מאמר שיטה

תאי גזע מהונדסים חסינות בהתבסס נגד HIV זיהום במודל העכבר האנושי

DOI:

10.3791/54048

⸱

2 ביולי 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את השיטות לבניית מודל עכבר מח עצם/כבד/תימוס אנושי עם חסינות מהונדסת מבוססת תאי גזע נגד זיהום HIV.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עם ההתפתחות המהירה של טיפולים גן מבוססי תאי גזע נגד HIV, יש לחיצה דרישה במודל חיה ללמוד את הבידול hematopoietic ותפקוד מערכת החיסון של תאים מהונדסים גנטית. The-מוח העצם האנושי / כבד / קורנית (BLT) במודל של עכברים מאפשר כינון מחדש מלא של מערכת חיסון אנושית בפריפריה, הכוללת תאי T, תאי B, תאי NK ומונוציטים. השתל הרתי האדם גם מאפשר לבחירה הרתי של תאי T ברקמות הרתי עצמיות. בנוסף המחקר של הידבקות ב- HIV, המודל עומד ככלי רב עצמה כדי ללמוד בידול, פיתוח פונקציונלי של תאים שמקורם בתאי גזע hematopoietic (HSCs). כאן נתאר את בניית אנושי ללא השמנת יתר סוכרת (NOD) -severe immunodeficient משולב (SCID) בנוקאאוט שרשרת גמא -common (ג γ - / -) -Bone מח / כבד / קורנית (NSG-BLT) עכברים עם HSCs transduced עם קולטן אנטיגן chimeric CD4 (CD4CAR)וקטור lentivirus. אנו מראים כי CD4CAR HSCs יכול להבחין בהצלחה לתוך שושלות מרובות יש פעילות אנטי HIV. מטרת המחקר היא להדגים את השימוש במודל עכבר NSG-BLT כמודל in vivo לחסינות מהונדסת נגד HIV. ראוי לציין, כי lentivirus ורקמות אדם משמשים, ניסויים וניתוחים צריכים להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגי Class II בתוך 2 רמת בטיחות ביולוגית (BSL2) עם אמצעי זהירות מיוחדת מתקן (BSL2 +).

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות ההצלחה של טיפול אנטי retroviral בשילוב, הידבקות ב- HIV היא עדיין מחלה לכל חיים. התגובה החיסונית התאית נגד HIV משחקת תפקיד חשוב מאוד מצליח לשלוט בהתרבות נגיף. התקדמות מניפולציה בתאי גזע אפשרה ההתפתחות המהירה של ריפוי גנטי גישות ל- HIV טיפול 1-3. כתוצאה מכך, חשוב יש במודל חיה נאה המאפשר במחקר vivo של היעילות של טיפולים מבוססי תאים נגד HIV.

עבודה עם HIV במודלים של בעלי חיים הוא מסובך בשל העובדה כי הנגיף מדביק תאים אנושיים בלבד. כדי לעקוף מגבלה זו, מדענים נקטו באמצעות מודלים מחלה כמו וירוס הכשל החיסוני סימיאן (SIV) ב קופי רזוס 4,5. למרבה הצער, יש מגבלות עיקריות במודל זה בשל ההבדלים האינהרנטיים בין זנים ואת ההבדלים בין SIV ו- HIV. בנוסף, רק מאוד מתקנים מיוחדים הם גapable לתמוך עבודה עם פרימטים לא אנושיים וכל מקוק דורשת השקעה גדולה. לפיכך, יש צורך דחוף מודל זה מנצל את מערכת החיסון האנושית, אשר רגישה זיהום HIV / בפתוגנזה, והוא פחות כלכלי מונע.

