספקציה של ציטוטרופובלסטים ראשוניים אלה 5. כאן מוצגת שיטה אחרת של העברת siRNA, שנבדקה בעבר בתא מסוג 6 זה. בהשוואה לגישה מבוססת ליפופקציה, שיטת מיקרופורציה זו משפרת את הטרנספקציה, כפי שמוערך על ידי מידת ההשתקה של גנים ספציפיים.

מחקרי מקדם וביטוי גנים מספקים גם הבנה טובה יותר של תפקוד השליה. למרות שקשה יותר לשימוש בשל מסגרת הזמן הקצרה שבה ניתן לתרבת ציטוטרופובלסטים ראשוניים, ניתן בכל זאת לטפל בניתוחי מקדמים באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים, כפי שפורסם בעבר 7. בדיקת משמרת ניידות אלקטרופורטית (EMSA) היא אחת משיטות המבחנה הנפוצות הללו, המאפשרת ניטור מהיר וקל של אינטראקציות DNA-חלבון. תמציות גרעיניות מהטרופובלסטים הראשוניים הללו שימשו לבדיקת אזור של מקדם Syncytin-2 לאינטראקציות ספציפיות. התוצאות חשפו כי ניתן לזהות גורמים קשורים בנקודות זמן שונות של תרבית ובאופן ספציפי וניתן לשחזור.

הנתונים המוצגים בפרוטוקול זה מאשרים כי ניתן להשתמש בגישת הטרנספקציה שלנו ובפרוטוקול EMSA עבור ציטוטרופובלסטים ראשוניים מבודדים ויהיו שימושיים מאוד לחקר הפונקציות המגוונות של ציטוטרופובלסטים וילוסיים בתנאים רגילים או פתולוגיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ועדת האתיקה UQAM אישרה הפרוטוקולים הללו, אשר נמצאים בהתאם להנחיות של ועדת האתיקה של סנט-לוק החולים של מונטריאול Universitaire Hospitalier מרכז (מונטריאול, קנדה). המשתתפים חתמו על טופס הסכמה מדעת.

