מאמר שיטה

Denervation כירורגי עורית: שיטה לבדיקת הדרישה עצבה בעכברי מודל של מחלת עור

DOI:

10.3791/54050

⸱

26 ביוני 2016

 ,  , 
1Dermatology, Cell and Developmental Biology, University of Michigan, 2Dermatology Branch, National Cancer Institute, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה כולל פרוטוקולים מפורטים לתיוג גנטי של עור עכבר, ניתוק עצבים כירורגי, ביופסיית עור והדמיה של אפיתל מסומן על ידי צביעת β-גלקטוזידאז שלמה. ניתן להשתמש בשיטות אלה כדי לבדוק את הדרישה לעצבים במודלים של עכברים בעלי עור רגיל ופתולוגי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עצבים סומטוסנסוריים עוריים מתפקדים כדי לזהות גירויים מגוונים הפועלים על העור. בנוסף לתפקידיהם החושיים המבוססים, מחקרים אחרונים הציעו כי עצבים עשויים גם לווסת הפרעות עור כולל אטופיק דרמטיטיס, פסוריאזיס וסרטן. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים לבדיקת הדרישה לעצבים בשמירה על איבר מכני-סנסורי עורי, כיפת המגע (TD). באופן ספציפי, אנו דנים בשיטות לתיוג גנטי, קציר והדמיה של TDs על ידי צביעה שלמה, ולביצוע ניתוק עצבים כירורגי חד צדדי על עור הגב האחורי של העכבר. יחד, ניתן להשתמש בגישות אלה כדי להשוות ישירות את המורפולוגיה של TD וביטוי גנים בעור מנותק עצבים כמו גם בעור המופעל על ידי דמה מאותה חיה. ניתן גם להתאים שיטות אלה בקלות כדי לבחון את הדרישה לעצבים במודלים של פתולוגיה של העור בעכברים. לבסוף, היכולת לדגום שוב ושוב את העור מספקת הזדמנות לעקוב אחר התקדמות המחלה בשלבים ובזמנים שונים לאחר התחלתה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך השנים האחרונות חלה הערכה הולכת וגוברת להשפעת העצבים על מחלות שאינן נחשבות בדרך כלל לנוירופתיות קלאסיות1-4. בעור, עדויות ניסיוניות עדכניות הצביעו על כך שעצבים תחושתיים יכולים לווסת פתולוגיות מגוונות החל מפסוריאזיס ועד לסרטן5-9. זה הוכח באמצעות טכניקות כמו ניתוק עצבים כירורגי ועיכוב פרמקולוגי של תפקוד עצבי במכרסמים. במקרה של פסוריאזיס, מחקרים אלה סיפקו מסגרת מכניסטית להבנת מדוע פלאק פסוריאזי אנושי נסוג בעקבות אובדן תפקוד עצבי7,10-12.

עצבים עוריים יכולים גם להשפיע על ביטוי גנים13,14 והם קריטיים לחישה מכנית בעור רגיל15. בפרט, אפיתל כיפת מגע (TD) מורכב מטלאי של תאי אפידרמיס עמודיים בסמיכות לתאי מרקל נוירואנדוקריניים המועצבים על ידי הסתגלות איטית של סיבי עצב מסוג 1 (SA1)16-18. TDs מתווכים תחושת מגע קלה והוכח שהם מציגים פעילות מסלול קיפוד5,19. תחזוקת TD תלויה בעצבוב20,21, מכיוון שהעצבים מפרישים ליגנדים של קיפוד כדי לקיים TDs תקינים ותאי מרקל הקשורים אליהם19. בנוסף, עצבוב מקדם היווצרות גידול תלוי קיפוד מאפיתל TD5. יחד, מחקרים אלה מחזקים את הרעיון שאינטראקציות מולקולריות מורכבות המתרחשות בין עצבים לתאים הסובבים בנישה שלהם חיוניות לפיזיולוגיה תקינה של TD כמו גם למחלות.