המגזר השקלי הלא צמוד שמנים סוכרתית (NOD) -severe immunodeficient משולב (SCID) בנוקאאוט שרשרת גמא -common (ג γ - / -) (או NSG) דם / כבד / קורנית (BLT) במודל העכבר האנושי הוכח ויותר להיות כלי חשוב ללמוד הידבקות ב- HIV. ידי השתלת תאי גזע hematopoietic (HSCs) ו התימוס העוברית, העכברים מסוגלים לפתח לשחזר מערכת חיסון אנושית 1-3. סוג אחד של ריפוי גנטי מבוסס תאי גזע כרוך 'הפניית' תאי T היקפי למקד HIV על ידי תכנות מחדש בתאי גזע hematopoietic (HSCs) להתמיין לתאי T אנטיגן ספציפי. הראינו בעבר כי HSCs הנדסה עם מחדש T תאים ספציפיים מולקולרית משובטים נגד HIVceptor (TCR) נגד אפיטופ SL9 (חומצת אמינו 77-85; SLYNTVATL) של HIV-1 Gag יכול להפנות תאי גזע לתוך להרכיב תאי הבוגרים T מדכאים תרבות נגיף ה- HIV במודל עכבר NSG-BLT האנושי 6. האזהרה של שימוש TCR מולקולרית משובטת היא שזה מוגבל אנטיגן לויקוציטים אנושי ספציפי (HLA) תת סוג כי יגביל את היישום של טיפול זה. קולטנים אנטיגן Chimeric (CAR), מצד שני, יכול להיות מיושם אוניברסלית לכל תת HLA. מחקרים ראשוניים בוצעו ניצול מכונית נבנתה עם התחומים התאיים ו הטרנסממברני של CD4 האדם התמזג ζ איתות תאיים מושלם של CD3 (שמכונה CD4ζCAR). CD4ζCAR הביע על תאי CD8 T יכול לזהות מעטפת HIV ו לעורר תגובת תא T ציטוטוקסיים כי הוא דומה לזה מתווך על ידי קולטן תא T 7. אנחנו הוכחנו לאחרונה כי HSCs אדם יכול להיות שונה עם CD4ζCAR, אז מה שיכול להתמיין li hematopoietic המרובהneages, כולל תא פונקציונלי T מסוגל לדכאה שכפול HIV במודל העכבר האנושי 8. עם ההתקדמות המהירה טיפולים הקולטן לאנטיגן כימרי לסרטן 9, ואת האפיון המתמשך של נוגדנים מנטרלים רחבים חזקים 10-12 נגד HIV המאפשר בניית מכוניות נוגדני שרשרת אחת, זה נתפש שרבים בונים מועמד חדש, בנוסף CD4ζCAR , יופק ונבדקו על ריפוי גנטי מבוסס תאי גזע במחלות איידס ומחלות אחרות. בנוסף, במודל עכבר NSG-BLT האנושי המכיל מכוניות אנטיגן ספציפי אלה יכול גם לספק כלי שימושי לבדיקת תגובות תא T אנושיות מקרוב in vivo. חשוב לציין, הפרוטוקול שלנו נבדל שיטות שתוארו קודם לבניית מואנשים של עכברי BLT 13-15 בכך HSCs ב תערובת חלבונים דביקה משמש במקום הגזעי בכבד עובר 16. פרוטוקול זה מתאר: 1) בניית והרוחעכברי BLT zed מהונדסים עם CD4ζCAR; ו -2) אפיון של בידול של תאים מהונדסים גנטית; ו -3) אפיון של פונקציונליות של תאים מהונדסים גנטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הצהרת אתיקה: רקמה עוברית אדם התקבלה מתקדמים Biosciences משאבים או Novogenix ו הושגה ללא פרטים מזהים ולא צריכת אישור IRB לשימושו. מחקר רפואי בבעלי חיים המתואר בכתב היד הזה בוצע בכפוף לאישור בכתב של אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס, ו (UCLA) ועדת המחקר בבעלי חיים (ARC) בהתאם לכל מדינה פדרלית, והנחיות המקומי. באופן ספציפי, מחקרים אלה בוצעו תחת הקפדה על הנחיות המדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה של המועצה הלאומית למחקר ואת ההסמכה וההנחיות של האגודה למען הערכה וההסמכה של טיפול בבעלי חי מעבדה (AALAC) בינלאומי תחת UCLA ARC פרוטוקול מספר 2010-038-02B. כל הניתוחים בוצעו תחת קטמין / xylazine והרדמת isoflurane וכל המאמצים שנעשו כדי למזער את כאב חי ואי נוחות.