הכנת בינוני 1. ובידוד של ראשי Villous Cytotrophoblasts

  1. הכן בינוני תרבות עבור cytotrophoblasts villous העיקרי האדם על ידי משלים בינוני של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) עם 25 HEPES מ"מ, 10% בסרום שור עוברית (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין. מסנן המדיום מוכן באמצעות 0.22 מיקרומטר מסנן ולאחסן סטריליים -20 ° C במקפיא aliquots של 50 מ"ל.
  2. לבודד cytotrophoblasts villous ראשית ממנהל השליות טריות הבאים פרוטוקולים סטנדרטיים 3.
    1. באמצעות צבת, להסיר את הקרום העובר מן הרקמה על ידי בעדינות לגרד אותו, תוך הקפדה שלא להסיר רקמות villous. תפסיק עם ההנותרים villi השליה בקוביות של כ -3 × 3 ס"מ באמצעות אזמל ומספריים. ביסודיות לשטוף עם מים המכילים 0.9% NaCl כדי להסיר דם אימהי.
      1. החזקת כל קוביה עם צבת, להסיר את הרקמה villous בקפידה מתוך כלי הנותרים ומספריים באמצעות רקמה סיבית.
      2. במשך 15 עד 30 מ"ג של רקמות villous, לעכל ארבע פעמים תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) טריפסין המכיל (מ -9.6 x 10 5 כדי 1.8 x 10 6 U; הריכוז הסופי 1.2 מ"ג / מ"ל) ו deoxyribonuclease אני (DNase אני) ( הריכוז הסופי 200 מיקרוגרם / מ"ל) במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים עם רעד מתמשך.
        הערה: השתמש 150 מ"ל בנפח כולל לעיכול הראשון, 100 מ"ל לעיכול השני ו -75 מ"ל לשני digestions הנותרים.
    2. אסוף את supernatant המכיל תאים מפוזרים צנטריפוגות ב 1,250 XG במשך 15 דקות ללא בלם. הסר את supernatant התאים resuspend ב 1 מ"ל של prewarmed DMEM המכיל1% פניצילין / סטרפטומיצין.
    3. שכבת התאים המפוזרים על גבי 5% רציף - שיפוע סיליקה 70% polyvinylpyrrolidone מצופה (ראה לוח 1 עבור הכנת שיפוע) ו צנטריפוגות במשך 23 דקות ב 507 XG ללא בלם. הסר את שכבת הצפיפות בין 1,017 כדי 1,033 על ידי שאיפה לאסוף את השכבות בין 40% ו -50% השיפוע עם טפטפת חדשה. שטפו תאים נרחב עם 10 מ"ל של prewarmed DMEM המכיל 1% פניצילין / סטרפטומיצין.
      הערה: החלק שנאסף תואם צפיפויות בין 1.048 ו 1.062, אשר מטפחים trophoblasts.
    4. ספירת התאים באמצעות hemocytometer. בקצרה, לערבב תאים ולהוסיף 10 μl בצינור microcentrifuge חדש. הוסף 10 μl של trypan כחול ומערבבים בעדינות שוב. צייר את ההשעיה התא למלא את תאי hemocytometer. ספירת התאים תחת מטרת 10X.
    5. מקום 1 x 10 6 ו -4.5 x 10 6 תאים לתוך צינורות נפרדים לשימוש בסעיפים 1.3 ו -2, בהתאמהly. זרעי התאים הנותרים בצפיפות של 1.5 x 10 6 תאים / גם במדיום DMEM בתוספת ותרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לכל היותר 4 ימים של ניסויים אחרים.
  3. הערכה הטוהרת cytotrophoblasts villous העיקרי המבודד
    1. ספין 1 x 10 6 של cytotrophoblasts טרי מבודדים צינורות microcentrifuge ב g 300 x. בטל supernatant ולהוסיף 1 מ"ל של בופר פוספט prewarmed (PBS). תאים צנטריפוגה XG ב 300 ולהסיר PBS על ידי שאיפה.
    2. הוסף 1 מ"ל של מתנול קר לתאים דגירה ב -20 ° C במשך 20 דקות. צנטריפוגה התאים ב XG 300 במשך 5 דקות ולהסיר מתנול על ידי שאיפה.
      זהירות: השתמש מסכה מיכל, משקפי בטיחות וכפפות גומי בעת הטיפול מתנול.
    3. הוסף 1 מ"ל של PBS בטמפרטורת החדר רעננותם תאים, צנטריפוגה XG ב 300 ולהסיר PBS על ידי שאיפה.
    4. דגירת תאי PBS המכילים FBS (1:50 [v / v] דילול) וכן FCRחסימת מגיב (1:10) במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר כדי לחסל מחייב ספציפי.
    5. שטפו פעמיים עם 500 μl של PBS בטמפרטורת החדר, תאים צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות ולהסיר PBS על ידי שאיפה. תאים Resuspend ב 100 PBS μl בטמפרטורת החדר.
    6. דגירה תאים עם isothiocyanate והעמסת חד שבטיים העכבר (FITC) מצומדות אנטי אנושי cytokeratin-7 נוגדן שיבוט LP5K (1: 200) או נוגדן הלא ספציפית אלוטיפ בהתאמה PBS המכיל BSA 0.2% במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר ב החושך. שטפו תאים PBS.
    7. לנתח את התאים על ידי זרימת cytometry 3. השתמש הכנות תא, מה שמראה על מינימום של 96% תאי CK-7-חיוביים על ידי cytometry זרימה עבור ניסויים נוספים.