כדי לחקור את אופי האינטראקציות הללו, אנו מתארים כאן סדרה של טכניקות in vivo למניפולציה של ביטוי גנים ב-TD, כמו גם לקצירת ביופסיות עור להדמיית TD לאחר מעקב אחר שושלת. לבסוף, אנו מתארים נהלים לביצוע ניתוק עצבים כירורגי חד צדדי, שבו עצבים מוסרים מצד אחד של עור הגב של העכבר, תוך השארת הצד הנגדי שלם כבקרה פנימית מזויפת. מספר שבועות לאחר הניתוח, משווים עור מנותק עצבים ועור דמה כדי להעריך את השינויים המתרחשים בעת כריתת עצבים. למרות שטכניקות אלה מתוארות בהקשר של TDs נורמליים, הליך ניתוק העצבים שימש לבחינת הדרישה לעצבים במודלים של עכברים של פסוריאזיס6, ריפוי פצעים13 וגידול5. לבסוף, מכיוון שהעור פתוח לביופסיות חוזרות, זה מספק הזדמנות לעקוב אחר גורלם ארוך הטווח של תאים מסומנים או להעריך את התקדמות המחלה על פני מספר נקודות זמן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הנהלים המתואר בפרוטוקול זה בוצעו בהתאם לתקנות שנקבעו על ידי אוניברסיטת מישיגן היחידה לרפואת חיות מעבדה.

1. להשרות שחלוף עכברים

הערה: Gli1 TM3 (cre / ERT2) Alj / J זן העכבר (Gli1-CreERT2) 13 מאפשר מיקוד של שחלוף הנגרמת טמוקסיפן כדי TD epithelia. לחצות זן זה עם B6.129S4-GT (ROSA) 26Sor tm1Sor / עכברים הכתב J (LacZ) 22 כדי ליצור Gli1; ​​חיות LacZ לדמיין תאים TD ידי כל הר מכתים להלן.

  1. הכן פתרון טמוקסיפן לריכוז של 12.5 מ"ג / מ"ל ​​בשמן תירס.
    1. בתוך צינור 1.5 מ"ל, להוסיף עד 20 מ"ג טמוקסיפן גבישי, ולאחר מכן 1 מ"ל של שמן תירס. בתוקף ידביק את הצינור כדי מערבל מערבולת, מערבולת ברציפות על ההגדרה הגבוהה ביותר ב RT עד טמוקסיפן נמס לגמרי (2-4 שעות), כפיאושר על ידי בחינת הצינור תחת מיקרוסקופ לנתח עבור בהעדר חלקיקי טמוקסיפן.
    2. מעבירים את הפתרון צינור 15 מ"ל ו לדלל את טמוקסיפן לריכוז סופי של 12.5 מ"ג / מ"ל ​​עם שמן תירס נוספים. מערבב על ידי vortexing הפתרון הצמיג עבור 30 שניות נוספות. אחסן את הפתרון הזה עד 1 שבוע ב 4 ° C בחושך.
  2. להזריק את הפתרון טמוקסיפן intraperitoneally לתוך Gli1; ​​עכברים LacZ, בהיקף של 200 μl לכל 20 גרם של משקל גוף העכבר עבור מנה טמוקסיפן יעיל של 2.5 מ"ג משקל העכבר 20 גר '.

2. ביופסיות עור קציר

הערה: בהתאם הניסוי, ביופסיות עור הקציר כמה ימים עד שבועות לאחר אינדוקציה טמוקסיפן. לכל הניתוחים, בצע פרוטוקולים סטנדרטיים לניתוח מכרסם, כולל שימוש בכפפות סטריליות, לובש נטו מסכה או שיער כירורגית, ומכסה את החיה עם וילון ניתוח סטרילי במהלך ההליך.