1. בניית עכברים מואנש תכנון הנדסי עם CD4 Chimeric Antigen קולטן

  1. עיבוד עוברי התימוס בידוד CD34 + HSCs מהכבד עוברי
    1. עיבוד קורנית
      1. לשטוף בעדינות התימוס ב בופר פוספט (PBS), pH 7.4, צינור חרוטי 15 מ"ל. שלב לשטוף חזור על 3 - 4 פעמים.
      2. הוסף 7 מ"ל RPMI התקשורת + 10% FBS + פן / סטרפטוקוקוס. למזוג את הכל לתוך צלחת פטרי 100 מ"מ סטרילי.
      3. השתמש אזמלים לחתוך את התימוס לחתיכות קטנות של כ 1 מ"מ 2. מניחים כל פיסת התימוס יחיד בתוך באר יחיד על צלחת 96-היטב. השתמש מעוקל מלקחיים בוטים בעת העברת חתיכות התימוס אל הצלחת 96-היטב.
        1. הוספת כמות קטנה של תקשורת (100 - 200 μl) לכל הבארות כך הרקמות לא יבשות. דמיינו תחת מיקרוסקופ (יש thymi האונות אמור להיראות שקים של תאים).
          הערה: לבטל את כל חלקים שנראים מפוקפקים בכל דרך;יש לעתים קרובות רקמת חיבור וזה לא צריך להיות מושתל.
      4. מוציא את החתיכות אשר-התימוס ומניח כולם לתוך בקבוק תרבית תאי T25. הוסף 7 מ"ל RPMI התקשורת השלימו עם 10% FBS ו 450 מיקרוגרם / מ"ל ​​של piperacillin / tazobactam ו amphotericin B. הבקבוק רוק בעדינות לתערובת. תרבות לילה הבקבוק ב 37 ºC / 5% CO 2.
        הערה: צעד זה נדרש על מנת למנוע זיהום חיידקים של הרקמה.
      5. (שלב אופציונלי) להקפיא את התימוס לשימוש עתידי. לאזן את הנתחים ב 90% סרום האדם AB עם 10% sulfoxide דימתיל (DMSO) במשך 10 דקות. להקפיא אותם בקצב של 1 ºC / min -50 ºC, אז קירור מהיר כדי -150 ºC. כאשר מוכן להפשיר, להפשיר במהירות באמבט מים 37 ºC בעדינות לשטוף 3x במדיה RPMI להשלים ללא DMSO.
    2. עיבוד כבד
      1. לשטוף בעדינות את הכבד PBS בצינור חרוטי 50 מ"ל. שלב לשטוף חזור על 3 - 4 פעמים.
      2. הוסף 10 מ"ל (Dulbecco Modified של Iscove של Media) מדיה IMDM אל צינור חרוטי 50 מ"ל. למזוג את הכל לתוך צלחת פטרי 100 מ"מ סטרילי.
      3. Homogenize רקמת הכבד באמצעות שני ניתוחים. חותכים את הכבד לחתיכות קטנות של כ -3 מ"מ 2. לגזור וזורק את כל רקמת חיבור לבנה.
      4. השתמש 10 מזרק מיליליטר מצויד במחט 16 מד בוטה לקחת את השברים כבדים ומדיה. ואז להעביר צינור חרוטי 50 מ"ל.
      5. Resuspend בעדינות את ההשעיה מדיה ורקמות ולגרש 5-7 פעמים נוספות homogenize לחלוטין את הרקמה.
      6. הכן 10 מ"ל התקשורת IMDM בתוספת אנזימים: 500 U / collagenase מ"ל, 2,400 U / ml hyluronidase, ו -300 U / ml DNase וכן 450 מיקרוגרם / מ"ל ​​piperacillin / tazobactam ו amphotericin B. סנן את התקשורת באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר אז מוסיפים את התקשורת על השעיית הכבד.
      7. כיסוי או צינור חרוטי 50 מיליליטר המכיל את ההשעיה הכבדה וסוגר עם סרט עצמי איטום כגון Parafilm to למנוע הדלפות. סובב ב הכתף צינור בחממה ב 37 ºC למשך 90 דקות.
      8. סנן את השעית התא מתעכלת דרך מסננת תא 100 מיקרומטר לתוך צינור 50 מ"ל טרי.
        הערה: להוסיף PBS על ההשעיה כדי להביא את הנפח הכולל עד 50 מ"ל. פיצול זה לשני צינורות של 50 מ"ל צינורות שכל אחת מהן מכילה 25 מ"ל של תרחיף תאים.
      9. לאט ובעדינות ביסוד התאים בצינור אחד עם 10 מ"ל התקשורת צנטריפוגה צפיפות (למשל, Ficoll). ספין 1,200 XG במשך 20 דקות ללא בלם. הערה: כל צנטריפוגה המוזכרים בפרוטוקול זה נעשה בטמפרטורת החדר (25 מעלות צלזיוס).
      10. מוציאים בזהירות את ממשק (כלומר., באפי מעיל) מהצינור כל והעברה שני צינורות נפרדים 50 מ"ל. תביאו את הנפח של כל צינור של עד ממשק 50 מ"ל עם PBS. ספין ב XG 300 7 - 10 דקות. לשאוב supernatant בזהירות.
      11. מערבב את שני כדורים. שלושה לשטוף יותר פעמים עם 50 מ"ל PBS המכיל 2% FBS. ספין על XG 300 7 - 10 מ 'בכל זמן תוך aspirating את supernatant בזהירות.
      12. Resuspend גלולה ב 50 מ"ל RPMI התקשורת + 10% FBS. ספירת תאים באמצעות hemocytometer בשלב זה לפני שתמשיך מיון התא.
      13. מיין CD34 + תאים מיד באמצעות CD34 מיון קיט (למשל., מיקרו-חרוזים CD34), על פי פרוטוקול של היצרן.
        הערה: לחילופין, תאים יכול להיות מתורבת ב RPMI התקשורת + 10% FBS 1 מיליון / מ"ל ​​לילה.
      14. שמור הוא CD34 + שברי CD34-.