2. Transfection siRNA של Cytotrophoblasts Villous הראשוני האדם

  1. Transfection של cytotrophoblasts villous העיקרי אנושי באמצעות מכשיר microporation
    1. כן 6 צלחות היטב המכילות2 מ"ל של מדיום בתוספת DMEM עבור הדגירה של תאים microporated.
    2. לאחר בידוד של cytotrophoblasts העיקרי (ראה סעיף 1.2), לקחת aliquot של התאים בתרחיף ולקבוע מספר הסלולרי באמצעות hemocytometer.
    3. העבר 1.5 x 10 6 התאים לצינור microcentrifuge ותאי גלולה על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. שוטפים את התאים עם 1 מ"ל PBS של Dulbecco (DPBS) (Mg 2+, Ca 2 + ללא) ו גלולה התאים על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. הסר את supernatant ו resuspend התאים בעדינות 100 μl של חיץ resuspension.
      הערה: אל תשאיר את התא ההשעיה למשך יותר מ 15-30 דקות בטמפרטורת החדר, על מנת למקסם את כדאיות התא ויעילות transfection.
    5. להוסיף 300 ננוגרם של Syncytin-2 siRNA (או-מקושקשות שליטה siRNA) אל צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge ו לשאוב את התערובת תא-siRNA בעזרת פיפטה transfection 100 μl. לְהַכנִיספיפטה לתוך התחנה (ראה רשימה של חומרים) ובכפוף לתאים הדופק יחיד 1,300 V של 30 מילי-שניות.
    6. מיד להעביר את התאים 6 צלחות היטב (מוכן בשלב 2.1.1) המכיל 37 ° C טרום חימם בינוני בתוספת להימנע נזק לתאים.
    7. חזור על שלבי 2.1.5 ו 2.1.6 עבור הדגימות הנותרות.
    8. נער בעדינות את הצלחת למשך 30 שניות כדי להבטיח חלוקה שווה של התאים. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור humidified במשך 24 עד 48 שעות. רענן בינוני תרבות 24 שעות לאחר transfection.
    9. הערכה יעילה transfection על ידי ניתוח כתם מערבי (ראה צעדים 3 עד 6).
  2. Lipofection של siRNA ב cytotrophoblasts העיקרי האדם
    1. לאחר בידוד של cytotrophoblasts villous, זרע התאים בצפיפות של 1.5 x 10 6 תאים לכל היטב צלחות 6-היטב 2 מ"ל של מדיום תרבות דגירה במשך 18 שעות.
    2. לדלל 300 ng של Syncytin-2-הספציפי siRNA (או החזק את המקש מקושקשsiRNA) ו -5 μl של מגיב transfection השומנים מבוסס ב 1.5 מ"ל צינורות נפרדים בנפח כולל של 10 μl של המדיום antibiotic- ואת סרום ללא. דגירה במשך 5 דקות.
    3. מערבבים את ריאגנטים בדילול דגירה במשך 20 דקות נוספות בטמפרטורת החדר כדי ליצור את מורכבות transfection. להוסיף 90 μl של המדיום antibiotic- ואת סרום ללא לתערובת כדי לנפח סופי של 100 μl.
    4. הסר בינוני תרבות מן 6 צלחות היטב (שלב 2.2.1). הוסף 2 מ"ל של מדיום חדש ותמהיל transfection 100 μl היטב כל אחד. דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור במשך 24 עד 48 שעות. רענן בינוני תרבות 24 שעות לאחר transfection.
    5. הערכה יעילה transfection על ידי ניתוח כתם מערבי (ראה צעדים 3 עד 6).

3. הכנת Lysates מן התרבות התא כולו

  1. הסר את המדיה ולשטוף היטב כל (בצעדיו 2.1.8 ו 2.2.4) באמצעות DPBS מחומם מראש (Mg 2+, Ca 2 + חינם). לשאוב את DPBS ולהוסיף 500 μl של חומצה טריפסין 0.25% / ethylenediaminetetraacetic (EDTA). דגירה של 1-3 דק 'ב 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור. להפסיק את הטיפול טריפסין על ידי הוספת 500 μl של תקשורת צמיחה המכיל סרום.
    הערה: נפח המדיה המתאימה השתמש בהתאם לסוג של הבקבוק / תבשיל: 1 מ"ל לכל 10 7 תאים / 100 מ"מ צלחת / 150 ס"מ 2 בקבוק; 0.5 מ"ל לכל 5 x 10 6 תאים / 60 מ"מ צלחת / 75 ס"מ 2 בקבוק.
  2. העברת תאי צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge, תאים גלולים על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 2 דקות בטמפרטורת חדר. שוטפים את התאים עם DPBS (Mg 2+, Ca 2 + ללא) ותאי גלולה על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. מוציאים בזהירות supernatant מבלי להפריע גלולה. מניחים את הצינור על הקרח. Resuspend גלולה ב 50-200 חיץ μl קר כקרח רדיו-Immunoprecipitation Assay (Ripa) (ראו טבלה 2 עבור הרכב חיץ) המכיל טרי להוסיףפרוטאז ed ומעכבי phosphatase בריכוז סופי 1x. בקצרה, מערבולת הצינור ולהשאיר על קרח למשך 30 דקות.
  4. ספין על XG 16,000 במשך 20 דקות ב 4 ° C. בזהירות במקום צינור על הקרח. בעזרת פיפטה, להעביר את supernatant לצינור microcentrifuge מראש מקורר טרי כל זמן על קרח. וזורק את הכדור.