  1. הכן 10x ההרדמה המניות על ידי ערבוב 90 מ"ג / מ"ל ​​קטמין ו -6.5 מ"ג / מ"ל ​​xylazine במים. לדלל זה פתרון המניות 01:10 לתוך PBS סטרילי רק לפני השימוש, ולאחסן ב RT בחושך במשך עד 8 חודשים.
    1. לחלופין, להרדים עכברי משאיפת isoflurane, החל ריכוז גז של 4% עם חמצן כדי להרדים את החיה באופן מלא, ולאחר מכן לאחר מכן הורדה זה ל 1-2% למשך ההליך.
  2. להזריק את חומר ההרדמה intraperitoneally במינון של 200 μl לכל משקל גוף 20 גרם העכבר. בדוק כי בעל החיים הגיעו המטוס התקין של הרגעה ידי assay קמצוץ בוהן, ולאשר כי לב ושיעורי נשימה הם נורמליות (כ 600 פעימות ו -160 נשימות לדקה, בהתאמה).
  3. השתמש גוזז חשמלי להסרת השיער מהאתר של ביופסיה על הגב בחזרה העור, נזהר שלא ניק או ניזק לעור הבסיסי.
  4. מכינים את האתר כירורגית על ידי מנגב את הגילוחתחום ד בכיוון הקדמי אל האחורי באמצעות מגבונים בבטאדין ואלכוהול. ודא כי כל קטעי השיער יוסרו מהאתר.
  5. התווה את אתר הביופסיה באמצעות טוש שחור, למקם את החיה על כרית חימום באזור כירורגית ספטית, ומכסי וילון ניתוח סטרילי (למטרות הדגמה, וילון סטרילי הושמט כדי להגדיל את נראות).
    הערה: כדי להשיג סעיפים אורכים של זקיקי שיער, בקצה הארוך יותר של הביופסיה (לקצה להיות מחולק עבור היסטולוגיה, ~ 1 סנטימטר) צריך לרוץ לכיוון קדמי-אחורי (במקביל לכיוון של זקיקי שיער), parasagital כדי קו האמצע הגבה (איור 1 א).
  6. השתמש אזמל # 11 סטרילי לבצע כריתה בעובי מלאה לאורך האזור המסומן מבלי לפגוע fascia שהרירי הבסיסי.
    הערה: רקמת העור נכרת כולל את האפידרמיס, הדרמיס, שומן תת עורי ו מִרפָּד carnosus. הדימום הוא בדרך כלל מינימלי.
  7. לרדד tהוא נכרת מדגם עור על מגבת נייר יבשה, הדרמיס בצד למטה, לקצץ משם מגבת נייר העודפת, ולאחסן את המדגם בקור PBS עד שעה 1 אם מדגמים אחרים צריכים להיאסף. כאשר מוכן, המשך צעדים 3.1 או 3.2 לעבד דגימות היסטולוגיה, או שלב 4 עבור מכתים כל הר β-galactosidase (LacZ).
  8. תפר לסגור את אתר הביופסיה באמצעות 6-0 תפרי ניילון, דפוס קטע פשוט במרווחים בערך זה מזה 3 מ"מ.
  9. אל תחזרו עכברים שעברו ניתוח לתוך באותו הכלוב כמו בעלי חיים אחרים עד לאחר החלמה מלאה.
  10. צג חיות מיד לאחר הניתוח עד שהם להכרתו, וגם על בסיס יומי עד אזור הניתוח הגליד, בדרך כלל תוך שבוע 1. השתמש במשככי כאבים על פי הנחיות לטיפול ולשימוש חיה מוסדיות המיועדות אם עכברים להפגין סימנים של כאב או מצוקה. סר תפרים בתוך 7-10 ימים לאחר ניתוח.
    הערה: במידת הצורך, להכין פתרון כאבים על ידי דילול carprofen (50 מ"ג / מ"ל ​​solut המניותיון) 1: 100 במים סטריליים. להזריק את תת עורי פתרון בין השכמות ליד בעורפו, במינון של 200 μl לכל משקל גוף 20 גרם (5 מ"ג / משקל גוף העכבר ק"ג).

3. דוגמאות תהליך עבור היסטולוגיה

הערה: כדי לתקן ולעבד את רקמת נכרת, השתמש באחת השיטות שלהלן, בהתאם ליישום.

