דור של אפיתל דרכי נשימת עכבר נגזרות ESC תאי שימוש decellularized פיגומי ריאות

בידול בימוי של תאים פלוריפוטנטיים אל שושלת ריאות תלויה אירועים איתות מדויק במיקרו-סביבה של ^1,2. בשל האופי הדינמי של תהליך זה כבר מאתגר לחקות את האירועים המדויקים של organogenesis ריאות במבחנה. הדיווחים אחרונים השתמשו באסטרטגיות הגבלת שושלת חכמת צעד עם תוספת גורם גדילה המסיסה של תרבויות דו ממדים כדי להשיג בידול ריאות ^3-8. בפרוטוקולי בידול צעד חכם, תאים פלוריפוטנטיים, אם תאי גזע עובריים (ESC) או תאי גזע מושרים, הובדלו ראשון שכבת ניבט האנדודרם הסופית. תאי Endodermal מכן נדחפו אל גורל endoderm קדמי ואילך כדי ובתאים ריאות, כפי שהוגדרו על ידי הביטוי של NKX2-1 גורם שעתוק המכיל homeodomain. אבות ריאות אלה הובדלו נוספים הפרוקסימלית (דרך נשימה) או דיסטלי (alveolar) לתאי האפיתל ריאות wiה המשיכה תוספת גורם גדילה. 2-ממד אסטרטגיות כאלה היו כמה הצלחה ביצירת תאי אפיתל ריאות, אולם ישנם מספר מגבלות כולל יעילות ברורה, זיהום אפשרי משורות endodermal אחרות, חוסר מבנה 3-ממדי (3D), ובחלק ממקרים להשתמש תרבויות מוגדרות עם תוספת בסרום. תרבות של pluripotent או תאים מובחנים על פיגומי ריאות decellularized משמשת יותר ויותר כמו assay כדי להעריך את פוטנציאל ההתחדשות של תאי זרע להרכיב מבני ריאות אפיתל ^3,5,6,8,9. תרבות דוחות כאלה זורעים תאים על פיגומים עם גורם הגדילה המשך או בתוספים בסרום.

פיתוח ריאות כרוכה החלוקה, הגירה, ביטוי גנים והתמיינות של תאים בודדים בתגובה לגירויים סביבתיים. המטריצה ​​הסלולר הנוספת (ECM) היא סריג של גליקופרוטאינים כי בנוסף לספק תמיכה מבנית, מפנה tissuדואר morphogenesis ידי שילוב והסדרת תהליכים אלה ^10,11. באמצעות פיגום ECM הריאות כפלטפורמה טבעית לתרבות endoderm טוב יותר לחקות את המילייה התפתחותי in vivo הריאות, יצרנו תאי גזע אפיתל דרכי נשימת תאים שמקורם בתוך 3D-תרבות מוגדרת הגדרה ביעילות שחזור גבוהות.

פיגומי ECM עכברוש ריאות נוצרו על ידי decellularization וכן עכבר ESC שמקורם בתאי endodermal נוצרו ובהמשך זורעים על פיגומים אלה. ביטוי כפול של CXCR4 & חלבוני c-KIT מסמן זהות תא האנדודרם סופית ותאי חיובי לשני Sox2 & ביטוי NKX2-1 המזוהים דרכי נשימה (ריאות הפרוקסימלי) ובתאים. תאי האנדודרם מכריעים היו בתרבית בשעת ממשק נוזל האוויר (ALI) לתקופה של עד שלושה שבועות כדי לייצר תאי אפיתל דרכי נשימה פונקציונלית במבחנה.

פרוטוקול זה מקדם בידול שושלת ריאות של definiendoderm מופרזת מוקדם ככל 7 ימים, ציין עם הופעתה של NKX2-1 ⁺ / Sox2 ⁺ אבות ריאות הפרוקסימלי מוקדם. במשך היום 14 ו -21 של אוכלוסיות תאי אפיתל דרכי הנשימה בוגרות תרבות לצוץ כולל ריסים (TUBB4A ^+), מועדון (SCGB1A1 ^+), ואת בסיס (TRP63 ^+, KRT5 ⁺⁾ תאים עם דמיון מורפולוגית ופונקציונלי כדי איירווייז עכבר ילידים. פרוטוקול זה מדגים את החשיבות של microenvironment 3D-מטריקס להשגת בידול חזק כדי Airway לתאי האפיתל.