4. הכנת תמציות גרעיני תאים בתרבית

  1. עבור כל טוב (שלב 1.2.5), לשטוף cytotrophoblasts תרבותי פעמיים עם 1 מ"ל של טרום חימם DPBS (Mg 2+, Ca 2 + חינם). לשאוב DPBS ולהוסיף 500 μl של 0.25% טריפסין / EDTA. דגירה של 1-3 דק 'ב 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור ולהפסיק טיפול טריפסין על ידי הוספת 500 μl של תקשורת צמיחה המכיל סרום.
  2. העברת תאי צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge, תאים גלולים על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 2 דקות בטמפרטורת חדר. שוטפים את התאים עם DPBS (Mg 2+, Ca 2 + ללא) ותאי גלולה על ידי צנטריפוגהב XG 300 במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. מוציא בזהירות את כל supernatant מבלי לשבש את הגלולה במקום הצינור על קרח.
  3. חלץ חלבון גרעיני פי הוראות היצרן. קביעת ריכוז חלבון של כל דגימה באמצעות assay כימות חלבון (ברדפורד או assay חומצה bicinchoninic (BCA)).

לדוגמא 5. הכנה אלקטרופורזה

  1. קביעת ריכוז חלבון לכל תמצית התא באמצעות assay כימות חלבון (למשל, ברדפורד 8 או BCA 9).
  2. על פי הוראות יצרן (אם נוגדנים יוכל לשמש בתנאי צמצום denaturation), להוסיף נפח שווה של חיץ מדגם 2x Laemmli (טבלה 2) 20-30 מיקרוגרם של חלבון כולל.
  3. מרתיחים lysates התא ב 100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. Aliquot 50-100 μl של lysate להימנע מחזורי הקפאה / פשרה חזרו ולאחסן את הצינורות הנותרים ב -20 ° C לשימוש עתידי.
  4. בעוד דגימות חימום, להכין 1 ליטר של 1x הפעלת המאגר (טבלה 2).
  5. ספין הדגימות ב XG 16,000 במשך כמה שניות ומניחים אותם על קרח.
  6. טען כמות החלבון שווה לבאר כל ג'ל 12% SDS-PAGE (ראה טבלה 2 עבור רכב ג'ל), יחד עם סמן משקל מולקולרי. הרץ את הג'ל על 1 עד 2 שעות ב -100 V.

6. העברת חלבון מן הג'ל אל ממברנה

  1. הפעל פלואוריד polyvinylidene (PVDF) קרום עם מתנול 1 דקות ולשטוף עם פתרון מתנול חיץ העברת 1x / 10%. על פי הוראות היצרן, להעביר למשך 30 דקות עד 1 שעה תלוי בגודל החלבון.
    הערה: יעילות העברה ניתן להעריך באמצעות מכתים Ponceau האדום לפני צעד החסימה.

