כאן, פרוטוקול למסוק, לתחזק ולטפל organoids הקטנה עכבר מעיים עם דפוסים מולקולריים הקשורים הפתוגן (PAMPs) ו חיידקי ליסטריה מתואר, כמו גם דגש על ביטוי גנים וטכניקות נורמליזציה ראויות חלבון.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
organoids מעיים הראשי הוא מערכת מודל ערך כי יש הפוטנציאל להשפיע על השדה משמעותי האימונולוגיה רירית. עם זאת, את המורכבות של מאפייני צמיחת organoid לשאת אזהרות משמעותיות עבור החוקר. באופן ספציפי, את דפוסי הצמיחה של כל organoid הבודד הם משתנים מאוד וליצור אוכלוסייה הטרוגנית של תאים אפיתל בתרבות. עם אזהרות כאלה, שיטות בתרבית רקמה משותפת לא יכולות להיות מיושמות פשוט למערכת organoid בשל המורכבות של המבנה התאי. ספירת ציפוי מבוסס אך ורק על מספר תא, אשר נפוץ תאים מופרדים בנפרד, כגון שורות תאים, אינה שיטה אמינה organoids אלא טכניקת נורמליזציה כמה מוחלת. נירמול לתוכן חלבון כולל עשוי מורכב בשל מטריקס חלבון התושב. מאפיינים אלה במונחים של תא מספר, צורה וסוג התא צריכים להילקח בחשבון בעת הערכת con המופרשאוהלים מן המונית organoid. פרוטוקול זה נוצר להתוות תהליך פשוט לתרבות ולטפל organoids מעי דק עם פתוגנים חיידקים ודפוסים מולקולריים הקשורים הפתוגן (PAMPs). זה גם מדגיש את טכניקות הנורמליזציה כי צריך להיות מיושמות כאשר ניתוח חלבון נערך אחרי תיקול כזה.
מבוא
היכולת לקצור organoids עיקרי התרבות תואר עבור מעי דק, מעי גס, לבלב, כבד ומוח והם התקדמות מרגשת רלוונטית להבנת תופעות נציג יותר פיסיולוגי לביולוגית רקמות 1-5. השיטות הראשונות מתארות את התרבות ותחזוקה של organoids מעי הדק נמסרו על ידי סאטו et al. מחוץ למעבדה של נס Clevers 1. לפני זה שיטה, קציר והתרבות של תאים אפיתל במעי העיקרי הוכיחו להיות מוגבל ולא יעיל בשמירת צמיחת תאי אפיתל. טכניקות אלה היו דיסוציאציה של רקמות באמצעות דגירה עם אנזימים, כגון collagenase ו dispase, שיובילו בסופו של דבר אל התולדה של תאי פיברובלסטים העיקריים intermixed 6. תנאים אלו גם להיות מוגבלים בזמן בשמירה על תרבית תאי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל המחקר אושר ועורך תחת הנחיות IACUC וירג'יניה טק
1. הכינו R-Spondin1 אוויר מדיה מקו תא HEK293T-Rspo1
- דור של תאי HEK293T-Rspondin1 תואר בעבר 10. זרע HEK293T-Rspondin1 מפריש תאים ב 5-10% confluency, כ 8 x 10 5 -1.7 x 10 6 תאים, בתוך בקבוק T-175 עם 40 מ"ל של מדיום הנשר שונה של 1x Dulbecco (DMEM) + 10% עוברית שור סרום ( FBS) כמו תקשורת הצמיחה, ו לדגור על 37 ° C + 5% CO 2.