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות ועדת טיפול בבעלי חיים של החולים מכון המחקר לילדים חולים.

1. הכנת פיגום

1. Decellularization של ריאות
   1. להרדים חולדות Wistar מבוגרות באמצעות CO ₂ קאמריים. מניחים חיה בתא ולהתחיל 100% חשיפה CO ₂ בקצב המילוי של 10-30% של נפח תא לדקה.
      1. שים חיה לחוסר הכרה; זה יתרחש לאחר כ 2-3 דקות. אם חוסר הכרה אינה מתרחש בתקופה זו, לבדוק את קצב מילוי ואת החותם קאמרי. בעקבות חוסר הכרה, להתבונן בבעלי חיים עבור צבע עיניים דהויים וחוסר הנשימה. אם הן נצפות, לשמור מילוי CO ₂ למשך 1-2 דקות ולאחר מכן להסיר מן החי קאמרי עבור הליך.
   2. Secure חיה לנתח משטח ידי תיקון קדמי ואת רגליים אחוריות, ולרסס לאורך החזה באזור בטן עם אתנול 70%. גש לב luNGS ידי פתיחת חלל בית החזה באמצעות חתך אנכי לאורך עצם החזה.
   3. ודא חתכים קטנים דרך הסרעפת הראשון לגרום הריאות לחזור בו, ומפחית את הסיכוי ניקוב הריאות. ולקשור את הווריד הנבוב הנח עם תפר ומקום חתך קטן אטריום השמאל במספריים לנתח קטנים.
   4. באמצעות מזרק 10 מ"ל מוכן עם מחט 25 G מלאים תמיסת מלח מאוזנת של heparinized האנק (HBSS) (10 הפרין U / ml ב HBSS), להתחיל זלוף ריאות ידי החדרת מחט לתוך החדר הימני לדחוף למאגר דרך מחזור הדם הריאתי (בשיעור של 2 מ"ל / דקה). המשך הליך זה עד הריאות להלבין והנוזל זורם מן הפרוזדור השמאלי פועל ברור.
   5. בעקבות זלוף, לחשוף את קנה הנשימה cannulate עם קטטר פלסטיק ליד סחוס התריס ומאובטח במקום עם תפר.
   6. הגדרת מערכת זלוף הכבידה על ידי תיקון מזרק 10 מ"ל ל עמדה תשובה ו מהדק. הסר דהבוכנה במזרק iscard. אבטח את נקודת המילוי המרבית על חבית מזרק ב 20 סנטימטרים מעל הריאות. צרף שסתום דו כיווני עד הסוף של המזרק, וכן צינורות פלסטיק ארוך אל הקצה השני של ברזלים לאספקת פתרון decellularization אל קנה הנשימה cannulated. יוצקי פתרון לתוך מזרק ולאפשר פתרון למלא צינורות ו קטטר פלסטיק מצורפים.
      1. שטיפה הריאות על ידי מילוי עד אפס מקום ריאות הכולל (כ -12 מ"ל) עבור 1 דקות ולהסיר את הקטטר פלסטיק מקנה הנשימה כדי לאפשר לנוזל לזרום אל מחוץ לריאות. אין למלא מזרק יותר מ -10 מ"ל כאשר lavaging הריאות כדי לשמור על לחץ מתחת ל -20 ס"מ של H ₂ O.
   7. שטיפה חוזרת של הריאות שמונה פעמים עם פתרון decellularization, ואחריו 10 שטיפות עם בופר פוספט (PBS).
   8. מנתחים את קנה הנשימה והריאות חינם מחלל הצוואר והחזה ולהסיר מן החיה. שמור רקמות בקור PBS ב 4 ° C עד כהכנה vibratome sectioning.
2. דור סעיף עבה
   1. הכן כ 15 מיליליטר של 2% ו -4% (w / v) agarose, ומספיק 6% (w / v) agarose להטבעה כל האונות לגושים מלבניים קטנים. ממיסים אבקת נקודת התכה נמוכה agarose ב PBS על ידי במיקרוגל. מעבירים את agarose 50 מ"ל צינורות על גוש חום ולשמור הטמפרטורה מעל 40 מעלות צלזיוס, כדי למנוע gelling.