7. נוגדן מכתים

  1. חסום את הממברנה עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C באמצעות פתרון חסימת 5%.
  2. דגירה הממברנה עם נוגדנים נגד Syncytin-2 (4 מיקרוגרם / מ"ל; 1: 5,000) 6 או עם אנטי glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH; 0.4 מיקרוגרם / מ"ל; 1: 500) בתמיסה חסימת 5% לילה בשעה 4 ° C (אנטי-Syncytin-2) או במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים שנאגרו מלוח טריס Tween (TBST; ראה טבלה 2 עבור רכב חיץ) במשך 5 דקות.
  3. דגירה הממברנה עם peroxidase חזרת המתאים (HRP), מצומדות ארנבת אנטי או נוגדן אנטי עכבר (1: 10,000) ב 5% חיץ חסימת TBST בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים TBST במשך 5 דקות ולאחר מכן לשטוף ב TBS. לזהות אותות באמצעות המצע הסופג מבוסס chemiluminescence.

8. Radiolabeling של גדילי יחיד oligonucleotide

  1. תגובת זירחון
    1. בתוך צינור microcentrifuge, להוסיף 50 ng של oligonucleotide קדימה יחד עם חיץ קינאז polynucleotide T4 1x, 1 UPolynucleotide T4 קינאז ו -20 μCi (γ- 32 P) ATP ולעשות את הווליום תגובה 20 μl עם מים nuclease חינם.
    2. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. עצור את התגובה על ידי הוספת 5 μl של 0.5 מ 'EDTA. הפוך את הווליום עד 50 μl עם מים nuclease חינם.
  2. הסרת נוקלאוטידים מאוגדים מ oligonucleotides
    1. הכן עמודה G-25 equilibrated עם חיץ TE (טבלה 2) הבאים הוראות היצרן. מניחים את הטור ב צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge DNase ללא טריים.
    2. לאט לאט להוסיף 50 μl של חללית (משלב 8.1.2) על השרף, נזהר שלא להפריע מיטת השרף. ספין עבור 2 דקות ב 350 XG כדי לאסוף את דגימת מטוהרים בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. לשטוף את העמודה G-25 עם 36 μl של מים ספין nuclease ללא במשך 2 דקות ב 350 XG כדי לאסוף אותו בצינור microcentrifuge.
  3. הכלאה עם ol גדיל משליםigonucleotide
    1. מעבירים את החללית רדיואקטיבי (86 μl) לצינור 1.5 מ"ל microcentrifuge ולהוסיף 200 ננוגרם של oligonucleotide הפוכה 1x של חיץ חישול (טבלה 2). מחממים 5 דקות ב 95 ° C ולהשאיר למשך הלילה בטמפרטורת החדר לקירור.
    2. הכן שאינם רדיואקטיביים oligonucleotides פעמיים תקועים על ידי הוספת 50 ננוגרם של תווית קדימה הפוכה oligonucleotides ו 1x של חיץ חישול צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge. הפוך את עוצמת הקול עד 100 μl עם מים nuclease חינם. חום ולשמור בטמפרטורת החדר כמתואר בשלב 8.3.1.

הכנת 9. של ג'ל ללא denaturing polyacrylamide עבור Emsa

  1. כן ג'ל 4% ילידים (10 x 12 סנטימטרים) עם מסרק-שטח 1.5 מ"מ (ראה טבלה 2 עבור רכב ג'ל). יש לנקות את כל לוחות הזכוכית באמצעות מים מזוקקים.
    הערה: זה קריטי, כי הצלחות להיות חופשיות לחלוטין של חומר ניקוי יוני, כמו SDS.
  2. מיד pהפתרון שלנו acrylamide ב בין הצלחות ולאפשר פילמור כדי להמשיך (כ -30 דקות).
  3. להרכיב את מנגנון אלקטרופורזה ולמלא את המיכל עם TBE 0.5x. טרום להפעיל את הג'ל למשך 30 דקות עד 1 שעה ב 150 V לפני הטעינה המדגם.