        הערה: בשלב זה, CD34 + ו- CD34- תאים אפשר להקפיא באמצעות Bambanker תקשורת הקפאה או במדיות הקפאה אחרת. להקפיא 1 מ"ל של 4 - 6 x 10 6 CD34 + תאים לכל צינור ולהקפיא 1 מ"ל של 40 - 60 x 10 6 CD34- תאים לכל צינור.
  2. תמרה של CD34 + תאים
    1. לחשב את מספר בארות התמרה נדרשו של צלחת 6 היטב רקמות-תרבות. גם 1 יכול לשמש transduce עד 8 ​​x 10 6 תאים. לכל עכבר BLT, 0.5 x + CD34 10 6 יושתלו יחד עם תאים CD34- ו התימוס מתחת הקפסולה כליות ו -0.5 x 10 תאים 6 CD34 + יהיה מוזרק לווריד. מספר תאי CD34 + להשתמש נקבע על פי מספר העכברים (1 מיליון תאים לכל עכבר).
    2. מעיל את המספר הדרוש של הבארות של התרבות הלא רקמה שטופלו 6-גם צלחת עם 1.25 מ"ל של תמיסת פיברונקטין אנושי רקומביננטי (למשל., Retronectin) (20 מיקרוגרם / מ"ל PBS) לתוך כל טוב. מכסים את הצלחת ולאפשר לו לעמוד במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר בתוך ארון בטיחות ביולוגית נקי.
    3. פתרון פיברונקטין לשאוב מבארות ולהוסיף 1.25 מ"ל של חיץ FACS (PBS עם 4% FBS) זה טוב לחסימת. אפשר הצלחת לעמוד בטמפרטורת החדר (25 מעלות צלזיוס) במשך 30 דקות.
    4. לשאוב FACS חוצץ ובארות לשטוף פעם עם PBS.
    5. שמור PBS בבארות המצופות עד שההצלחה מוכנה לשימוש. אחסן את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה אם לא נעשה שימוש באופן מיידי.
    6. פלייט CD34 + תאים זיהום בינוני (2% אנוש סרום אלבומין בסרום-חינם T-Cell של Yssel בינוני) בבארות מצופה פתרון פיברונקטין (~ 2 x 10 6 תאים / מ"ל) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
    7. השתמש פיפטה להוסיף וקטור lentiviral אל בארות על ריבוי של זיהום (משרד הפנים) בין 2 - 10. בעדינות לערבב דגירה לילה בשעה 37 ºC.
      הערה: כייל של וקטור lentivirus בשימוש צריכה להיקבע מראש.
    8. קציר התאים למחרת בבוקר על ידי גירוד תחתית בעדינות של בארות עם מגרד תא. איסוף תאים ולספור עם hemocytometer בשלב זה.
    9. כדי להכין תאים עבור השתל, לשלב 0.5 x 10 6 transduced CD34 + תאים עם 4.5 x 10 6 CD34- תאים לכל עכבר, aliquot לתוך צינורות 1.5 מ"ל הברגה כובע סטרילי. ספין התאים למטה ב 300 XG כדי גלולה אותם, לשאוב supernatant. ספין אותם שוב XG ב 300 ו לשאוב כל supernatant הנותרים בעזרת פיפטה P10 ו aspirating ca מאודrefully. שמור את הכדורים היבשים על קרח לאורך כל תקופת המחקר. הערה: כדי לוודא את התאים הם קיימא, להשתמש בתאי pelleted ולבצע את הניתוח תוך 2-3 שעות.
    10. כדי להכין תאים להזרקה, ספין 0.5 x 10 6 transduced CD34 + תאים לכל עכבר גלולה אותם, לשאוב supernatant. Resuspend תאי 100 μl RPMI תקשורת לכל עכבר ולשמור על קרח.
    11. כדי לבדוק את יעילות התמרה, aliquot ~ 1 x 10 5 הלא transduced ו transduced CD34 + תאים כל תנאי והתרבות 200 בינוני ציטוקינים μl (RPMI התקשורת עם 10% FBS, בתוספת 100 ng / ml IL-3 האנושי, IL-6 , SCF) בצלחת 96-היטב במשך 5 - 7 ימים ב 37 ºC.
      הערה: תאים המשמשים צעד זה אינו משמשים לניתוח אבל כדי להבטיח התמר כי הוא מוצלח הווקטור אינו רעיל להישרדות תאי גזע והתחדשות. יעילות תמרה ניתן לבדוק על ידי מחפש ביטוי גנים של הווקטור (למשל., GFP & CD4) ולנתח ידי cytometry זרימה.
  3. השתלת רקמות לבנות בעכברים מהונדסים גנטית
    1. באותו היום לפני הניתוח לבצע הקרנת גוף כוללת של עכברי NOD.Cg- Prkdc SCID Il2rg t m1Wjl / SzJ (NSG) נפגע-חיסוניים עם צסיום -137 irradiator ו במינון של 2.7 Gy (270Rad).
      הערה: עכברי NSG הם מדוכאי חיסון קשה. לכן הדיור והתחזוקה שלהם חייב לעמוד בתקן הגבוה ביותר לבריאות מטופלים על ידי אנשי צוות מיומנים.
    2. יוצקים חתיכות ובינוניים התימוס מהבקבוק לתוך צלחת 60 מ"מ. יוצקי PBS לתוך עוד 60 צלחת מ"מ, אשר תשמש כדי לנקות את trochar ולשמור הכליה רטובה.
    3. צ'יל טיפים פיפטה תזוזה חיובית על ידי הצבת אותם צינורות בורג מכסה סטרילי 1.5 מ"ל פתוח על הקרח. שמור על קרח עם כדורי תא יבשי תערובת חלבונים דביקים כגון Matrigel.
      הערה: חשוב לשמור על תערובת חלבונים הדביקה וכל צינורות או טיפיםייגע בזה קר בכל העת עד נטען מחט השתל.