   2. לנתח ריאות decellularized בסוף כל הסמפונות אוֹנִי לנתק כל אונה (גולגולתי, באמצע, אבזר, ואת אונות תקינה זנב והאונה השמאלית) באמצעות מספריים קטנים. פט לייבש כל אונה באמצעות יריעות סופגות להסיר PBS העודף ומניח בתוך 2% (w / v) agarose תוך כדי לחסום החימום.
   3. הסר כל אונה לאחר 5 דקות של ציפוי agarose, ומניח בצלחת פטרי לאפשר למשטח ז'ל 1 דק 'על צלחת קרה.
   4. בעדינות במקום אונות בחזרה ל -4% (w / v) agarose, מגניב אחרי 5 דקות, וחזור ציפוי פעם נוספת עם 6% (w / v) agarose.
   5. לאחר שיתוף רציףating של כל אונה, להטביע כל אונה בנפרד 6% (w / v) agarose באמצעות תבניות בסיס מתכת עם לפחות 3 מ"מ של agarose סביב הרקמות מן הקצוות. אוריינט כל אונה באמצעות מלקחיים על ידי צבת הקצה השטוח הגדול האונה על פני השטח של עובש מתכת מול הנסיין. קצה זה יהיה בצד קבוע לצלחת הדגימה עבור חתך vibratome.
   6. אפשר גושי ג'ל על צלחת קרה לפחות 30 דקות לפני חתך עם vibratome. בלוקים חנות בתא humidified עד 12 שעות ב 4 ° C לפני חתך vibratome.
   7. הגדר את vibratome ידי מילוי תא חתך עם קר PBS ^12. לשמור על טמפרטורה קרה לאורך חתך עם אמבט הקרח שמסביב. הסר בלוקים מתבניות מתכת ולהשתמש בסכין גילוח כדי לקצץ agarose עודף סביב אונות, תוך שמירה על כ 3 מ"מ מהקצה של הרקמה.
   8. תקן רקמות במרכז צלחת הדגימה באמצעות דבק, לצלול לתוך צלחת tהוא PBS מלא קאמרי חתך. הגדרת חתך גבולות על vibratome ידי בחירת מהירות, משרעת הבאים, וערכי עובי בהתאמה: 0.2 מ"מ / sec, 1.85 מ"מ, ו -350 מיקרומטר.
      הערה: שני סעיפים אורכים ואת הרוחבי של אורינטצית אונת כשרים.
   9. סעיף כל אונה לחלוטין. ידני לחתוך קטעים בחינם באמצעות מספריים קטנים אם קטע אינו מופרדים באופן מלא על ידי להב בסוף רצף הסעיף. אסוף סעיפי פיגום בעדינות ולשמור ב PBS על קרח עד לשלב הבא.
      הערה: ייתכן שחלקים שנוצרו תכלול הוא הריאה הפרוקסימלי דיסטלי באזורים והמקורות שניהם יכולים לשמש recellularization; עם זאת, רוב השטח יקיפו ריאות דיסטלי.
3. טיהור סעיפי פיגום
   1. מעבירים את 350 מיקרון סעיפים פיגום עבה מ PBS על צינורות microcentrifuge (עד 30 סעיפים / צינור) ולטפל עם nuclease (90 U / ml ב PBS) (ראה רשימה של חומרים) במשך 12 - 24 שעות ב RT, עלהכתף.
   2. בעקבות הטיפול nuclease, סעיפים העברה באמצעות מלקחיים כדי צינורות microcentrifuge חדש ולטפל עם פתרון מיקרוביאלית (200 U / סטרפטומיצין פניצילין מ"ל ו -25 מיקרוגרם / מ"ל ​​amphotericin B ב PBS) בתנאים סטריליים עבור 6 שעות ב RT, על הכתף.
      הערה: ניתן לאחסן פיגומים בתמיסה נגד חיידקים לשימוש עד שבוע ב 4 ° C לפני השימוש.
   3. בעקבות צעד הטיהור עם פתרון מיקרוביאלית, לשטוף פיגומי פעמים עם PBS בתנאים סטריליים ולהעביר סרום תקשורת בידול חינם (SFDM) לפני זריעה עם תאים.