תגובת 10. DNA Binding

  1. בתוך צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge, להוסיף 10 מיקרוגרם של תמצית גרעיני (שלב 4.3) במאגר עקידת Shift 1x ג'ל (טבלה 2) ולעשות את הווליום הסופי עד 10 μl עם מים nuclease חינם. כביקורת, להכין צינור ללא תמצית גרעינית. עבור תגובת התחרות, להוסיף 1 μl של oligonucleotide שאינו ספציפי או ספציפי פעמים התקועות הקר (שלב 8.3.2).
  2. הוסף 1 μl של החללית רדיואקטיבי משלב 8.3.1 לתגובה כל. דגירה התגובה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. הוסף 1 μl של חיץ טעינת ג'ל 10x לכל תגובה ולטעון כל דגימה על הג'ל מוכן בסעיף 9.
  3. הרץ את הג'ל על 1 1/2 עד שעה 2 ב 15לאחר ההגירה 0 V., לעטוף את הג'ל ואת הכוס על בניילון עמדה קלטת חשיפה להלן פוספור מסך. השאר קלטת ב 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
  4. הסר את המסך מתוך הקלטת החשיפה וכנס במכשיר ההדמיה זרחן לסריקה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

השליות טריות מן הריונות טווח שמשו לבודד cytotrophoblasts villous העיקרי אדם לנהל את מערך הניסויים שהוצגו באזור הפרוטוקול. בעקבות הבידוד שלהם, אנחנו ראשונים נתחו את טוהר cytotrophoblasts באמצעות השימוש בסמן cytokeratin-7 (איור 1). הכנות תא ובכך הוכתמו באמצעות נוגדן אנטי cytokeratin-7 חד שבטי. איור 1 מייצג תוצאות מניסוי טיפוסי הבא טיהור cytotrophoblasts villous העיקרי, ונותח על ידי זרימת תקן cytometry. בעקבות צעד שיפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקרים על תפקוד השליה אנוש ופיתוח שופרו במידה רבה על ידי פרוטוקולים שמטרתן ייעול בידוד של אוכלוסיות תאי השליה שונות. אחת של אוכלוסיית תא שליה מיטב למד נשאר cytotrophoblasts villous, החקר אשר תועלת רבה פרוטוקולי אופטימיזציה המתירים בידוד יעיל ואמין. זו אפשרה עוד מספר ניסויים, כגון מחקרים transfection ומקדם. באמצעות פרוטוקול שתואר לעיל 3, אוכלוסיות טהורות של cytotrophoblasts villous העיקרי ניתן להשיג. CK-7 הוא חלבון סיבי ביניים, המתבטאת cytotrophoblasts. נוגדנים חד-שבטיים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם הלאומית למדעים והנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC) (# 298,527) (BB). CT נתמכה על ידי מלגת FARE מוסדית. AV נתמכה על ידי דוקטור NSERC גרהם בל מילגה. BB קיימה הקתדרה למחקר בקנדה ב Retrovirology האדם (Tier 2). הודות ביאטריקס Beisner לעזרה בתיקון הטקסט.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
HBSS ללא  Ca2+, Mg2+ סיגמא#H2387
HBSS (10x)סיגמא#14060-057
DMEM גלוקוז גבוה ללא הפסגיבקו#12100-061
הפס (1 מ')גיבקו#15630-080
פניצילין-סטרפטומיצין-נאומיצין (100x)גיבקו#15640-055
אמפוטריצין B Sigma#A2411
CaCl2Sigma#C4901
MgSO4.7H2O סיגמא#M
סרום בקר עובריGibco#16170-078 
פרקול Sigma#P-1644עבור שיפוע צפיפות
Syncytin-2 siRNAAmbion Life טכנולוגיות#AM16708
sRNAQiagen# מקושקש SI03650318
DNase ISigma-Aldrich#D5025
טריפסין, סוג I סיגמא#T8003
DharmaFECT Lipotransfection  ריאגנטים GEhealthcare# T-2001-01
טריפסין/EDTAטכנולוגיות חיים#25300-062
קוקטייל מעכב פרוטאזרוש אבחון#11873580001
ערכת בדיקת חלבון BCA פירסתרמו מדעי#23225
BSAסיגמא#A7906
TWEEN 20סיגמא#P9416 
IgG נגד ארנב, נוגדן מקושר ל-HRP איתות תאים#7074
BM מצע כתמים מערבי כימילומינסנציה (POD)אבחון רוש11500708001
DPBS טכנולוגיות חיים#14287-080
T4 פולינוקלאוטיד קינאזNEB#M0201S
ATP, [γ-32P]פרקין אלמר#BLU002A100UC
אקרילמידסיגמא 
TEMEDLife טכנולוגיות#17919
אמוניום פרסולפטסיגמא 
שיבוט נוגדנים אנטי אנושי ציטוקרטין-7 LP5K, FITC מצומדMilliporeCBL194Fדילול 1:200
מגיב חוסם FCR Miltenyi Biotec130- 059-901דילול 1:10
ציטומטר זרימה BD Acuri מערכתBecton Dickinson
Microporator MP-100 מכשיר השעיה ביולוגית
דיגיטלית R (מערכת טרנספקציה ניאון 100  ומיקרו; l ערכה)טכנולוגיות חייםMPK10096
ממברנת PVDF MilliporeIPVH00010 הפעלה עם מתנול
נוגדן GAPDH אנטי אנושיסנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-1371791:500
HorseRadish Peroxidase (HRP) - נוגדן נגד ארנב עז מצומד או נוגדן נגד עכבראיתות תאים#70741:10,000
HorseRadish Peroxidase (HRP) - נוגדן נגד עכבר עז מצומדאיתות תאים#7076 1:10,000
NE-PER מגיב מיצוי גרעיני וציטופלזמיThermo Scientific#78833
G-25 column GE Healthcare#27-5325-01
מכשיר הדמיה כימילומינסנציה ופלואורסצנטיMontré al BiotechFusion FX5
4% ג'ל מקוריתוצרת
PBSתוצרת1x
מערכת הדמיה מולקולרית אישית (PMI)BioRad
##A9099#A3678מאגר בית בית