    4. להרדים את העכברים: לשקול עכברים בנפרד ומשקלות שיא; אוזן אגרוף העכברים מספר להם. להזריק אותם intraperitoneally עם 15 μl של קטמין (2.6 מ"ג / מ"ל ​​סליין) / Xylazine (100 מ"ג / מ"ל ​​סליין) לגרם של משקל הגוף). שם העכברים בחזרה בכלוב ולחכות שזה יהיה בהרדמה מלאה.
      הערה: בדוק את רמת ההרדמה של העכבר על ידי כיווץ כפה. אם העכבר נרתע באופן רפלקסיבי, לנהל 25-50% מהסכום המקורי של קטמין / Xylazine כדי להרדים את העכבר נוסף. המתן עד שהוא אינו נרתע באופן רפלקסיבי כדי לבצע את הניתוח.
    5. באמצעות גוזז אוסטר (גילוח), לגלח את אגף שמאל של כל עכבר מהירך אל כתף בין במרכז הגב ואת הבטן. תת עורי להזריק 0.3 מ"ל של Carprofen מדולל (6 מ"ג / ק"ג) לתוך כתפו של חיים או משולש מפשעתי (בור הרגל). באמצעות מקלון צמר גפן, לשים טיפה קטנה של דמעות מלאכותיותעל כל עין ולהניח את העכבר על צידו האחורי בכלוב.
      הערה: הכנה לניתוח הגבל ל בכלוב אחד (כ 4 - 5 עכברים) בכל פעם.
    6. שטוף את הצינורית של מחט שתל 16 מד הסרטן (נקז) עם PBS. בעזרת זוג מלקחיים מעוקלים בוטים, במקום חתיכת התימוס מצלחת 60 המ"מימ לתוך הפתח של הצינורית עם הנקז רק בתוך הפתח, ולאחר מכן למשוך בחזרה על הנקז כדי לשאוב את הרקמה לתוך הצינורית.
    7. השתמש פיפטה תזוזה חיובית טיפ מצונן לשים 5 μl של תערובת חלבונים דביקה קרה לתוך הצינור עם תא גלול יבש (CD34 + ו- CD34- תערובת במשך תאים מושתלים) ומערבב בעדינות כדי ליצור השעית תא. אל פיפטה למעלה ולמטה. פיפטה השעית תערובת / תא החלבון הדביקה לתוך הפתח של הצינורית ולמשוך לאט בחזרה על הנקז כדי לטעון את המחט.
      הערה: מומלץ יש עוזרים לטעון פיפטה בעוד אחד מתפעל את מחט השתל.
    8. ספוגית האזור המגולח של העכבר עם Povidone יוד ובהמשך לנגב את האזור עם אלכוהול לנגב שלוש פעמים. קבע את המקום החשוך ביותר מתחת לעור. זה מצביע על המיקום של הטחול. הכליה היא כ הגבה 5 מ"מ עד הטחול. הרם את העור עם מלקחיים מעוקלים לעשות חתך באורך 15 מ"מ עם מספרי כירורגיות ב הקבלת העור אל הטחול. ואז לעשות חתך דומה הצפק השכבה שמתחתיה. אצל גברים, הכליה צריכה להיות גלויה בקלות, וניתן נמתח פשוט על ידי לחיצה על הבטן. אתה יכול לתמוך בכליות עם hemostat או זוג מלקחיים בוטים מעוקלים. אצל נקבות, ההשחלות נוטות לחסום את הכליה מן החילוץ קל. באמצעות hemostat, להרים את השחלה ובזהירות לחשוף את הכליה.
    9. השתמש מלקחי שקצו המחט למרוט חור זעיר בקצה האחורי של הקפסולה הכליות.
      הערה: אין להשתמש במלקחיים מחט שקצהו אלה להתמודד עם חומרים Biohazard.
    10. החלק את השתלמחט לתוך החור הזה ולאורך הכליות עד לפתיחת צינורית מכוסה כולו הקפסולה הכליות.
    11. בעדינות extrude הרקמה תחת הקפסולה כליות, ולמשוך את המחט בחזרה החוצה. חתיכות התימוס יכולות להיות דביקות כך להשתמש מלקחיים מעוקלים לוודא היצירה התימוס לא יוצאת עם המחט.
    12. הרם את הצפק עם מלקחיים בעדינות להשתמש hemostat לדחוף את הכליה בחזרה למקומו. לקשור אחד תפר כפול מסוקס הצפק באמצעות 4-0 vicryl התפרים נספגים. השתמש בשני autoclips קליפים פצע כדי לסגור את העור.
    13. מערבב את CD34 + תאי transduced כי היו להפריש עבור הזרקה ספיגה 100 μl (0.5x10 6 תאים) לתוך מזרק אינסולין. להזריק את התאים האלה לתוך העכבר באמצעות הזרקה לווריד retroorbital או מסלולים אחרים של הזרקה תוך ורידית. באמצעות מקלון צמר גפן, לשים טיפה קטנה של דמעות מלאכותיות על כל עין ולהניח את העכבר על צידו האחורי בכלוב.
    14. לאחר כל העכברים יש been מושתל, לאשר כי בעלי החיים הם להכרתו ו ambulating בדרך כלל לפני שעזב אותם.
    15. טיפול פוסט-הביצוע: יום לאחר הניתוח, תת עורי להזריק 0.3 מ"ל של דילול Carprofen (6 מ"ג / ק"ג) ו -1.2 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית לתוך כל עכבר. 2 ו -3 ימים שלאחר הניתוח, תת עורי להזריק 1.5 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית לתוך כל עכבר. לפקח על עכברים החתכים במשך 10-14 ימים לאחר הניתוח. הסר את autoclips ולשקול העכברים אחרי 10-14 ימים. הערה: עכברים הם איטיים לאחר קרינת הזרקה מלוחה מונעות חיות מלהפוך מיובש.
    16. אחרי 8 - 10 שבועות, לבדוק engraftment ידי דימום העכברים וביצוע ניתוח FACS על הדם ההיקפי, מכתים עבור סמנים כגון CD45, CD3, CD4, CD8, וכל גני הווקטור צריך להביע.

