ססגוניות קרינת איתור עבור מיקרופלואידיקה אגל באמצעות סיבים אופטיים

Summary

זיהוי פלואורסצנטי רב צבעוני במיקרופלואידיקה טיפתית כולל בדרך כלל מערכות גילוי מבוססות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי מגושמות ומורכבות. כאן אנו מתארים ערכת זיהוי רב-צבעונית קומפקטית ומודולרית המשתמשת במערך של סיבים אופטיים כדי לקודד זמנית נתונים רב-צבעוניים שנאספו על ידי גלאי פוטו יחיד.

Abstract

בדיקות פלואורסצנטיות הן הקריאות הנפוצות ביותר המשמשות במיקרופלואידיקה טיפתית בשל האותות הבהירים ותגובת הזמן המהירה שלהן. יישומים כגון מבחני מולטיפלקס, אבולוציה של אנזימים ומיון תאים משופר של ביולוגיה מולקולרית דורשים זיהוי של שני צבעים או יותר של פלואורסצנטיות. מערכות זיהוי צבעוניות סטנדרטיות המצמדות לייזרים בחלל פנוי למיקרוסקופים אפיפלואורסצנטיים הן מגושמות, יקרות וקשות לתחזוקה. במאמר זה, אנו מתארים סכימה לביצוע זיהוי רב-צבעוני על ידי אזורים בדידים מרגשים של תעלה מיקרופלואידית עם לייזרים המחוברים לסיבים אופטיים. האור הנפלט נאסף על ידי סיב אופטי המחובר לגלאי פוטו יחיד. מכיוון שהעירור מתרחש במיקומים מרחביים שונים, ניתן לקודד את זהות האור הנפלט כשינוי זמני, מה שמבטל את הצורך בתוכניות סינון אור מסובכות יותר. המערכת שימשה לאיתור אוכלוסיות טיפות המכילות ארבעה שילובים ייחודיים של צבעים ולזיהוי ריכוזים תת-ננו-מולאריים של פלואורסצאין.

Introduction

מיקרופלואידיקה אגל לתת במה ביולוגית קצב העברת נתונים גבוהה על ידי מידור ניסויים במספר רב של טיפות מימיות מרחפים מוביל שמן ^1. טיפות שימשו עבור יישומים שונים כמו תא בודד ניתוח ^2, תגובת שרשרת פולימראז דיגיטלי (PCR) ^3, ואת האנזים האבולוציה ^4. מבחני פלורסנט הם במצב הרגיל של גילוי מיקרופלואידיקה רביב, כאותות הבהירים שלהם ועל זמן תגובה מהירה תואמים גילוי כרכי אגל משנה nanoliter בשיעורי kilohertz. יישומים רבים דורשים גילוי קרינה עבור זמנית בשני צבעים לפחות. למשל, במעבדה שלנו בדרך כלל מבצעת PCR המופעל ניסויי מיון אגל המשתמשים ערוץ זיהוי אחד על התוצאה של assay, ומשתמשת לצבוע רקע משני לעשות אגל assay שלילי ⁵ ספיר.

תחנות גילוי אופיינית עבור מיקרופלואידיקה אגל הם based על מיקרוסקופים epifluorescence, ודורשים מסובך תוכניות מניפולציות אור להציג אור עירור לייזרים מקום פנוי לתוך מיקרוסקופ להיות ממוקד על המדגם. לאחר הקרינה נפלטת מן אגל, האור לא זרח הנפלטים מסונן כך שכל ערוץ זיהוי מנצל צינור מכפיל אחד (PMT) התרכז להקה גל. מערכות epifluorescence זיהוי אופטי מבוסס מיקרוסקופ לספק חסם הכניסה בשל ההוצאה, מורכבותם, ונזקקו תחזוקה. סיבים אופטיים לספק את האמצעים לבנות ערכת זיהוי פשוטה וחזקה, מאז סיביים יכול להיות מוכנסים באופן ידני לתוך מכשירי microfluidic, יבטל את צורך ניתוב מבוסס אור במראה, ומאפשר נתיבי אור להתממשק באמצעות מחברי סיב אופטיים.

