הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

דור של איברים ממוזגים מדיה ויישומים עבור לימוד השפעות איבר ספציפי על התנהגות סרטן שד גרורתי

8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54037

⸱

13 ביוני 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1London Regional Cancer Program, London Health Sciences Centre, 2Department of Anatomy & Cell Biology, Schulich School of Medicine & Dentistry, Western University, 3Department of Biochemistry, Schulich School of Medicine & Dentistry, Western University, 4Department of Oncology, Schulich School of Medicine & Dentistry, Western University, 5Lawson Health Research Institute

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כתב יד זה מתאר מערכת מודל ex vivo המורכבת ממדיה מותנית איברים שמקורה בבלוטת הלימפה, העצם, הריאה והמוח של עכברים. ניתן להשתמש במערכת מודל זו כדי לזהות ולחקור גורמים מסיסים שמקורם באיברים והשפעותיהם על טרופיזם האיברים וההתנהגות הגרורתית של תאים סרטניים.

תקציר

סרטן השד שולח גרורות לבלוטות הלימפה, העצם, הריאות, המוח והכבד בחולי סרטן השד. מאמצי מחקר קודמים התמקדו בזיהוי גורמים הטבועים בתאי סרטן השד האחראים לדפוס גרורתי נצפה זה (המכונה טרופיזם איברים), אולם הרבה פחות ידוע על גורמים הקיימים באיברים ספציפיים התורמים לתהליך זה. זה נובע בחלקו מהיעדר מערכות מודל במבחנה המסכמות במדויק את המיקרו-סביבה של האיברים. כדי לטפל בכך, הוקמה מערכת מודל ex vivo המאפשרת לחקור גורמים מסיסים הקיימים במיקרו-סביבות איברים שונות. מודל זה מורכב מיצירת מדיה מותנית מאיברים (בלוטת לימפה, עצם, ריאה ומוח) המבודדים מעכברים עירומים אתימיים רגילים. מערכת המודל אומתה על ידי הוכחה כי קווי תאים שונים של סרטן השד מציגים התנהגות ממאירה ספציפית לקו התא וספציפית לאיבר בתגובה למדיה מותנית באיברים התואמת את הפוטנציאל הגרורתי שלהם in vivo. ניתן להשתמש במערכת מודל זו כדי לזהות ולהעריך גורמים מסיסים ספציפיים שמקורם באיברים שעשויים למלא תפקיד בהתנהגות הגרורתית של תאי שד וסוגים אחרים של תאים סרטניים, כולל השפעות על גדילה, נדידה, התנהגות דמוית גזע וביטוי גנים, כמו גם זיהוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות חדשות לסרטן. זוהי מערכת המודל הראשונה ex vivo שניתן להשתמש בה כדי לחקור בפירוט התנהגות גרורתית ספציפית לאיבר ולהעריך את תפקידם של גורמים מסיסים שמקורם באיברים ספציפיים בהנעת תהליך הגרורות הסרטניות.

מבוא

סרטן השד הוא הסרטן שאובחן הנפוץ ביותר אצל נשים ואת הסיבה המובילה השנייה של מקרי מוות הקשורים לסרטן 1. שיעור התמותה הגבוה של סרטן השד הוא בעיקר בשל כישלון הטיפול קונבנציונלי להמתיק ולחסל מחלה גרורתית; כ -90% ממקרי המוות מסרטן הן בשל גרורות 2. הבנת המנגנונים המולקולריים שבבסיס של המפל גרורתי היא בעל חשיבות עליונה בפיתוח תרופה יעילה הוא מוקדם סרטן השד בשלב מאוחר.