מקורות

  1. Huppertz, B. Placental origins of preeclampsia: challenging the current hypothesis. Hypertension. 51, 970-975 (2008).
  2. Huppertz, B. IFPA Award in Placentology Lecture: Biology of the placental syncytiotrophoblast--myths and facts. Placenta. 31, Suppl . S75-S81 (2010).
  3. Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).
  4. Morrish, D. W., et al. In vitro cultured human term cytotrophoblast: a model for normal primary epithelial cells demonstrating a spontaneous differentiation programme that requires EGF for extensive development of syncytium. Placenta. 18, 577-585 (1997).
  5. Forbes, K., Desforges, M., Garside, R., Aplin, J. D., Westwood, M. Methods for siRNA-mediated reduction of mRNA and protein expression in human placental explants, isolated primary cells and cell lines. Placenta. 30, 124-129 (2009).
  6. Vargas, A., et al. Syncytin-2 plays an important role in the fusion of human trophoblast cells. J. Mol. Biol. 392, 301-318 (2009).
  7. Toufaily, C., Lokossou, A. G., Vargas, A., Rassart, E., Barbeau, B. A CRE/AP-1-Like Motif Is Essential for Induced Syncytin-2 Expression and Fusion in Human Trophoblast-Like Model. PLoS One. 10, e0121468(2015).
  8. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  9. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
  10. Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21, 733-741 (2000).
  11. Desforges, M., et al. The SNAT4 isoform of the system A amino acid transporter is functional in human placental microvillous plasma membrane. J. Physiol. 587, 61-72 (2009).
  12. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 7413-7417 (1987).
  13. Guilbert, L. J., et al. Preparation and functional characterization of villous cytotrophoblasts free of syncytial fragments. Placenta. 23, 175-183 (2002).
  14. Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
  15. Ma, B., Zhang, S., Jiang, H., Zhao, B., Lv, H. Lipoplex morphologies and their influences on transfection efficiency in gene delivery. J. Control. Release. 123, 184-194 (2007).
  16. Freeley, M., Long, A. Advances in siRNA delivery to T-cells: potential clinical applications for inflammatory disease, cancer and infection. Biochem. J. 455, 133-147 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

טכניקת מיקרופורציהאנליזת EMSAציטומטריה של זרימהWestern BlotSyncytin-2 siRNAאינטראקציה בין חלבון ל-DNAבידוד תאים ראשונייםחיוניות תאים
ניתוח Transfection siRNA ו Emsa על Cytotrophoblasts Villous אדם המבודד טרי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.