הערה: המדיה הצמיחה של תאים מפרישי HEK293T-Rspondin1 ישמש התקשורת מותנ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כאשר בעקבות פרוטוקול זה לטפח organoids מעיים, organoids כדור בצורת המאפיין יהיה נוכח לאחר קטיף. תוספת של התקשורת מותנה R-spondin1 יומי תיזום צמיחה נביטה של organoids. הצמיחה של organoids מוצג באיור 1 א - F, והוא נציג של organoids מעיים בימים 1, 2, 4, 5, 6 ו יום 14. איור 1F מייצג את מאפייני הצמיחה הלא הומוגנית של organoids ביום 14.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
התרבות והתחזוקה של organoids מעיים היא הליך זה ניתן לשלוט על ידי כל אדם עם טכניקה בתרבית רקמה נאותה. יש דקויות ב passaging בהשוואה לגידול תאים בשכבה קונבנציונלית יותר, אבל הדקויות הללו אינן שקשה להתגבר עליו. השלבים הקריטיים של שיטה זו כרוך יכולת לגדל את organoids צפיפות גבוהה מספיק עבור זריעה אופטימלית. ניסויים חייב להיות scaled למטה עם organoids כמו צפיפות זריעה גדולה שיכולה להיות מושגת בדרך כלל עם שורות תאים אינן מעשיות. זה הופך בולט במיוחד כאשר יש קבוצות טיפול מרובות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
המחברים רוצים להודות לד"ר שריל קוטרמארש-אוט, דילן מקדניאל ובטינה הייד על הדיונים הטכניים. המחברים מודים לד"ר Nanda Nanthakumar על אספקת תאי Caco-2. המחברים מודים גם לתוכנית ההזדמנויות האקדמיות הרב-תרבותיות (MAOP) בווירג'יניה טק. עבודה זו נתמכה על ידי פרס המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות K01DK092355 (ל-I.C.A). התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| סרום בקר עוברי (FBS) | Atlanta Biologicals | S11050 | (סעיף 1,3,6) או מותג שווה ערך |
| Sorvall Legend XTR צנטריפוגה | תרמו | (סעיף 1,3) | |
| DMEM | GE Healthcare | Sh30243.01 | (סעיף 1,6) עבור תאי Caco-2 ו-HEK293 Rspondin1 |
| קו תאים מפריש HEK293T-Rspondin1 | (סעיף 1) תואר ושונה מ-Kim, K.A. et al. חלקיקים לנטי-ויראלים הכילו RSPO1(NM_138683) ORF cDNA משובט לתוך עמוד שדרה pReceiver-Lv105 שהוזמן ונרכש בהתאמה אישית מ-GeneCopoeia. | ||
| 50 מ"ל צינור חרוטי | Falcon | 352070 | (סעיף 1) או מותג שווה ערך |
| T-175 Flask | Corning | 431079 | (סעיף 1) או מותג שווה ערך |
| קורנינג | מטריצת חלבון | 356231 | (סעיף 2,3,4,5,6) גורם גדילה מטריג'ל מופחת |
| HyClone Dulbecco's (DPBS) | GE Healthcare | SH30264.01 | (סעיף 2,3) |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | (סעיף 2,3) מתקדם DMEM/F12 |
| קורנינג 24 באר צלחות TC | קורנינג | 3524 | (סעיף 2) |
| N2 תוספת 100x | טכנולוגיות חיים | 17502-048 | (סעיף 2) |
| B27 ללא ויטמין A 50x | לייף טכנולוגיות | 12587-010 | (סעיף 2) |
| Trizol | Life Technologies | 15596-026 | (סעיף 2) |
| תוסף גלוטמין (גלוטמקס) | Life Technologies | 35050-061 | (סעיף 2) יכול לשלב עם DMEM / F12 |
| HEPES מתקדם (1 מ ') | Life Technologies | 15630-080 | (סעיף 2) יכול לשלב עם DMEM / F12 מתקדם & |