.2 אפיון בידול ופיתוח של תאים השתנה ג'ין

  1. אפיוןג'ין Modified תאי דם היקפי
    1. 8 - 10 שבועות לאחר ההשתלה, להשיג 50 - 100 μl של דם העכבר לדמם רטרו מסלולית. מניחים צינורות microcentrifuge המכיל 10 μl של EDTA. תאי צנטריפוגה ב XG 350 במשך 3 דקות. אסוף פלזמה. להקפיא ב -80 לניתוח ELISA או assay ויראלי עומס פלזמה אם העכבר הוא נדבק באיידס.
    2. הוסף 2 מיליליטר NH 4 Cl (83%) פתרון lyse כדורי דם אדום. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (25 מעלות צלזיוס). לאחר דגירה, להוסיף 10 FBS מ"ל RPMI 10% למלא צינור. ספין ב 300 XG במשך 5 דקות. לשאוב supernatant בזהירות. תאים מוכנים מכתים חיסוני וזרימת cytometry ניתוח מבחני אחרים.
      הערה: מרקר שושלות תאים שונים hematopoetic, הפעלה, וסמנים פנוטיפי עבור תאים נאיביים או זיכרון ניתן למדוד כל 2 שבועות לפני ואחרי הידבקות ב- HIV על ידי cytometry הזרימה. גייטס נוצרות על ידי מכתים תאים עם פקדים אלוטיפ. מומלץ להכתים healtHY אדם PBMCs ושימוש כי כביקורת חיובית. לחלופין, עכבר יכול להיות מורדם ועד 1 מיליליטר של דם היקפי ניתן לקבל לנקב לב אשר יספק מספיק תאים עבור פנלים מרובים של ניתוח תזרים 17.
  2. תאי אפיון גנטי שונה מן הטחול, התימוס מח העצם
    1. טחול קציר, קורנית ו מח עצם מן העכברים מואנש BLT
      1. להרדים עכברים באמצעות מנת יתר של isoflurane. אשר המתת חסד עם נקע בצוואר רחם משני. רסס את פני השטח של פגר עם אתנול 70% כדי לשמור על פרווה יידבקו לרקמות. להצמיד את הגפיים על מגש לנתיחת שעווה.
      2. השתמש במספריים כירורגית, לחתוך את העור, ולאחר מכן לחתוך דרך שכבת הצפק לחשוף את חלל הגוף.
      3. הסר את הטחול באמצעות מלקחיים. הסר את השתל הרתי על הכליה באמצעות מלקחיים ומספריים. מכניסים את השתל והטחול הרתי ב conta צינורות שכותרתוining 5 מ"ל של PBS.
      4. מאמצע בטן לחתוך ולהסיר את העור מהחלק הדיסטלי של העכבר המכסה את הגפיים התחתונים.
      5. חותך את השרירים בגפיים התחתונים באמצעות מספריים ובזהירות לנקוע מַרחֶשֶׁת מן מפרק הירך. הסר את עצם הירך לבין השוקה ולמקם אותם בתוך שפופרת המכילה 5 מ"ל של PBS.
    2. בידוד של Splenocytes
      1. מניחים מסננת תא 100μm על צינור חרוטי 50 מ"ל. להרטיב את המסננת עם 3 מיליליטר של תקשורת RPMI בתוספת 10% FBS ו פן / סטרפטוקוקוס (תקשורת RPMI להשלים).
      2. מניחים את הטחול על מסננת התא. באמצעות הבוכנה גומי של מזרק 10 מ"ל, ומועכים את הטחול כדי לנתק אותו דרך מסננת לתוך שפופרת 50 מ"ל.
      3. יש לשטוף את מסננת תא עם 5 מ"ל RPMI מלאה התקשורת 4 עד 5 פעמים.
      4. ספין תאים ב XG 300 במשך 10 דקות.
      5. supernatant ו resuspend גלולה לשאוב ב 5 מ"ל חיץ תמוגה תאי הדם האדומים. לדגור על חדר טמפרהture במשך 10 דקות. הוסף 20 מיליליטר RPMI מלא תקשורת ספין על XG 300 7 דקות.
      6. supernatant ו resuspend גלולה לשאוב 10 מ"ל RPMI התקשורת להשלים ולסנן שוב דרך מסננת תא 100 מיקרומטר. ספירת תאים באמצעות hemocytometer.
        הערה: תאים יכולים לשמש מבחני vivo לשעבר, לזרום ניתוח אפשר להקפיא viably לשימוש מאוחר יותר. לפני ספירת תאים, כחול Trypan ניתן להשתמש כדי לקבוע את מספר תאי קיימא.
    3. בידוד של האדם thymocytes מ שתל
      1. מניחים את התימוס לתוך 5 מ"ל של PBS ב באר צלחת גם 6. בעזרת מלקחיים ומספריים בוטים נקיים לחתוך את התימוס לחתיכות קטנות.
      2. הנח זוויתן רשת נירוסטה מעוקרת לתוך הבאר. באמצעות הבוכנה גומי של מזרק 10 מ"ל, ומועכים את חתיכות התימוס על רשת נירוסטה להתפרק התימוס.
      3. Resuspend התאים היטב ומסננים דרך מסננת תא 100 מיקרומטר. ספין תאים ב XG 300 במשך 10 דקות.להשעות תאים 10 מ"ל התקשורת RPMI להשלים. אם גושים גלויים, להעביר את תאי resuspended דרך מסננת תא שוב.
      4. ספירת תאים באמצעות hemocytometer.
        הערה: ניתן להשתמש תאים עבור ניתוח תזרים וקפוא viably לשימוש מאוחר יותר.
    4. בידוד של תאי מח העצם
      1. נקי לעקר ובמכתש עם 70% אתנול. מניחים את עצם הירך לבין השוקה לתוך מרגמה. הוסף 5 מ"ל של קר PBS. השתמש עלי לרסק את העצמות עד PBS הופך ורוד בהיר ומעונן.
      2. פיפטה את נוזל מתוך מרגמה ולסנן דרך מסננת תא 50 מיקרומטר דגש על צינור חרוטי 50 מ"ל. לשטוף מרגמה עם 5 מ"ל PBS וחזור חמש פעמים עד PBS מתבהרת.
      3. ספין תאים למטה XG 300 7 דקות. supernatant ו resuspend לשאוב 10 מ"ל התקשורת RPMI להשלים.
      4. ספירת תאים באמצעות hemocytometer.
        הערה: ניתן להשתמש בתאים עבור מבחני vivo לשעבר, לזרום ניתוח יכול להיות f הקפוא viablyאו מאוחר יותר לשימוש.