  1. כדי ליצור דגימות היסטולוגית-מוטבע פרפין, לתקן את העור בפורמלין 3.7% ב PBS O / N ב RT ולאחסן באתנול 70% לתקופה של עד 2 שבועות. הסר את מגבת נייר לפני להטבעה לתוך פרפין.
  2. להפקת דגימות היסטולוגית קפוא, להטביע את הרקמה paraformaldehyde 4% קר PBS ולנער בעדינות במשך שעה 1. הסר את הפתרון ולשטוף את המדגם עם 3 שינויים של PBS, בערך 5 דקות כל אחד. לאחר מכן, להטביע את המדגם ב סוכרוז 30% ב PBS cryoprotect הרקמה ( "טביעת סוכרוז").
  3. דגירה עם רעד O / N עדין על 4 מעלות צלזיוס. למחרת, להסיר את גרר נייראל לקצץ משם רקמת שומן עודף מצד העור של העור. הטמע הרקמה ישירות לתוך אוקטובר ולאחסן את הגוש הקפוא ב -80 מעלות צלזיוס.
    הערה: לאחר חתך, או פרפין או דגימות קפואות יכול להיות מוכתם על ידי אימונוהיסטוכימיה לזהות TDS, תאי מרקל והעצבים באמצעות נוגדנים נגד קראטין 17, קראטין 8 ו neurofilament, בהתאמה, כפי שתואר לעיל 5,19.

4. דוגמאות דמיינו ידי כל הר LacZ מכתים

  1. כן פתרון מכתים X-gal.
    1. שלב monobasic פוספט 0.94 גרם נתרן, ו dibasic פוספט נתרן 2.6 גרם ב 250 מ"ל של מים סטריליים. התאם ל- pH 7.3. כדי זה, להוסיף 0.5 מ"ל של 1 M מגנזיום כלוריד, 0.528 גרם של פרוציאני אשלגן, ו 0.412 גרם של ferricyanide אשלגן. הוסף 250 μl של גליקול octylphenyl-פוליאתילן 125 מ"ג של deoxycholate. פתרון הבסיס יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים בחושך.
    2. כן 50x המנייה X-gal solutiעל ידי הוספת dimethylformamide לבקבוק X-gal המניות לייצר פתרון 50 מ"ג / מ"ל. אחסן את הפתרון הזה ב -20 ° C בחושך.
    3. רק לפני השימוש, לדלל המניה X-gal פתרון 1:50 לתוך פתרון בסיס X-gal לייצר פתרון מכתים. עבור ביופסיות קטנות (<1 סנטימטר 2), aliquot 1-2 מיליליטר של תמיסת מכתים לדגימה.
  2. תקן במדגם העור שנאספו שלב 2.7 בתמיסה המכילה glutaraldehyde 2% paraformaldehyde / 0.2% ב PBS קר למשך 30 דקות, רועד בעדינות על הקרח. עבור ביופסיות קטנות (<1 סנטימטר 2), להשתמש 1-2 מיליליטר של תמיסה מקבעת לדגימה.
    הערה: לחילופין, לתקן דגימות paraformaldehyde 2-4% בלבד, או ב glutaraldehyde 0.5% בלבד. תנאי קיבעון אופטימלי תלוי הרקמה, מידת הביטוי LacZ ויישום.
  3. הסר את הפתרון מקבע, ולשטוף דגימות עם 3 שינויים של PBS, 5 דקות כל אחד, על שייקר ב RT.
  4. הסר את מגבת נייר מתחת מדגם וחותכים ממנו excesזה רקמה שומן מצד העור של העור על ידי אחיזת השומן עם מלקחיים בוטים הזמירה במספריים לנתח.
  5. לצלול המדגם בתמיסה מכתים X-gal, לדגור על 37 מעלות CO / N. LacZ הביטוי יהיה גלוי כמו כתם כחול תחת מיקרוסקופ לנתח (איור 1 ב).
    הערה: אם עוצמת האות חלשה, להחליף את הפתרון המכתים למחרת וחזור על דגירת O / N. אם מכתים הרקע הוא אינטנסיבי מדי, לצמצם את הזמן של מכתים, או דגירה המדגמת ב RT במקום 37 ° C.
  6. הסר את הפתרון מכתים ולשטוף את דגימות 3 שינויים של PBS המכיל DMSO 3% למשך כ 5 דקות, רועד בעדינות ב RT.
  7. לשטוף דגימות 2-3 שינויים של אתנול 70% במשך 5 דקות כל אחד. חנות דגימות באתנול 70%.