2. תא Endodermal כן

1. Endoderm אינדוקציה Definitive
   1. לשמור על קווי ESC העכבר תחת תרבות חופשית מזין ללא, סרום באמצעות תנאים 2i ^13. התחל אינדוקצית האנדודרם ידי הסרת תאי מתרבות פלוריפוטנטיים חסידות ידי trypsinization.
   2. Resuspend התאים SFDM וזרעי בצפיפות של 20,000תאים / מיליליטר צלחות חסידות נמוכות במשך שלושה ימים ללא שינוי תקשורת כדי לאפשר היווצרות EB.
   3. אחרי שלושה ימים להעביר את EBS בעדינות לתוך 50 מ"ל צינורות חרוטים בעזרת פיפטה 10 מ"ל ולאפשר להם לאסוף בתחתית 3 דקות ב RT.
   4. בזהירות תקשורת לשאוב ולהוסיף תקשורת SFDM טריה בתוספת 50 א Activin ng / ml
   5. תאי זרע חזרה לצלחות החסיד הנמוכות ביחס של 1: צפיפות 2 והתרבות במשך שלושה ימים נוספים כדי להשיג בידול האנדודרם סופי.
2. עשרת האנדודרם מכריעים
   1. אסוף יום 6 EBS, לנתק עם טריפסין תווית עבור c-kit וביטוי CXCR4 באמצעות נוגדנים ניאון מצומדות ^14.
   2. מיין תאים שכותרתו באמצעות מיון תא מופעל פלואורסצנטי (FACS) לביטוי של שני הסמנים כדי להשיג אוכלוסייה האנדודרם סופית מועשרת ^15.

3. הגדרת Recellularization

1. ממשק אוויר נוזליהתקנת התרבות
   1. העבר כל סעיף פיגום decellularized (שלב 1.2.9) מ SFDM על קרום צף הידרופובי (8 מיקרומטר גודל נקבובי) באמצעות מלקחיים סטרילית. ודאו סעיפי פיגום מפוזרים באופן שווה על הממברנה.
   2. כן 6- או 12-גם צלחות ידי מילוי בארות עם 1 או 0.5 מיליליטר של SFDM, בהתאמה. בעדינות במקום ממברנות לתוך בארות, המאפשר הממברנה לצוף על גבי מדיה, יצירת התקנת תרבות אוויר נוזלית.
2. זריעה של פיגומי 3D
   1. בעקבות FACS עבור סמנים האנדודרם סופי (שלב 2.2.2) לספור תאים ממוינים באמצעות hemocytometer, ספין למטה ב 400 XG במשך 5 דקות ו resuspend ב SFDM. Resuspend תאים להשיג נפח המכיל כ 100,000 תאים / 10 μl / הפיגום.
   2. כדי recellularize פיגומים, פיפטה 10 μl של תאים ישירות על כל מקטע מוכן משלב 3.1.2.
   3. חלף תקשורת SFDM בתרבויות כל 48 שעות. לשאוב את המדיה הישנה ידי החזיק את הצלחת ב בשיפוע קלכדי למנוע שיבוש התרבות. לאט לאט מוסיף SFDM טרי לתרבות לאורך דופן הבאר כדי למנוע שקיעה של קרום צף.
   4. לשמור על תרבויות נוזלי אוויר לתקופה של עד 21 יום כדי להשיג בידול של תאי זרע כדי epithelia דרכי נשימה הבוגרת.
      הערה: Recellularized ניתן לזהות קטעים מעובדים עבור מכתים רקמות immunofluorescent (IF) מיקרוסקופיה בכל נקודת זמן במהלך תרבית תאים ^16.