מחקרים שנערכו בעבר סייעו להבהיר את האופי הרב השלבים של גרורות סרטן שד ההיפותיזה הוא התוצאה של שתי התקדמות סרטן הגרורות תלויה במידה רבה על אינטראקציות בין תאים הסרטניים מארח הסביבה 3. תצפיות קליניות הראו כי סרטן רב להציג כמיהות איברים, כלומר., הנטייה גרורה ספציפי מועדפת organs.In את הרשויותדואר של סרטן השד, המחלה של מטופל בדרך כלל מתפשטת או גרורות עד 5 אתרים מרכזיים, כולל העצם, ריאות, בלוטה לימפה, כבד, ומוח 4-6. תאוריות רבות פותחו כדי להסביר את התהליך הזה, אבל רק מעטים מהם עמדו במבחן הזמן. התיאוריה של גרורות של יואינג, הציע בשנת 1920, שיערו thatthe חלוקת גרורות נבע אך ורק גורמים מכניים; לפיו תאים סרטניים מבוצעים בכל הגוף על ידי דפוסי זרימת דם פיסיולוגי מוגדרים נורמלים פשוט לעצור במיטת הנימים הראשונה שהם נתקלים 7. לעומת זאת, השערת 1889 "זרע ואדמה" של סטיבן פאג'ט הציעה אינטראקציות מולקולריות נוספות היו אחראי ההישרדות והצמיחה של גרורות, לפיו תאים סרטניים ( "זרעים") יכולים רק להקים לעצמם microenvironments איבר proliferatein המייצרים גורמים מולקולריים מתאימים ( "אדמה ") 8. כמעט מאה שנה מאוחר יותר, לאונרד וייס תחתלקח מטה-אנליזה של נתוני נתיחה שפורסמו בעבר ואשר תחזיתו של יואינג שגידולים גרורתי רבים שהתגלו בעת הנתיחה נמצאו בפרופורציות הצפויות כי יהיה צפויות אם נקבעו כמיהות איבר גרורתי ידי דפוסי זרימת דם לבד. עם זאת, ב manyinstances היו גרורות פחות או יותר נוצר באתרים מסויימים, יהיה צפוי על ידי גורמים מכניים המוצע של יואינג 9. חשבונות אלה והתיאוריות מראים כי microenvironments איבר מסוים לשחק תפקיד קריטי בדפוסי ההפצה והצמיחה הבאה והישרדות של סרטן רב, כוללים סרטן השד.

מאמצי מחקר בעבר התמקדו בעיקר על גורמים שהתקבלו תאים סרטניים תרומתם כמיהות האיבר שנצפו גרורות סרטן השד 10-12, מחקר קטן אולם יש גורמים בחנו נגזרים microenvironment האיבר שעשויה לספק נישה נוחה להקמהשל גרורות סרטן השד. זאת במידה רבה על האתגרים הטכניים של לימוד מרכיבי המיקרו-סביבת האיבר במבחנה.

המאמר הנוכחי מתאר מערכת מודל מקיף לשעבר vivo לחקר השפעת רכיבים מסיסים של קשרי לימפה, עצמות, ריאות, והמוח על התנהגות גרורתי של תאי סרטן שד אנושיים. מחקרים קודמים תוקפים מערכת מודל זה על ידי ההוכחה כי שורות תאי סרטן השד שונות להציג התנהגות ממאיר תא אונליין ספציפי איבר ספציפי בתגובת תקשורת ממוזג איבר שמתאים שלהם in vivo גרורתי 13 פוטנציאליים. מערכת מודל זה יכול לשמש כדי לזהות ולהעריך גורמים מסיסים ספציפיים הנגזר איבר שעשוי לשחק תפקיד בהתנהגות גרורתי של שד וסוגים אחרים של תאים סרטניים, כוללים השפעות על צמיחה, הגירה, הגבעולי התנהגות, ביטוי גנים, כמו גם זיהוי שלמטרות טיפוליות פוטנציאליות חדשות לסרטן. זוהי מערכת מודל vivo לשעבר הראשון, שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד את ההתנהגות גרורתי איבר ספציפי בפירוט כדי להעריך את התפקיד של גורמים מסיסים הנגזרות איבר נהיגה לתהליך של גרורות סרטן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל המחקרים בבעלי חיים נערכו בהתאם להמלצות של המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים, תחת הפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת המשנה השתמש בבעלי חיים באוניברסיטת המערבי.

1. בידוד איברים (ריאות, מוח, עצם, הלימפה)