5. denervation כירורגי

  1. להרדים את החיה כמו בשלב 2.2 ו לגלח את עור הגב כולו.
  2. מכינים את אזור הניתוח of העור בחזרה את השימוש במגבונים בבטאדין ואלכוהול, ולכסות את חיה עם וילון ניתוח סטרילי (למטרות הדגמה, הושמט וילון סטרילי כדי להגדיל את הנראות). שמור על חמי החיה באמצעות כרית חימום תוך שפעל באזור כירורגית ספטית.
  3. עושים חתך באמצעות אזמל # 11 סטרילי לאורך קו האמצע הגב מבסיס הצוואר בערך 0.5 ס"מ מעל הזנב.
  4. בעזרת מלקחיים בוטים, לשקף את העור בעדינות בצד השמאל מן האגף לדמיין את הרקמה הבסיסית מן רפידות שומן גלימה ליד הצוואר כדי בדיוק מעל הגפיים האחוריים.
    הערה: עצבי עורית הגבו להופיע שערות לבנות כמו זה לנסוע caudally דרך fascia השקוף של הקיר בתא המטען לפני ביצוע עיקולים חדים והזנת רקמת החיבור הרופפת מתחת לפני העור (איור 2).
  5. בעזרת מלקחיים Ultra- בסדר תחת מיקרוסקופ אור לנתח, להסיר את העצבים באופן בלעדי מצד שמאל של אנימהl ממוקם באתרים אנטומיים T3-12 ידי מריטת מאיפה העיקול מגזרים בכותל המטען לאתרים כניסתם לתוך העור (איור 2).
    1. מלקחי אוריינט אנכיים ולהסיר את העצבים תוך כדי אחיזה כ 0.5 סנטימטרים מתחת לאתרי העיקול שלהם ומושכים כלפי מעלה, גורם חוצפה למתוח ולהפריד מן הרקמה הסובבת (איור 2 ג - ה). היזהר, כדי למנוע פקיעת כלי דם סמוכים.
    2. המשך עד שכל העצבים המשתרעים קיר בתא המטען על העור יוסרו. אין לשבש את העצבים בתוך fascia הצפופה של הקיר בתא המטען. שמור על הרקמות לחות לאורך כל ההליך על ידי יישום טיפות התקופתי של תמיסת מלח סטרילית 0.9%.
    3. לחלופין, להסיר עצבים ידי אחיזת קצוות הפרוקסימלי ליד הקיר בתא המטען עם מלקחיים הוא גזרה במספריים בסדר. לאחר מכן, לנתק את הקצוות הדיסטלי ליד העור (איורים 2F - H). לבסוף, להסיר את intervening מגזרים עצבים (2I איור).
  6. הסר את כל העצבים מן דש העור נחשף שלב 5.4. סיבים אלו מהווים סניפים המרוחקים של עצבים עורית הגבה ומופיעים כמו שערות לבנות הסתעפות הממוקמת באופן ספוראדי בתוך רקמת חיבור בצד העור של דש העור (2J ומספרים - K).
    1. כדי להסיר אלה סניפים בסדר, למקם את המלקחיים בסדר בערך במקביל אל פני שטח עורי, לתפוס את העצבים למרוט כלפי מעלה כדי למנוע שיבוש כלי דם ניקוב העור. המשך עד שכל העצבים הגלויים הוסרו.
  7. באמצעות דיסקציה בוטה, לשקף את העור בצד ימין של חתך קו אמצע הגב, אבל לא להסיר את העצבים. זה ישמש את שליטת דמה מופעלים הנגדית.
  8. תפר לאורך קו האמצע הגב בדפוס קטע פשוט כדי לסגור את החתך. לפקח על בעלי חיים בזמן תהליך ההחלמה-אופר פוסטatively כפי שהוכח בעבר (שלבים 2.8-10). סר תפרים בתוך 7-10 ימים לאחר ניתוח.
  9. כדי תפקודי להעריך עד denervation יציבה עד מספר שבועות לאחר ניתוח, להסיר את השיער מן העור הגבה באמצעות גוזז חשמלי.
  10. בעדינות לדקור את שטח העור denervated באמצעות מחט המזרק, ושים לב אם מגיבה החיה, בדרך כלל על ידי רעדה או לסובב את הראש שלה. אם אזור העור כבר denervated ביציבות, החיה תפגין נמוכה, אם בכלל.
  11. באמצעות טוש שחור, המתאר את השטח של תשובה, כמו גם שטח של גודל ומיקום דומים בצד הדמה הנגדי.
  12. אסוף ביופסיות מאתרים אלה כמו שלבים 2.1-2.9 לניתוח.
    הערה: לחלופין, הגבה כולו בחזרה העור, כוללים אזורי denervated ו דמה מופעל, ניתן להסיר כסיד יחיד עבור מכתים כל הר, בדומה כמתואר שלב 4.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