כפי שמתואר בפרוטוקול זה, בידול חזק של האנדודרם סופי להבשיל דרכי נשימה תא אפיתל יכול להיות מושגת באמצעות תרבות המורחבת של תאים שנזרעו על סעיפי decellularized פיגום ריאות. מומלץ פיגומי decellularized להתאפיין על מנת להבטיח (1) תאי מארחים יוסרו לחלוטין, ו (2) חלבונים תאים מטריקס נשמרים לפני שימוש פיגומים לבידול. Decellularization ניתן להעריך באמצעות מכתים רקמות עם hematoxylin ו eosin (H & E) ו -4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), כפי שמודגם באיור 1 א. אלקטרונים סורקים מיקרוסקופ גבוהה הגדלה (SEM) ניתוח של פיגומים מאשר בהעדר תאי מארח ואדריכלות מטריקס ללא פגע, כפי שמודגם באיור 1B. אפיון נוסף של הפיגום הנותרים על ידי בדיקות מתיחת immunostaining עבור חלבוני מטריקס יכול להתבצע כדי להבטיח preservatיון של ECM הבא decellularization 16.

התרבות לא חסידה של ESCs במדיה SFDM במשך שש תוצאות ימי ההיווצרות של אגרגטים תא (EBS) כפי שמודגם באיור 2 א. שלושה ימים של Activin תוצאות טיפול ב אינדוקציה האנדודרם סופית. הגבלת Lineage של ESC כדי האנדודרם סופי יכולה להיות מאושרת על ידי גברת ביטוי וביטוי של הגנים הקשורים שושלת endoderm וחלבונים 17, ולא אפשר לקבוע מורפולוגית. יעילות endoderm אינדוקציה נע בין 50-70% בהתאם לקו ESC בשימוש. ניסויים בוצעו בקווי ESC עכבר: R1 (Nkx2-1 mCherry), G4 (dsRed -MST), ו -129 / אולה (בר-GFP / Foxa2-hCD4), בעוד כל הנתונים מאוירים בכתב היד הזה הוא באמצעות התא R1 קַו. CXCR4 חיובי כפול + / c-KIT + האוכלוסייה האנדודרם סופי ממוינת כפי שמודגם 2B איור, זורעיםעל פיגומי ריאות 3D, ותרבותי עבור עד 21 ימי ממשק נוזל אוויר SFDM. חשוב למיין ולהעשיר עבור האנדודרם סופי הארגון מוגבל והבחנה מושגת עם התרבות של תאים ממוינים מהיום הטרוגנית 6 EBS כפי שמודגם באיור 2C. מבנים שהוקמו על ידי תאים ממוינים על פיגומים מזכירים בפיתוח ריאות (יום עוברי 13.5) כפי שמודגם באיור 2C-D. מניסיוננו, צפיפות זריעה של 100,000 תאים ממוינים / פיגום יש הניבה את ואכלוס הפיגום הטוב ביותר.

בידול אל שושלת הריאות הוא ציין מוקדם ככל 7 ימים הבאים תרבות פיגום. Airway ובתאים אפיתל חיוביים עבור NKX2-1 ו Sox2 מזוהים באמצעות ניתוח confocal IF כפי שמודגם באיור 3 א. Sox2 חיובי, תאים שלילי NKX2-1 הם תאים פלוריפוטנטיים endodermal סביר שלא הבדיל אל li ריאותneage. עם תרבות יותר תאים אלה עשויים להתחיל להביע NKX2-1 או עוברים אפופטוזיס ללא תמיכה נאותה במיקרו-סביבה. אם ניתוח של יום 21 תרבויות מגלה אוכלוסייה מבוגרת אפיתל דרכי הנשימה המכילה TUBB4A + תאי ריסים, SCGB1A1 + תאי מועדון, TRP63 + / KRT5 + תאים הבזליים כפי שמודגם באיור 3 ב. ניתוח SEM של פני השטח של 21 תרבויות יום מגלה דמיון מורפולוגי של תרביות תאים שמקורם גזע לעכבר דרכי הנשימה.