| 10 מ"ל פלקון פיפט סרולוגי | 357551 | (סעיף 2) או מותג שווה ערך | |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | (סעיף 2) מלאי = 100 מ"ג/מ"ל |
| N-אצטיל-L-ציסטאין | סיגמא-אולדריץ' | A9165 | (סעיף 2) מלאי = 1M |
| עכבר רקומביננטי EGF | Biolegend | 585608 | (סעיף 2) מלאי = 500 מ"ג/מ"ל |
| נדנדה משתנה | Bioexpres | (סעיף 3) | |
| מספריים | (סעיף 3) | ||
| מלקחיים | (סעיף 3) | ||
| מגלשות | (סעיף 3) | ||
| פינצטה | (סעיף 3) | ||
| 25 מ"ל פיפט פלקון | סעיף 3) | ||
| EDTA | סיגמא-אולדריץ' | SLBB9821 | (סעיף 3) 0.5 מ' או חלופה צלחת |
| פטרי סטרילית EDTA בדרגת TC 100 מ"מ x 15 מ"מ | פישר | FB0875712 | (סעיף 3) או צלחת TC בגודל שווה |
| 1 מ"ל מזרק | בקטון דיקינסון | 309659 | (סעיף 4) |
| מחט גלישה מדויקת | בקטון דיקינסון | 305120 | (סעיף 4) 23G x 1 1/4 (0.6 מ"מ x 30 מ"מ) |
| פלאגלין מ- Bacillus subtilis | Invivogen | tlrl-bsfla | (סעיף 5, 6) |
| ליסטריה מונוציטוגנס | ATCC | 19115 | (סעיף 5,6) ( מורי et al.) |
| המוציטומטר | סיגמא-אולדריץ' | Z359629-1EA | (סעיף 5,6) או מותג מקביל |
| BBL עירוי לב מוח אגר | בקטון דיקינסון | 211065 | (סעיף 5) |
| עירוי לב מוח | בקטון דיקינסון | 237500 | (סעיף 5) |
| Caco-2 | ATCC | HTB-37 | (סעיף 6) |
| טריפסין | gibco | 25200056 | (סעיף 6) |
| מתנול | פישר | A412-4 | (סעיף 6) |
| SpectraMax M5 | התקני | (סעיף 6) | |
| 96 צלחת בדיקת באר | קורנינג | 3603 | (סעיף 6) צלחת שחורה, תחתית שקופה TC מטופלת |
| בטכנולוגיית חיים של צבע צביעה גרעינית | H1399 | (סעיף 6) בקבוק Hoechst 33342 | |
| T-75 | קורנינג | 430641 | (סעיף 6) או מותג שווה ערך |
| 15 מ"ל צינור חרוטי | Falcon | 352096 | (סעיף 1,3) או מותג שווה ערך |
| 1.7 מ"ל צינור פוליפרופילן | Bioexpress | C-3262-1 | או מותג שווה ערך |
| Quick-RNA MiniPrep | Zymo Research | R1054 | או מותג שווה ערך |
| TNF-alpha | ערכת בדיקת ביטוי גנים | Applied Biosystems | Mm 00443260_g1 |
| IL-6 | Applied Biosystems | (Mm 00446190_m1 | ערכת בדיקת ביטוי גנים Taqman |
| IL-1beta | Applied Biosystems | ערכת בדיקת ביטוי גנים 00434228_m1 Taqman | |
| IL-18 | Applied Biosystems | מ"מ 00434225_m1 | ערכת בדיקת ביטוי גנים Taqman |
| 18s | Applied Biosystems | Hs 99999901_s1 | ערכת בדיקת ביטוי גנים Taqman |
| 7500 מערכת PCR מהירה בזמן אמת | Applied Biosystems | ||
| Nexus gradient Mastercycler | Eppendorf | ||
| TaqMan Fast Universal PCR Master | Mix Life Technologies | 4352042 | |
| קיבולת גבוהה cDNA ערכת שעתוק הפוך | טכנולוגיות חיים/יישומי ביוסיסטמס | 4368814 | |
| צלחת תגובה אופטית מהירה 96 בארות, 0.1 מ"ל | טכנולוגיות חיים/ביו-מערכות יישומיות | ||
| עכבר רקומביננטי R-Spondin 1 חלבון | R& D Systems | 3474-RS-050 | 500 ננוגרם/מ"ל |
| כלורופורם | סיגמא-אולדריץ' | C7559 |
מקורות
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelia....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