  1. הכן ארבעה צינורות חרוטי 50 מ"ל סטרילי (אחד עבור כל איבר להיות מבודדת) המכיל כ 30 מ"ל של תמיסת מלח שנאגרו פוספט סטרילית (PBS). טרום לשקול צינור אחד של PBS באמצעות משקל אלקטרוניות.
  2. להרדים 6-12 בשבוע עכבר ישן משאיפת CO 2. עכברים יש להשאיר בתא CO 2 למשך כ 1 - 2 דקות או עד העכבר מפסיק לזוז ונשימה. המתת חסד מוצלחת ניתן אישור נוסף על ידי חוסר דופק כאשר בדקו באופן ידני עם אצבע. הימנע נקע בצוואר רחם כשיטה זה עלולה לגרום לפריצת כלי דם של הצוואר המוביל לקושי הסרת בלוטות הלימפה בבית השחי.
    הערה: מחקרים קודמים המשמשים במיוחדעכברים עירום נשי בריא, HSD: athymic Nude- Foxn1 נו 13.
  3. במנדף בתרבית רקמה סטרילית, במקום את העכבר על גבו על כרית קצף פוליסטירן, להפיץ את הגפיים ולהשתמש סיכות כדי לשמור אותם במקום.
  4. בעזרת מלקחיים ומספריים סטרילי, לחתוך את עור הבטן על קו האמצע על אברי המין ופצע כלפי מעלה לכיוון הפה. משוך בעדינות בחזרה את עור הבטן מן שרירי הבטן ואת הסיכה במקום על משטח קצף פוליסטירן.
  5. אתר את בית השחי, הזרוע, ואת בלוטות הלימפה מפשעתי.
    הערה: בלוטות הלימפה בדרך כלל מוקפים רקמת שומן. בלוטות הלימפה מפשעתי הם הקלים ביותר לאיתור כפי שהם מצאו שטחי בצומת של שני כלי דם על עור הבטן משוך לאחור. בלוטות בית השחי והלימפה הזרוע נמצאות עמוקות בתוך הרקמה ודורשות תמרון עדין של רקמות.
    1. לאחר שאיתרת את בלוטות הלימפה, השתמש במספריים בעדינות ובזהירות לחתוך את לימפה לאdes מהעור, שומן וכלי ולהסיר אותם מן העכבר. כדי לאשר דיסקציה נכונה, לגלגל את המלקחיים על הרקמה שהוסרה. אם גוש קשה קיים כאשר מתגלגלים מלקחיים על הרקמות, ולאחר מכן לימפה סבירה הוסרה בהצלחה.
    2. מניחים בלוטות לימפה שהוסרו ב PBS קר כקרח.
  6. באמצעות מלקחיים ומספריים, לפתוח את חלל הבטן על ידי חיתוך דרך דופן הבטן נחשף בתנועה כלפי מעלה לכיוון החזה. בזהירות לחתוך דרך עצם החזה, חושף את חלל בית החזה.
  7. אתר את הסרעפת מתחת הריאות לחתוך את הסרעפת. זה צריך למשוך לכיוון הצלעות בשל מתח.
  8. הרם את הריאות מתחת וחתך את הרקמה הבסיסית כלפי קנה הנשימה. זה מאפשר לריאות להסירו בחופשיות את חלל בית החזה. הסר את הלב והריאות כמקשה אחת ומניחים PBS קר כקרח. הלב ניתן להסיר מהריאות כאן או ממש לפני שקילת שלב 2.
  9. הסר אתסיכות, שמירה על העכבר במקום על משטח קצף פוליסטירן. סובבו את העכבר מעל לחתוך את העור של כל הגב התחתון הדרך מול ירך אל ירך.
  10. באמצעות פיסת סטרילית של גזה להחזיק את פלג הגוף העליון של העכבר, לקלף את העור האחורי של העכבר על הרגליים וכפות הרגליים של העכבר.
  11. שימוש באותה פיסת גזה סטרילי, להחזיק את הרגל התחתונה במקום, בזהירות לשבור את מפרק הקרסול של הרגל העכבר לקלף את העור מעל המפרק proximally כלפי מפרק הברך.
  12. בעזרת מספריים, להסיר את השוקה ללא מפרק הברך ומניחים PBS קר כקרח.
  13. חזור על שלבי 1.11) 1.12) עם איבר הפוך.
  14. בעזרת מלקחיים, להחזיק את הירך במקום, לחתוך משם לרקמות שרירות באמצעות המספריים להסיר את עצם הירך, הצבתו בקרח הקר PBS.
  15. חזור על שלב 1.14) עם איבר הפוך.
  16. באמצעות יצירה חדשה של גזה סטרילי, להחזיק את הראש של העכבר במקום. בעזרת מלקחיים ומספריים, להסיר את העור בעדינות כדי לחשוף את היםכול. בעזרת מספריים, לחתוך את הגולגולת העורפית בזהירות מהמרכז העליון בקו ישר וכלפי מטה כדי לחשוף את המוח האחורי.
  17. בעזרת מלקחיים, סקופ מתחת למוח לכיוון הקדמי והסר את המוח כולו. מניחים את המוח ב PBS קר כקרח.
  18. חזור על שלבים 1.1) ל 1.17) עבור ארבעה עכברים לפחות.