על ידי עכברי יצירה להביע טמוקסיפן-מושרת Gli1-CreERT2 ו אלל כתב LacZ, אפשר לדמיין epithelia TD ולעקוב אחר גורלם של תאים אלה לאורך זמן. הליך denervation כולו בדרך כלל ניתן להשלים בתוך 1 hr לכל עכבר וצריך לגרום למצוקה מינימאלית לחיה.

המחקרים הקודמים שלנו הראו כי עצבים חיוניים לשמירה הן TDs רגיל וכן תאי קרטין 8 + מרקל הקשור...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עצבים לשרת פונקציות חיוניות לא רק תחושה, אלא גם בפיתוח איבר יונק, בשמירה ובחידוש 13,24-27. כפי עצבים היו מעורבים לאחרונה בהפרעות עור מגוונות, הטכניקות המתוארות כאן יכולות לשמש כדי לחקור את דרישת העצבוב במגוון דגמי המחלה בבעלי החיים. למעשה הטכניקה denervation חד-צדדית מאפשרת השוואה ישירה של העור או עם העצבים שלא ניזוקו או שיבשו מאותו עכבר. זה מספק בקרה פנימית אידיאלית כדי לפצות על הבדלים חי אל-חיה, עם הנתונים הבאים מנתחת עשיית שימוש של מבחן t מזווג.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להודות לסתיו פיטרסון על הסיוע בצילום עכברים, לדניאל תורסן על הסיוע בעכברים, ולד"ר ניקול וורד ועבד אלמג'יד בלקאדי על הסיוע בניתוק עצבים כירורגי. מחקרים אלה נתמכו על ידי מימון מהמכון הלאומי לדלקת מפרקים ומחלות שרירים ושלד ועור (מענקים R00AR059796 ו-R01AR065409); המחלקה לדרמטולוגיה של אוניברסיטת מישיגן; תוכנית המלגות למדעי הביולוגיה; המרכז לאורגנוגנזה; מרכז הסרטן המקיף של אוניברסיטת מישיגן; וקרן הסרטן ע"ש ג'ון ס. וסוזן ס. מון. S.C.P. נתמך על ידי מימון מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (מענק T32 GM007315). עבודה זו נתמכה גם על ידי תוכנית המחקר הפנימי של ה-NIH, המרכז לחקר הסרטן, המכון הלאומי לסרטן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
רפידות הכנה לאלכוהולPDIB339
AnaSed (קסילזין)LloydNADA 139-236
נוגדן, אנטי קרטין 8מחקרים התפתחותיים Hybridoma BankTROMA-Iנוגדן חולדות, שימוש בריכוז 1:500
נוגדן, אנטי קרטין 17Cell Signaling#4543נוגדן ארנב, שימוש בריכוז 1:1,000
נוגדן, אנטי-נוירופילמנטאיתות תאיםC28E10נוגדן ארנב, שימוש בריכוז 1:500
רפידות הכנה בטדין MedlineMDS093917
קרפרופן (רימדיל)Zoetis
קוצץ נטען אלחוטיגוזם Wahlדגם 8900
שמן תירסSigma-AldrichC8267
CryostatLeicaCM1860
DAPIThermoFisher ScientificD1306שימוש בריכוז 1:1,000
דאוקסיכולטסיגמא-אולדריץ'D6750
קרם אפילציהNairN/A
דימתילפורמידסיגמא-אולדריץ'319937
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)סיגמא-אולדריץ'D8418
GlutaraldehydeSigma-AldrichG5882
ImmEdge עטוקטור מעבדותH-4000
קטמין HClHospiraNDC 0409-2051-05
מגנזיום כלורידSigmaM8266
מיקרו כיסוי זכוכיתVWR48404-454
מיקרו שקופיותVWR48311-703
10% פורמלין ניטרלי חוצץVWRBDH0502-4LP
6-0 תפרי ניילוןDemeTECHNL166012F4P
אוקטילפניל-פוליאתילן גליקולסיגמא-אולדריץ'I8896
O.C.T. תרכובתSakura Tissue-Tek4583
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127
Pottasium ferrocyanideSigma-AldrichP9387
Pottasium ferricyanideSigma-Aldrich702587
נתרן פוספט מונו-בסיסיSigma-AldrichP9791
נתרן פוספט דו-בסיסיSigma-AldrichS5136
סוכרוזSigma-Aldrich84097
טמוקסיפןSigma-AldrichT5648-1G
מלקחיים עדינים במיוחדDumont0103-5-PO
VectashieldVector LaboratoriesH1000
X-galRoche10 651 745 001להמיס בדימתילפורמיד ליצירת מלאי פי 50 לפני השימוש