שני חלבונים מטריקס מבודדים (אני קולגן, קולגן IV, פיברונקטין, laminin) ופיגומים כליות עכברוש decellularized לא הצליחו לקדם בידול ריאות השושלת כאשר זורעים עם האנדודרם סופי ותרבותי באותם תנאים כפי שתואר לעיל 16. מכך ניתן להסיק כי microenvironment 3D נוצר על ידי פיגומים הנגזרים ריאות היא נבדלת פיגומים הנגזרים כליות ביכולתה לקדם בידול ריאות שושלת של seedeתאי endodermal ד.

טכניקת Decellularization באיור 1. מסיר מרכיבים תאיים ושומר ECM. (א) H & E (פנל עליון) ו DAPI (פנל תחתון) מכתים של רקמת ריאה טבעית decellularized מראה בהעדר הגרעינים הבא decellularization. הפאנל הימני מראה דוגמאות של קטעי רקמה מהריאות ללא decellularization אופטימלי. ראשי חץ להראות גרעינים הנותרים על פיגומים בשל decellularization השלם, המדגיש את החשיבות של אופטימיזציה טכניקה לפני recellularization. בר סולם = 25 מיקרומטר. (ב) SEM תמונות של ריאות טבעיות decellularized, מראות בהעדר תאים ושימור הארכיטקטורה מטריקס על פיגומי decellularized. בר סולם = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאןכדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. הממוין ESC הנגזרת תוצאות האנדודרם מכריעות recellularization האופטימלי. (א) גופי embryoid יום 6 (EBS) לאחר שלושה ימים של Activin טיפול לקידום בידול האנדודרם סופי. EBS (B) מסודר על ידי FACS לביטוי כפול של סמני משטח CXCR4 ו- c-KIT לבודד את האוכלוסייה האנדודרם הסופית. אוכלוסייה זו תהיה זורעת על פיגומי decellularized. (ג) H & E מכתים של פיגומים recellularized ביום 7 ויום 21 של תרבות. לוח שמאלי מייצג מאורגן, מבנים דמויים דרכי נשימה הבאה זריעה עם תאים ממוינים, ואת הפנל ימני מייצג לא מאורגנים, תאים ממוינים שגשוג מאוד על פיגומים המדגישים את החשיבות של מיון של תאים לפני recellularization. סוּלָםבר = 30 מיקרומטר. (ד) H & E מכתים של ריאות עכבר עובריות יום 13.5. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. תרבות המורחבת של האנדודרם סופי על פיגומי ריאות טבעיים מפנה בידול כדי Airway לתאי האפיתל. (א) תאים הפרוקסימלי ובתאי ריאות (NKX2-1 + / Sox2 +) מזוהים הבא שבעה ימים של תרבות על פיגומי decellularized. בר סולם = 15 מיקרומטר. (ב) השמאלי מציג תמונה בוגרת pseudostratified תא אפיתל מבנים (CDH1 +) ולאורכו laminin חלבון קרום במרתף בצד הבסיסי של מבנים. המרכז ולהראות תמונה הימנית epithelia דרכי נשימה הבוגרת להשלים עם תאי ריסים (TUBB4A +), CLUב תאים (SCGB1A1 +) ותאי הבזליים (KRT5 + / TRP63 +). קנה המידה של התמונה שמאל בר = 30 מיקרומטר; במרכז סרגל קנה מידת תמונה ימני = 15 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

אין אינטרסים כלכליים מתחרים להכריז.