במאמר זה נתאר את ההרכבה והבדיקה של ערכה קומפקטית ומודולרי לבצע גילוי קרינה ססגוני ידי ניצול מערך של סיבים אופטייםדה היחיד photodetector ^6. סיבים אופטיים הם מצמידים את לייזרי פרט המוכנסים נורמלים ערוץ זרימה בצורת L ב קיזוז מרחבית רגיל. סיב אוסף קרינה מכוון במקביל באזורי העירור מחובר PMT יחיד. בגלל אגל עובר דרך קרן הליזר בזמנים שונים, נתונים שרשמו PMT מראים זמני לקזז המאפשר למשתמש להבחין בין הקרינה הנפלטת לאחר האגל שמתלהב כל קרן ליזר ברורה. משמרת זמנית זו מבטלת את הצורך להפריד אור נפלט אל PMTs הנפרד באמצעות סדרה של מראות dichroic ומסנן bandpass. כדי לאמת את היעילות של הגלאי, אנו לכמת קרינה באוכלוסיות אגל encapsulating צבעים של צבע ריכוז שונה. הרגישות של המערכת הוא נחקר לגילוי והעמסת צבע אחד, ומראה את היכולת לזהות טיפות עם ריכוזים עד 0.1 ננומטר, הופעות רגישות 200xovement לעומת גישות סיבים מבוסס האחרונות מהמדווח בספרות ^7.

Protocol

1. ייצור מאסטר SU8

1. עיצוב מבני microfluidic עבור ייצור שכבה שלוש באמצעות תוכנת עיצוב יש את העיצובים מודפס על ידי ספק על סרט המעגלים עם 10 מיקרומטר ברזולוציה. הפרטים של עיצוב מכשיר ניתן הפניה מצורפת ⁶ ואת גיאומטריות הערוץ מוצגות באיור 1. השכבות צריכות לכלול סימני יישור כדי לעזור במתחמים בין תכונות שכבת ייצור ^8.
2. מניחים פרוסות סיליקון בקוטר מראש לנקות 3 אינץ 'על coater ספין ולהדליק את אבק כדי להדביק אותה על צ'אק. החל 1 מ"ל של SU8-3050 במרכז רקיק ועל ספין במשך 20 שניות ב 500 סל"ד, אז 30 שניות 1,750 סל"ד, מתן עובי שכבה של 80 מיקרומטר.
3. הסר את רקיק ואופים על פלטה חמה C 135 מעלות במשך 30 דקות. אפשר רקיק להתקרר RT לפני המעבר לשלב הבא.
4. לחשוף את הפרוסות המצופות אל מסיכת שכבת 1 ^st תחת מטר collimated 190W, 365 ננומטר LED במשך 3 דקות. לאחר החשיפה, מניחים את פרוסות על פלטה חמה C 135 מעלות במשך 1 דקות, אז מגניב RT לפני שתמשיך לשלב הבא.
5. מניחים את פרוסות על coater ספין ולהדליק את אבק כדי להדביק אותה על צ'אק. החל 1 מיליליטר של SU8-3050 במרכז הרקיק ועל הספין במשך 20 שניות ב 500 סל"ד, אז 30 שניות ב 5000 סל"ד, וכתוצאה מכך שכבה המספקת עובי נוסף של 40 מיקרומטר.
6. הסר את רקיק ואופים על פלטה חמה C 135 מעלות במשך 30 דקות, ולאחר מכן מגניב RT לפני המעבר לשלב הבא.
7. יישר את מסיכת שכבה 2 ^nd על הגיאומטריה בדוגמת 1.3 ולחשוף את רקיק מצופה על 190 mW collimated, 365 ננומטר LED במשך 3 דקות. לאחר החשיפה, מניחים על פלטה חשמלית C 135 מעלות במשך 4 דקות 30 שניות, אז מגניב RT לפני שתמשיך לשלב הבא.
8. מניחים את פרוסות על coater ספין ולהדליק את אבק כדי להדביק אותה על צ'אק. החל 1 מ"ל של SU8-3050 במרכז רקיק ועל ספין במשך 20 שניות ב 500 סל"ד, אז 30שניות ב 1000 סל"ד, וכתוצאה מכך שכבה המספקת עובי נוסף של 100 מיקרומטר.
9. הסר את רקיק ואופים על פלטה חמה C 135 מעלות במשך 30 דקות, ולאחר מכן מגניב RT לפני המעבר לשלב הבא.
10. יישר את מסיכת שכבה 3 ^rd על הגיאומטריה בדוגמת 1.3 ולחשוף את רקיק מצופה על 190 mW collimated, 365 ננומטר LED במשך 3 דקות. לאחר החשיפה, מניחים על פלטה חשמלית C 135 מעלות במשך 9 דקות, אז מגניב RT לפני שתמשיך לשלב הבא.
11. לפתח את המסכות ידי טבילה באמבט בחש של אצטט אתר monomethyl פרופילן גליקול למשך 30 דקות. שטפו את רקיק ב isopropanol ואופים על פלטה חמה C 135 מעלות במשך 1 דקות. מניחים את המאסטר שפותחה בצלחת פטרי 100 מ"מ עבור polydimethylsiloxane דפוס (PDMS).