2. איברים שקילים

  1. בעקבות בידוד איברים, לשקול כל צינור PBS המכיל ריאות רקמת המוח באמצעות משקל אלקטרוניות.
  2. חשב את ההבדל במשקל על ידי הפחתת המשקל טרום בידוד (PBS בלבד) מן המשקל של הצינור + איברי PBS (ריאות ומוח).
  3. לקבוע את כמות תקשורת צריכה resuspend שברי רקמה מפער המשקל המחושב.
    הערה: ריאות רקמת המוח היא משקל מתוקנן לפי resuspension בתוך 4: יחס רקמות (כרך / WT): 1 מדיה.

דור 3. Lung- ואת מוח מדיה אוויר

  1. בחולצת סטריליברדס נושא התרבות, להפוך צינורות PBS המכילים ריאות או מוח שלוש פעמים כדי להסיר דם שיורית מאיברים לשאוב PBS המכילים דם. חזור עם קר PBS הטרי עד הפתרון נראה ברור ומובן ללא ראיות דם.
  2. מניח ריאות ומוח בצלחות פטרי זכוכית נפרדות 60 מ"מ 2. באמצעות שני להבי אזמל סטרילי, ריאות בשר טחונות או מוח על ידי החיתוך הלוך ושוב מספר פעמים עד שברי רקמה כ ~ 1 מ"מ 3 בגודל.
  3. שברי הרקמה Resuspend בנפח המתאים (נקבע בעבר בשלב 2.3) של בינוני של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM): התקשורת F12 בתוספת 1x מרוכז תוספת mitogen ו פניצילין (50 מיקרוגרם / מ"ל) / סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מ"ל).
  4. להוסיף רקמת ריאה או המוח מושעה שבר כדי אחד טוב של צלחת 6 באר.
  5. דגירה שברי רקמה בתקשורת במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. לאחר דגירה, לאסוף מותנה מדיה לכל רקמות further לדלל על ידי הוספה שלושה כרכים מקבילים של תקשורת הטריה צינור חרוטי 50 מיליליטר.
  6. צנטריפוגה XG ב 1000 ב מדיה בדילול מותנית עבור כל איבר על 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי להסיר שאריות רקמה גדולות. איסוף supernatant התקשורת ולסנן דרך פילטר מזרק 0.22 מיקרומטר.
  7. ברכת מותנית תקשורת מכל איבר (כלומר., ריאות עם ריאות ומוח עם מוח) מעכברים מרובים לתת דין וחשבון על השתנות עכבר אל עכבר. Aliquot ולאחסן מותנה התקשורת ב -80 ° C עד השימוש.