3. אפיון פונקציונלי של תאי ג'ין השתנה

  1. זיהום ניטור של HIV לאורך זמן שכפול נגיפי
    1. לאחר אישור של הכינון מחדש מערכת החיסון האנושית, להזריק כמות הרצויה של וירוס HIV באמצעות הזרקה לווריד רטרו מסלולית באמצעות מזרק אינסולין. לאחר ההידבקות ב- HIV, לאסוף 100 μl דם היקפי באמצעות רטרו מסלולית דימום כל 2 שבועות.
    2. פלזמה קציר ידי ביצוע השלבים חלק 2.1.1 - 2.1.2. עבור assay עומס נגיפי HIV, לחלץ רנ"א הנגיפי באמצעות ערכת חילוץ RNA על פי ההוראה של היצרן ולמדוד עומס נגיפי על ידי בזמן אמת RT-PCR עם סטים פריימר בדיקה מתאימים את נגיף האיידס בשימוש 4,8,18,19.
    3. כדי למדוד הקשורים תא RNA HIV ולזהות תאים נגועים באופן פעיל על ידי HIV, הראשון לבצע תמוגה RBC ביצוע השלבים 2.1.2
    4. השעית תא גלולה ב 1; מ"ל PBS, לחלק באופן שווה לשני צינורות. ספין ב 300 XG במשך 5 דקות. לשאוב supernatant.
    5. כדי למדוד RNA התא קשורה, לחלץ RNA באמצעות ערכת חילוץ RNA על פי הוראה של היצרן ולבצע בזמן אמת RT-PCR באמצעות ערכות פריימר בדיקה מתאימה.
      הערה: חשוב כי החללית תחל / אינו מכיר lentivirus נהג שונה תאי הגזע
    6. כדי למדוד HIV בתאים נגועים על ידי זרימה, תאים גלולים בצינור האחר 50 μl FACS החיץ לבצע כתם משטח עם נוגדן רצוי כגון אנטי CD45, אנטי CD4 ואנטי-CD3. לאחר כתם משטח, לתקן permeabilize תאים כתם intracellularly לביטוי איסור פרסום באמצעות נוגדן אנטי Gag (KC57 שיבוט). בצע cytometry הזרימה.
  2. Assay Ex Vivo ציטוקין של ג'ין Modified תאים Splenocytes
    1. splenocytes קציר מעכברים כמפורט בסעיף 2.2.2.
    2. כן תאי יעד. כדי לבדוק את התפקודיםity של תאי T מהונדסים הקולטן לאנטיגן כימרי CD4, להשתמש בתאי T1 נגוע ב- HIV כמו תאים היעד. להדביק תאים T1 עם HIV 3 ימים לפני assay ציטוקינים, לאשר הידבקות ב- HIV על ידי מכתימה את התאים intracellularly עם נוגדן איסור פרסום נגד HIV (KC57 שיבוט). השתמש בתאי T1 נגוע כתאים ליעד איזון.
    3. Co-דגירת splenocytes עם תאי יעד או שליטה ב 1: 1 יחס בין הלילה. לקבלת התוצאה הטובה ביותר, לבצע טיטרציה (1: 1, 1: 3, 1: 9) של מפעיל (splenocytes) לעומת תאי יעד (T1s הנגוע). לדוגמה, resuspend 0.9 מיליון splenocytes ב 0.25 מ"ל התקשורת RPMI להשלים, להוסיף 0.9, 0.3 או 0.1 מיליון T1s T1 או נגוע נגוע resuspended ב 0.25 מ"ל התקשורת RPMI להשלים.
    4. למחרת בבוקר, להוסיף מעכב חלבון תחבורה במשך 6 שעות כדי לעכב תחבורת חלבון ולבצע מכתים עבור סמנים תאיים וביטוי תאי ציטוקינים כפי שתואר לעיל ב 8.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 מציג מתווה של בניית עכברי BLT אנושיים עם תאי גזע מהונדסים. 10 שבועות לאחר ניתוח השתל, העכברים הוקרבו כדי להעריך את ההתמיינות והתפתחות של תאים מהונדסים גנטיים. כפי שניתן לראות בתרשים 2, רקמות הלימפה מרובות (דם, טחול, התימוס ומח עצם) נבצרו עכבר שעבר שינוי עם CD4ζCAR. CD4ζCAR להשתמש בפרוטוקול זה מכיל הקולטן לאנטיגן כימרי CD4 ו- GFP כי ניתן לאתר על ידי נוגדן אנטי CD4 והביטוי של ה- GFP 8. תאים בודדו ומ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עם מכונית ואת מומנטום צובר חסין מהונדסים מבוסס HSC כלפי מחקרים קליניים, חשוב להיות מודל חיה ראוי לבחון מקרוב את הבידול ותפקוד של תאים המהונדסים אלה. בפרוטוקול זה תארנו את השיטות לבנייה ובדיקת עכברים אנושיים עם תאי גזע מהונדסים גנטי המהונדסים נגד HIV. חשוב יש התמרה יעילה של תאי גזע לפני ההשתלה. עם זאת, בשל היכולת של תאי T להתרבות בעת ההכרה של תאי יעד, רמות נמוכות של שינוי תאי גזע הספיקו כדי ליצור תגובה חזקה נגד HIV שכפול 8.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות לגב' ג'סיקה סלנדר על שסיפקה עוזרת אמנותית ביצירת הדמויות שלנו. עבודה זו מומנה על ידי מענקים מה-NIAID/NIH, מענק מס. RO1AI078806, המרכז לחקר האיידס של UCLA (CFAR), מענק מס. P30AI28697, המכון לרפואה רגנרטיבית בקליפורניה, מענק מס. TR4-06845, הפדרציה האמריקאית לחקר האיידס (amfAR), מענק מס. #108929-54-RGRL, ותוכנית המחקר והיוזמות הרב-קמפוסים של אוניברסיטת קליפורניה, המרכז לגילוי תרופות אנטי-ויראליות בקליפורניה (CCADD)