2. PDMS ייצור המכשיר

1. הכן 10: 1 PDMS על ידי שילוב של 50 גרם בסיס סיליקון עם 5 גרם של סוכן ריפוי בתוך כוס פלסטיק. מערבבים את התוכן עם כלי רוטרי מצויד במקל ומערבבים. מעלותכמו התערובת בתוך תא ייבוש למשך 30 דקות, או עד שכל בועות האוויר יוסרו.
2. יוצקים את PDMS לתת עובי של 3 מ"מ כלפי מאמן ומקום בחזרה לתוך תא ייבוש עבור degassing נוספת. לאחר כל הבועות מוסרות, לאפות את המכשיר ב -80 מעלות צלזיוס במשך 80 דקות.
3. חותכים את המכשיר מהתבנית באמצעות אזמל ומניחים על משטח נקי עם הצד בדוגמת מעלה אגרוף פתחי הכניסה fluidic שקעים עם ביופסיה 0.75 מ"מ. המכשיר חייב להיות לחתוך כך 120 מיקרומטר ו -220 מיקרומטר הגיאומטריות גבוהות נגישות מהצד של המכשיר.
4. פלזמה לטפל במכשיר, עם צד תכונה כלפי מעלה, יחד עם טרום ניקה 2 אינץ 'על זכוכית שקופית 3 אינץ' ב 1 mbar O ₂ פלזמה למשך 20 שניות בתוך שואב פלזמה 300 W. איגרות החוב המכשיר PDMS ידי הצבת בצד בדוגמת של המכשיר PDMS על הצד שטופלו פלזמה של שקופיות הזכוכית. מניח את המכשיר בתנור C 80 ° ואופי המכשיר התאסף במשך 40 דקות.
5. לדקלם הערוציםהידרופובי באמצעות מזרק כדי לשטוף את המכשיר עם נוזל טיפול פני פלואור. מיד לאפות את המכשיר ב -80 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות להתאדות ממס.

3. הכנת הרכיבים האופטיים

1. הכן את סיבי עירור הליזר ידי הסרת הבידוד בין 5 המ"מ האחרון של חיפוי 105 מיקרומטר ליבה, 125 מיקרומטר, NA = 0.22 סיבים אופטיים.
2. הכן את סיבי עירור ליזר צבע 2 ^nd על ידי חזרה על 3.1 עבור סיב 2 ^nd זהה.
3. הכן את הסיב לאיסוף אותות הקרינה על ידי חזרה על 3.1 עבור חיפוי 200 מיקרומטר ליבה, 225 מיקרומטר, NA = 0.39 סיבים אופטיים.
4. בדוק את קצות כל הסיבים - אם את הטיפים אינם מסתיימים משטח שטוח, מחדש לבקע את הקצוות עם סופר סת"ם סיבים.
5. צרף מצמד סיבים לייזר לייזר 50 mW, 405 ננומטר ולצרף אחד הסיבים הליבה 105 מיקרומטר הלייזר. כוון את הסוף הפשיט לחיישן של כוח הליזרמטר, ולהשתמש התאמות קנס של מצמד לייזר על מנת למקסם את כוח לייזר.
6. חזור על 3.5 עבור לייזר ננומטר 50 mW, 473.
7. הר 446/510/581/703 מסננים bandpass quad ננומטר על PMT באמצעות צינורות העדשה כדי לחסום אור לייזר ולהעביר הקרינה הנפלטת. צרף מצמד סיבים כך שהאור עובר דרך מסננים לפני שפגע PMT.
8. צרף הסיב מ -3.3 ליחידה התכנסה 3.7.