דור 4. של מח העצם ממוזג מדיה

  1. במנדף בתרבית רקמה סטרילית, לקצץ רקמה עודפת מהעצם ולהסיר אפיפיזות (חתיכות סוף) מהעצמות במספריים.
  2. באמצעות חלל מדולרי 27 ½ מחט G, סומק של עצמות ידי דחיפת 1 מ"ל של PBS דרך מרכז כל עצם. זה יאפשר לך לאסוף תאי סטרומה מח עצם (BMSC) לתוך צינור טרי המכיל PBS.
  3. צנטריפוגה ב 1,000 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C ולשטוף BMSC פעמים עם PBS. בתאי סטרומה מח עצם Resuspend ב 20 מ"ל של התקשורת צמיחת תאים העצם סטרומה (DMEM: התקשורת F12 בתוספת 1x מרוכז תוספת mitogen, פניצילין (50 מיקרוגרם / מ"ל) / סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מ"ל) ו בסרום עוברי 10% Boven (FBS) ).
  4. פלייט 10 מ"ל של תאי סטרומה מח עצם resuspended ב בבקבוק T75 אחד.
    הערה: שלב ותאי צלחת מכל 2 עכברים בכל בבקבוק T75; במשך ארבעה עכברים, שתי צלוחיות T75 נדרשות (כ 1 x 10 7 תאים / בקבוקון).
  5. דגירת תאי סטרומה מח עצם בתקשורת צמיחת תא עצם סטרומה למשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. לאחר דגירה, להסיר התקשורת משני T75 צלוחיות והכניסו בבקבוק T75 חדש, תווית הבקבוק הזה כמו "לרחפן Flask". הוסף מדיה צמיחת תאי העצם סטרומה טריה 2 צלוחיות קודמות דגירה כל 3 צלוחיות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  6. לאחר התאים מגיעים כ 70% confluency (כ 5 - 7ימים) תאי מעבר. לשם כך, הסר בינוני לשטוף את התאים פעמיים עם PBS (3 מ"ל כל אחד לשטוף). הסר PBS ולהוסיף 3 מ"ל של תמיסת טריפסין / EDTA, הבטחת טריפסין שמכסה את כל פני השטח של הבקבוק. לאחר התאים להרים את הבקבוק (~ 2 - 3 דקות), להפסיק trypsinization תגובה על ידי הוספת 3 מיליליטר תקשורת צמיחת תאי עצם סטרומה). צנטריפוגה 900 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C, להשליך תקשורת, ותאי resuspend ב 10 מיליליטר של תקשורת צמיחת תאים הטריה עצם סטרומה.
  7. תאי ברכה מכל הצלוחיות והמעבר 1: 5 לשלוש צלוחיות T75 חדשות לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. לאחר תאים שוב להגיע ל -70%, וחזור על שלב 4.6 וברכה ומעבר לכל התאים החסידים בשנית. Re-צלחת כל התאים ארבע צלוחיות T75 דגירה 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. תקשורת צמיחת עצם תא סטרומה אמורה לשמש עבור כל השלבים.
  8. אפשר תאים מגיעים למפגש, לשטוף תאים שלוש פעמים עם PBS ולהוסיף תקשורת אוסף תא עצם סטרומה (DMEM: F12 תקשורת + 1x su mitogen המרוכזpplement + פניצילין (50 מיקרוגרם / מ"ל) / סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מ"ל); 10 מ"ל / T75), ולוודא כי המדיה הזו היא ללא FBS. אסוף התקשורת עצם ממוזג מח 72 שעות מאוחר יותר, לסנן דרך 0.22 מיקרומטר מסנן, בריכה, aliquot, ולאחסן ב -80 ° C עד השימוש.
  9. אם תרצה, לאשר את הפנוטיפ של תאי סטרומה מבודדים מח עצם (BMSC) באמצעות נוגדנים כנגד SCA-1 עכבר, CD105, CD29, CD73 ו, CD44, באמצעות זרימת תקן cytometry טכניקות כפי שתואר לעיל 13.

דור 5. לימפה צומת ממוזגת מדיה

  1. במנדף בתרבית רקמה סטרילית, ללא מרחב צינור PBS המכיל בלוטות הלימפה שלוש פעמים כדי להסיר דם שיורית בלוטות הלימפה לשאוב PBS הדמים. חזור עם קר PBS הטרי עד הפתרון נראה ברור ומובן ללא ראיות דם.
  2. מניחים בלוטות הלימפה ב -60 מ"מ 2 זכוכית בצלחות פטרי. באמצעות שני להבים אזמל סטרילי, בלוטות לימפה בשר טחון על ידי חיתוך הלוך ושוב מספר פעמים עד tissuשברי דואר הם כ 1 מ"מ 3 בגודל.
  3. בתוך צינור חרוטי, שברי הרקמה resuspend ב 10 מ"ל של מכון ממוריאל פארק רוזוול 1640 (RPMI1640) התקשורת השלימו עם פניצילין (50 מיקרוגרם / מ"ל) / סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מ"ל), 5 x 10 -5 M סטרילי β-mercaptoethanol ( 1.75 μl / 500 מ"ל מדיה) ו -10% FBS.
  4. צנטריפוגה ב 900 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C ו resuspend כל התאים 30 מ"ל התקשורת. הוסף 5 מ"ל מדיה / היטב צלחת 6-היטב דגירה במשך 7 ימים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  5. לאחר דגירה 7 יום, להשליך התקשורת, לשטוף תאים חסיד עם 5 מ"ל PBS חם ולהוסיף 5 מ"ל התקשורת טרי היטב כל אחד. אפשר לתאים לגדול כדי confluency (כ 5 - 7 ימים), trypsinize, בריכת כל התאים, ומעבר כמתואר בשלב 4.6. Re-צלחת תאים לצלחת 6 באר. חזור על פעולה זו שלוש פעמים.
  6. אחרי שלושה קטעים, ולאפשר לתאים לגדול confluency, לשטוף בארות שלוש פעמים עם PBS ולהוסיף 2 מ"ל / היטב DMEM: F12 + 1xתוספת ו פניצילין mitogen מרוכז (50 מיקרוגרם / מ"ל) / סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מ"ל), כדי להבטיח את המדיה הזו היא ללא FBS. אסוף התקשורת ממוזג בלוטת לימפה לאחר 72 שעות, בריכה, aliquot, ולאחסן ב -80 ° C עד השימוש.
  7. אם תרצה, לאשר את הפנוטיפ של תאים סטרומה בלוטת לימפה מבודדים (LNSC) באמצעות נוגדנים כנגד CD45 העכבר gp38, באמצעות זרימה תקן cytometry טכניקות כפי שתואר לעיל 13.