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת מיקרו-חרוזים CD34Miltenyi130-046-702למיון תאי אב אנושיים CD34+
BambankerWako302-14681להקפאת תאים
ערכת QIAamp RNA ויראלי Qiagen52904למדידת עומס נגיפי בסרום
MACSQuant Flow CytometerMiltenyiלניתוח זרימה
BD LSRFortessa™BD biosciencesלניתוח זרימה
HyaluronidaseSigmaH6254-500MG לעיכול רקמות
דאוקסיריבונוקלאז I           וורת'ינגטוןLS002006 לעיכול רקמות
טכנולוגיית חיים קולגנאז17104-019 לעיכול רקמות
מערכת זיהוי PCR בזמן אמת CFXBioradלמדידת עומס נגיפי וביטוי גנים
עכברים, זן NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJמעבדת ג'קסון5557לבניית העכברים המואנשים
פניצילין סטרפטומיצין (Pen Strep)Thermo Fisher Scientific10378016לתרבית תאים
Piperacillin/tazobactamPfizerZosynאנטי פטרייתי
Amphotericin B (Fungizone antimycotic)ThermoFisher Scientific15290-018אנטי פטרייתי
קליפס לפצעים אוטוקליפ, 9 מ"מ - 1,000 יחידותבקטון דיקינסון427631 לניתוח
חלוקי כירורגיה סטריליים מחוזקים בפולי, 30 למקרה           מדלייןDYNJP2707 לניתוח
תפרים, 4-0, ויקריל                   אוונס ומינור23000J304H   לניתוח
פדים להכנת אלכוהול                   אוונס ומינור3583006818לניתוח
כפפות, כירורגיות, 6 1/2אוונס ומינור4075711102לניתוח
Yssel' s ללא סרום T-Cell בינונימזל תאומים ביו-מוצרים400-102להעברת תאי CD34+
אלבומין סרום אנושי סיגמא-אולדריץ'A9511עבור התמרת תאים CD34+

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Karpel, M. E., Boutwell, C. L., Allen, T. M. BLT humanized mice as a small animal model of HIV infection. Current opinion in virology. 13, 75-80 (2015).
  2. Zhen, A., Kitchen, S. Stem-cell-based gene therapy for HIV infection. Viruses. 6 (1), 1-12 (2014).
  3. Goulder, P. J. R., Watkins, D. I. HIV and SIV CTL escape: implications for vaccine design. Nature Reviews: Immunology. 4 (8), 630-640 (2004).
  4. Kitchen, S. G., Bennett, M., et al. Engineering Antigen-Specific T Cells from Genetically Modified Human Hematopoietic Stem Cells in Immunodeficient Mice. PloS one. 4 (12), e8208(2009).
  5. Goulder, P. J. R., Watkins, D. I. HIV and SIV CTL escape: implications for vaccine design. Nature Reviews: Immunology. 4 (8), 630-640 (2004).
  6. Kitchen, S. G. S., Levin, B. R. B., et al. In vivo suppression of HIV by antigen specific T cells derived from engineered hematopoietic stem cells. PLoS Pathogens. 8 (4), e1002649(2012).
  7. Yang, O. O., Tran, A. C., Kalams, S. A., Johnson, R. P., Roberts, M. R., Walker, B. D. Lysis of HIV-1-infected cells and inhibition of viral replication by universal receptor T cells. PNAS. 94 (21), 11478-11483 (1997).
  8. Zhen, A., Kamata, M., et al. HIV-specific Immunity Derived From Chimeric Antigen Receptor-engineered Stem Cells. Molecular Therapy. 23 (8), 1358-1367 (2015).
  9. Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer. Annual Review of Medicine. 65 (1), 333-347 (2014).
  10. Pejchal, R., Doores, K. J., et al. A Potent and Broad Neutralizing Antibody Recognizes and Penetrates the HIV Glycan Shield. Science. 334 (6059), 1097-1103 (2011).
  11. Caskey, M., Klein, F., et al. Viraemia suppressed in HIV-1-infected humans by broadly neutralizing antibody 3BNC117. Nature. 522 (7557), 487-491 (2015).
  12. West, A. P., Scharf, L., Scheid, J. F., Klein, F., Bjorkman, P. J., Nussenzweig, M. C. Structural insights on the role of antibodies in HIV-1 vaccine and therapy. Cell. 156 (4), 633-648 (2014).
  13. Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. -G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
  14. Melkus, M. W., Estes, J. D., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature medicine. 12 (11), 1316-1322 (2006).
  15. Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature Reviews: Immunology. 12 (11), 786-798 (2012).
  16. Vatakis, D. N., Bristol, G. C., et al. Using the BLT humanized mouse as a stem cell based gene therapy tumor model. Journal of visualized experiments : JoVE. (70), e4181(2012).
  17. De Rosa, S. C., Brenchley, J. M., Roederer, M. Beyond six colors: a new era in flow cytometry. Nature medicine. 9 (1), 112-117 (2003).
  18. Shimizu, S., Hong, P., et al. A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model. Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).
  19. Denton, P. W., Olesen, R., et al. Generation of HIV latency in humanized BLT mice. Journal of virology. 86 (1), 630-634 (2012).
  20. Zhou, J., Zhang, Y., et al. Embryoid bodies formation and differentiation from mouse embryonic stem cells in collagen/Matrigel scaffolds. Journal of Genetics and Genomics. 37 (7), 451-460 (2010).
  21. Vatakis, D. N., Arumugam, B., Kim, S. G., Bristol, G., Yang, O., Zack, J. A. Introduction of Exogenous T-cell Receptors Into Human Hematopoietic Progenitors Results in Exclusion of Endogenous T-cell Receptor Expression. Molecular Therapy. 21 (5), 1055-1063 (2013).
  22. Ito, R., Takahashi, T., Katano, I., Ito, M. Current advances in humanized mouse models. Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 208-214 (2012).
  23. Martinez-Torres, F., Nochi, T., Wahl, A., Garcia, J. V., Denton, P. W. Hypogammaglobulinemia in BLT humanized mice--an animal model of primary antibody deficiency. PloS one. 9 (10), e108663(2014).
  24. McCune, J. M. Development and applications of the SCID-hu mouse model. Seminars in Immunology. 8 (4), 187-196 (1996).
  25. Srivastava, S., Riddell, S. R. Engineering CAR-T Cells: Design Concepts. Trends in immunology. 36 (8), (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CD4BLTHIVNSG BLT

מאמרים קשורים