4. מנותק מעורב דור אמולסיה

1. השג מכשיר מיקרופלואידיקה זרימת מוקד dropmaker עם פתח מיקרומטר 60 מיקרומטר x 60.
2. ממלאים מזרק 1 מ"ל עם שמנים HFE 7500 עם 2% יוניים fluorosurfactant ^9.
3. מלאו סדרה של 1 מ"ל מזרקים עם השילובים הבאים של והעמסת (FITC) וצבעים כחול מצומדות dextran (CB) ב- PBS: 1 ננומטר FITC / 10 ננומטר CB, 10 ננומטר FITC / 10 ננומטר CB, 1 ננומטר FITC / 100 ננומטר CB, ו -10 ננומטר FITC / 100 ננומטר CB.
4. הר מכשיר dropmaker על הבמה של מייקרו הפוךלהתמודד ואת המזרקים המימיים ושמן על משאבות מזרק. זוג את המזרקים המכשירים באמצעות צינורות PE-2.
5. הפעלת משאבות מזרק ב 500 μl / hr עבור נפט 250 μl / hr עבור תמיסות מימיות, ליצור תערובת של 80 מיקרומטר טיפות המכילות הפתרונות מ -4.3. עבור כל סוג של מדגם מימי, השתמש בהתקן dropmaker טרי לחסל זיהום צולב. אסוף ~ 200 μl של אמולסיה מכל שילוב צבע לתוך מזרק ריק.
6. לאחר 4 סוגי טיפות נאספו בתוך מזרק אוסף יחיד, לערבב את תחליב על ידי החלפה של מזרק שוב ושוב.
7. חזור על שלבים 4.2-4.6 עם תמיסות מימיות המכילות 0.1, 1, 10, ו 100 ננומטר FITC ב PBS.

5. הכנסת סיב אופטי

1. מניחים את שבב microfluidic מפוברק בשלב 2 על הבמה של מיקרוסקופ הפוכה יחד עם מצלמה דיגיטלית מסוגל <100 μsec במהירויות תריס.
2. עבודה בזהירות מהצד, inseרט הסיב מצמיד את ליזר 473 ננומטר לתוך תעלה הרחוק זרם 120 מיקרומטר, נזהר שלא לנקב דרך לערוץ הנביעה העיקרי.
3. הכנס את הסיבים מצמידים את ליזר 405 ננומטר לתוך תעלה הרחוק במורד זרם 120 מיקרומטר גבוה בצד, מתן מרווח סיבים של 300 מיקרומטר.
4. הכנס את הסיב PMT מצמיד לתוך תעלה גבוה 220 מיקרומטר נורמלי סיבי עירור הליזר השני.

6. גילוי הקרינה של אמולסיות מעורבת

1. הר מזרק 5 מ"ל מלא HFE 7500 עם 2% fluorosurfactant יוניים כניסת שמן spacer של מכשיר איתור עם צינורות PE-2.
2. הר מזרק המכיל תחליב FITC / CB מעורבת על משאבת מזרק בכיוון אנכי ואת בני הזוג כניסת reinjection אגל של המכשיר באמצעות צינורות PE-2. חבר באורך של צינורות PE-2 מיציאת המכשיר מיכל פסולת.
3. התקן הראש על ידי הפעלת כל אחד המשאבות ב 1000 μl / hr עד ששנישמן טיפות נראים להיות שילוב קבוע במכשיר וזורם במורד הזרם.
4. התאם את ספיקות כך שמן spacer פועל ב -6,000 μl / hr ואת טיפות ב 100 μl / hr, מתן מרווח משמעותי בין טיפות ארוכים באזור זיהוי.
5. הפעל לייזרים, להפעיל את תוכנית רכישת נתונים, ולהתאים את הרווח PMT לספק אותות כי הם יותר 100x הרצפה רעש הבסיס. התאם את כוח הליזר כך שכל פסגות הכפיל גלויים לעין על timetrace מדורג יחיד, באופן ליניארי.
6. רוכשת 60 שניות של timetrace מתח PMT ב kHz 20 לפחות. לייבא את הנתונים לתוכנה מחשוב כגון Matlab ולמדוד למרומי הפסגות של כפילויות רשמה באמצעות סקריפט תוכנית מחשוב מותאמים אישית.
   הערה: זה מסופק כמידע משלים.
7. חזור על שלבי 6.2-6.7 באמצעות התחליב המעורב FITC בלבד שנוצר 4.7, עם הליזר 405 ננומטר כבוי.