6. שימוש מדיה איברים ממוזגים עבור מבחני Downstream קשורים להתנהגות גרורתי של תאי הסרטן

  1. ברגע התקשורת ממוזג האיבר נוצר כמתואר בשלבי 1 - 5, ולהשתמש בו כדי לבצע תא במורד זרם שונה מבחני ביולוגיה מולקולריים כדי לקבוע את השפעתם של גורמים מסיסים הנגזר איבר על ההתנהגות גרורתי של תאים סרטניים. דוגמאות של מבחני תקן (תארו במקום בספרות) כוללות מערכי חלבון 13, מבחני צמיחה הסלולר 13, הגירה הסלולר מבחני 13, tumorsphere היווצרות 14, ו RT-PCR 15. תקשורת הבסיס המקורית השתמשה כדי ליצור את התקשורת ממוזג איבר (כלומר, בלתי מותנית DMEM:. תקשורת F12 בתוספת 1x מרוכזת mitogen כתוספת פניצילין (50 מיקרוגרם / מיליליטר) / סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מיליליטר) אמור לשמש כביקורת שלילית .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הדור של מדיה איברים ממוזג

דיאגרמה סקירה / סכמטי של התהליך של בידוד איברי דור התקשורת המותנה מוצג באיור 1, עם דימויים מצולמים נציג של ההליך שמוצג באיור 2. יצוין כי כאשר בפרוטוקול זה היה ראשון בפיתוח, כבד נכלל בניתוח שלנו כי זה אתר משותף של גרורות סרטן השד. עם זאת, בשל הכמות הגדולה של פרוטאזות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

גרורה היא תהליך מורכב שבאמצעותו סדרה של אירועים הסלולר היא בסופו של דבר אחראי על גידול פלישת רקמות ומרוחק ההקמה 4,30,31. מערכת מודל vivo לשעבר המוצגת כאן יכולה להיות מנוצלת כדי ללמוד שני היבטים חשובים של התקדמות גרורתי: ביות תאים סרטנית או הגירת איבר מסוים ( "להגיע לשם") וגידול האיבר ( "גדלתי שם"). מחקרים רבים בעבר התמקדו בזיהוי מאפיינים מולקולריים מפתח הקשורים לתאי הסרטן עצמם שתורמים לתהליך הגרור. לדוגמא, עבודה שנעשתה על ידי הקבוצה של ג'...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הקנדית לסרטן השד באזור אונטריו, הקרן הקנדית לחדשנות (מס' 13199), ותמיכת תורמים מג'ון ודונה בריסטול באמצעות קרן מדעי הבריאות של לונדון (ל-A.L.A). תמיכה במלגות ובמלגות ניתנה על ידי תוכנית המלגות לתארים מתקדמים של אונטריו (מחוז אונטריו, ל-G.M.P. ו-J.E.C.), תוכנית המלגות לתואר שני בקנדה (ל-M.M.P), המכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR) - תוכנית הכשרה אסטרטגית (ל-M.M.P., G.M.P ו-J.E.C) והיחידה לחקר סרטן השד התרגומי של פמלה גרינאוויי-קולמאייר בתוכנית הסרטן האזורית של לונדון (ל-M.M.P., G.M.P., J.E.C. ו-Y.X.). A.L.A. נתמך על ידי פרס החוקר החדש של CIHR ופרס החוקר המוקדם ממשרד המחקר והחדשנות של אונטריו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
50 מ"ל צינורות חרוטייםThermo Scientific (Nunc)339652שמור על סטרילי
1x מי מלח עם חוצץ פוספטThermoFisher Scientific10010-023
עכברים עירומיםHarlan LaboratoriesHsd:Athymic Nude-Foxn1nuלשימוש בגיל 6 - 12 שבועות
כרית קצף פוליסטירןN/AN/A N/Aניתן להשתמש במכסה המושלך (~ 4 x 8 אינץ' או יותר) של מיכל משלוח קצף פוליסטירן למטרה זו. לעקר על ידי ניגוב באתנול.
מלקחייםכלי מדע עדינים11050-10שמור מספריים סטריליים
כלי מדע עדינים14058-11שמור על
רפידות גזהפישר סיינטיפיק22-246069שמור סטרילי
60 מ"מ2 צלחות פטרי זכוכיתסיגמא-אולדריץ'CLS7016560
להבי אזמלפישר סיינטיפיקS95937Aשמור על DMEM סטרילי
: F12Life Technologies21331-020חם ב 37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש, יש לשמור על סטרילי 
1x Mito + Serum ExtenderBD Biosciences355006מכונה "תוסף מיטוגן מרוכז" בכתב היד. שמור על
פניצילין-סטרפטומיצין סטרילי (10,000 U/ml)Life Technologies15140-122שמור על
מכון הזיכרון רוזוול פארק סטרילי 1640 (RPMI 1640)Life Technologies11875-093חם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש, יש לשמור על סטרילי 
סרום בקר עובריSigma-AldrichF1051-500MLשמור על
תמיסת טריפסין/EDTAThermoFisher ScientificR-001-100חם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש, יש לשמור על סטרילי 
צלחות תרבית רקמות 6 בארותThermo Scientific (Nunc)140675שמור על סטרילי
0.22 μ מסנני מזרקm Sigma-AldrichZ359904
צלוחיות תרבית רקמות T75Thermo Scientific (Nunc)178905שמור על
Transwellsסטרילי Sigma-AldrichCLS3464שמור על סטרילי, השתמש לבדיקות נדידה
נגד עכבר Sca-1R& D SystemsFAB1226Pלשימוש ב-10 ומיקרו; l/106 תאים
נגד עכבר CD105R& D SystemsFAB1320Pלשימוש ב-10 ומיקרו; l/106 תאים
נגד עכבר CD29R& D SystemsFAB2405P-025שימוש ב-10 ומיקרו; l/106 תאים
נגד עכבר CD73R& D SystemsFAB4488Pלשימוש ב-10 ומיקרו; l/106 תאים
נגד עכבר CD44R& שימושב-D Systems MAB6127-SPב-0.25 ומיקרו; g/106 תאים
נגד עכבר CD45eBioscience11-0451-81שימוש ב-5 ומיקרו; l/106 תאים
נגד עכבר gp38eBioscience12-5381-80שימוש ב-10 ומיקרו; l/106 תאים
&בטא;-מרקפטואתנול סיגמא-אולדריץ'M6250 שמור על סטרילי
מערכי חלבוניםRayBiotech Inc.AAM-BLM-1-2השתמש במערך אחד לכל תנאי מדיה (כולל בקרה שלילית), בשלוש עותקים
שמור על סטריליים סטריליות שמור על סטריליים סטרילית שמור על סטריליות