Results

המצאה של מכשיר PDMS המאפשר ההחדרה של סיבים אופטיים דורשת פרוצדורת photolithography רב שלבים ליצור ערוצי גובה שונה (איור 1). ראשית, 80 מיקרומטר שכבה גבוהה של SU-8 הוא הסתובב על גבי פרוסות סיליקון בדוגמת באמצעות מסכה כדי ליצור את גיאומטרית טיפול נוזל. הבא, שכבה נוספת 40 מיקרומטר של SU-8 הוא הסתובב על גבי פרוסות סיליקון, בדוגמת באמצעות מסכה השני כדי ליצור תכונות שיהוו 120 מיקרומטר ערוצי ההכנסה סיבים גבוה לייזר. לאחרונה, 100 מיקרומטר י...

Discussion

זיהוי סיבים אופטיים דורש יישור של סיבים אופטיים ביחס לאפיקי נוזל. מאחר שהמכשיר שלנו מנצל ערוצי מדריך מפוברקים עם photolithography multilayer, שמה של מסכות ביחס לזה היא בעלת חשיבות רבה. אם ערוצי מדריך סיבים קרובים מדי לערוץ הנוזל, קיים פוטנציאל לדליפת נוזל; אם ערוצי המדריך ממוקמים רחוק מדי או לא מיושר, אות הקרינה שנאספה על ידי סיבי זיהוי עשויה להצטמצם באופן משמעותי. יישור נכון יכול להסתייע בעיצוב סימני יישור, כגון מעגלים קונצנטריים לתוך מסכות כדי להיות שותף הממוקם במהלך דפוסי תמונה...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מסכות פוטו	CadArt Servcies
3 אינץ' פרוסות סיליקון, סוג P, דרגת בדיקה בתולית	פרוסות אוניברסיטה	447
SU-8 3035	Microchem	Y311074
SU-8 2050	Microchem	Y111072
Sylgard 184 ערכת אלסטומר סיליקון	Krayden	4019862
מזרקים 1 מ"ל	BD
מזרקים 10 מ"ל	BD	309604
27 מחטי מד	BD	305109
PE 2 צינורות פוליאתילן	Scientific Commodities, Inc.	B31695-PE/2
Novec 7500	Fisher Scientific	98-0212-2928-5	ידוע בכינויו HFE 7500
Ionic Krytox Surfactant			Synthesis הוראות בהפניה #10
צבע כחול מפל מצומד Dextran	Life Technologies	D-1976
פלואורסצאין מלח נתרן	סיגמא	28803
מסנן	פס מרובעSemrock	FF01-446/510/581/703-25
PMT	Thorlabs	PMM02
יציאת סיבים	Thorlabs	PAFA-X-4-A
צינור עדשה	Thorlabs	SM1L05
כבל תיקון עם 200 & #956; M ליבה / 225 & # 956; m חיפוי סיבים אופטיים עם קצה מופשט אחד ומחבר FC/PC אחד	מותאם אישית		של Thorlabs
עם 105 & # 956; M ליבה / 125 & # 956; m חיפוי סיבים אופטיים עם קצה מופשט אחד ומחבר FC/PC אחד	Thorlabs	Custom
125 & # 956; כלי הפשטת סיבים m	Thorlabs	T08S13
225 & # 956; כלי הפשטת סיבים m	Thorlabs	T10S13
מתאם סיבים לייזר	OptoEngine	FC / PC מתאם
405 ננומטר CW לייזר ב 50  mW	OptoEngine	MDL-III-405	מפיץ לייזרים CNI
473 ננומטר לייזר CW ב 50   mW	OptoEngine	MLL-FN-473-50