מקורות

  1. Canadian Cancer Statistics. Canadian Cancer Society. , Toronto, ON. Available from: www.cancer.ca (2014).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2015. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
  3. Fidler, I. J. The organ microenvironment and cancer metastasis. Differentiation. 70 (9-10), 498-505 (2002).
  4. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
  5. Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. J Clin Oncol. 28 (20), 3271-3277 (2010).
  6. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
  7. Ewing, J. Neoplastic Diseases: A Treatise on Tumors. Am J Med Sci. 176 (2), 278(1928).
  8. Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. 1889. Cancer Metastasis Rev. 8 (2), 98-101 (1989).
  9. Weiss, L. Comments on hematogenous metastatic patterns in humans as revealed by autopsy. Clin Exp Metastasis. 10 (3), 191-199 (1992).
  10. Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
  11. Kang, Y., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-549 (2003).
  12. Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
  13. Chu, J. E., et al. Lung-Derived Factors Mediate Breast Cancer Cell Migration through CD44 Receptor-Ligand Interactions in a Novel Ex Vivo System for Analysis of Organ-Specific Soluble Proteins. Neoplasia. 16 (2), 180-IN127 (2014).
  14. Pio, G., Piaseczny, M., Allan, A. The Role of Bone-Derived Osteopontin in the Migration and Stem-Like Behavior of Breast Cancer Cells. AACR. , 2015 (2015).
  15. Deepak, S., et al. Real-Time PCR: Revolutionizing Detection and Expression Analysis of Genes. Curr Genomics. 8 (4), 234-251 (2007).
  16. Hammerschmidt, S. I., et al. Stromal mesenteric lymph node cells are essential for the generation of gut-homing T cells in vivo. J Exp Med. 205 (11), 2483-2490 (2008).
  17. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  18. Baddoo, M., et al. Characterization of mesenchymal stem cells isolated from murine bone marrow by negative selection. J Cell Biochem. 89 (6), 1235-1249 (2003).
  19. Furger, K. A., Menon, R. K., Tuck, A. B., Bramwell, V. H., Chambers, A. F. The functional and clinical roles of osteopontin in cancer and metastasis. Curr Mol Med. 1 (5), 621-632 (2001).
  20. Radisky, E. S., Radisky, D. C. Matrix metalloproteinases as breast cancer drivers and therapeutic targets. Front Biosci (Landmark Ed). 20, 1144-1163 (2015).
  21. Radisky, E. S., Radisky, D. C. Matrix metalloproteinase-induced epithelial-mesenchymal transition in breast cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 15 (2), 201-212 (2010).
  22. Radisky, E. S., Radisky, D. C. Stromal induction of breast cancer: inflammation and invasion. Rev Endocr Metab Disord. 8 (3), 279-287 (2007).
  23. Kakinuma, T., Hwang, S. T. Chemokines, chemokine receptors, and cancer metastasis. J Leukoc Biol. 79 (4), 639-651 (2006).
  24. Zlotnik, A. Chemokines and cancer. Int J Cancer. 119 (9), 2026-2029 (2006).
  25. Schlesinger, M., Bendas, G. Vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)--an increasing insight into its role in tumorigenicity and metastasis. Int J Cancer. 136 (11), 2504-2514 (2015).
  26. Cook, K. L., Shajahan, A. N., Clarke, R. Autophagy and endocrine resistance in breast cancer. Expert Rev Anticancer Ther. 11 (8), 1283-1294 (2011).
  27. Singh, P., Alex, J. M., Bast, F. Insulin receptor (IR) and insulin-like growth factor receptor 1 (IGF-1R) signaling systems: novel treatment strategies for cancer. Med Oncol. 31 (1), 805(2014).
  28. Lee, S. H., Jeong, D., Han, Y. S., Baek, M. J. Pivotal role of vascular endothelial growth factor pathway in tumor angiogenesis. Ann Surg Treat Res. 89 (1), 1-8 (2015).
  29. Erdmann, R. B., Gartner, J. G., Leonard, W. J., Ellison, C. A. Lack of functional TSLP receptors mitigates Th2 polarization and the establishment and growth of 4T1 primary breast tumours but has different effects on tumour quantities in the lung and brain. Scand J Immunol. 78 (5), 408-418 (2013).
  30. Chambers, A. F., et al. Steps in tumor metastasis: new concepts from intravital videomicroscopy. Cancer Metastasis Rev. 14 (4), 279-301 (1995).
  31. Chiang, A. C., Massague, J. Molecular basis of metastasis. N Engl J Med. 359 (26), 2814-2823 (2008).
  32. Gupta, G. P., et al. Identifying site-specific metastasis genes and functions. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 70, 149-158 (2005).
  33. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123, (Pt 24) 4195-4200 (2010).
  34. Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).
  35. Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (12), 786-801 (2014).
  36. Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).
  37. Psaila, B., Lyden, D. The metastatic niche: adapting the foreign soil. Nat Rev Cancer. 9 (4), 285-293 (2009).
  38. Lee, R. H., Oh, J. Y., Choi, H., Bazhanov, N. Therapeutic factors secreted by mesenchymal stromal cells and tissue repair. J Cell Biochem. 112 (11), 3073-3078 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Flow Cytometric AnalysisRT qPCR
דור של איברים ממוזגים מדיה ויישומים עבור לימוד השפעות איבר ספציפי על התנהגות סרטן שד גרורתי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.