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Magnon, C., et al. Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression. Science. 341, 1236361(2013).
  2. Zhao, C. M., et al. Denervation suppresses gastric tumorigenesis. Sci Transl Med. 6, 115(2014).
  3. Chiu, I. M., von Hehn, C. A., Woolf, C. J. Neurogenic inflammation and the peripheral nervous system in host defense and immunopathology. Nat Neurosci. 15, 1063-1067 (2012).
  4. Gautron, L., Elmquist, J. K., Williams, K. W. Neural control of energy balance: translating circuits to therapies. Cell. 161, 133-145 (2015).
  5. Peterson, S. C., et al. Basal cell carcinoma preferentially arises from stem cells within the hair follicle and mechanosensory niches. Cell Stem Cell. 16, 400-412 (2015).
  6. Ostrowski, S. M., Belkadi, A., Loyd, C. M., Diaconu, D., Ward, N. L. Cutaneous denervation of psoriasiform mouse skin improves acanthosis and inflammation in a sensory neuropeptide-dependent manner. J Invest Dermatol. 131, 1530-1538 (2011).
  7. Ward, N. L., et al. Botulinum neurotoxin A decreases infiltrating cutaneous lymphocytes and improves acanthosis in the KC-Tie2 mouse model. J Invest Dermatol. 132, 1927-1930 (2012).
  8. Roggenkamp, D., et al. Epidermal nerve fibers modulate keratinocyte growth via neuropeptide signaling in an innervated skin model. J Invest Dermatol. 133, 1620-1628 (2013).
  9. Riol-Blanco, L., et al. Nociceptive sensory neurons drive interleukin-23-mediated psoriasiform skin inflammation. Nature. 510, 157-161 (2014).
  10. Zanchi, M., et al. Botulinum toxin type-A for the treatment of inverse psoriasis. J Eur Acad Dermatol Venereol. 22, 431-436 (2008).
  11. Farber, E. M., Lanigan, S. W., Rein, G. The role of psychoneuroimmunology in the pathogenesis of psoriasis. Cutis. 46, 314-316 (1990).
  12. Dewing, S. B. Remission of psoriasis associated with cutaneous nerve section. Arch Dermatol. 104, 220-221 (1971).
  13. Brownell, I., Guevara, E., Bai, C. B., Loomis, C. A., Joyner, A. L. Nerve-derived sonic hedgehog defines a niche for hair follicle stem cells capable of becoming epidermal stem cells. Cell Stem Cell. 8, 552-565 (2011).
  14. Liao, X. H., Nguyen, H. Epidermal expression of Lgr6 is dependent on nerve endings and Schwann cells. Exp Dermatol. 23, 195-198 (2014).
  15. Lumpkin, E. A., Marshall, K. L., Nelson, A. M. The cell biology of touch. J Cell Biol. 191, 237-248 (2010).
  16. Maricich, S. M., et al. Merkel cells are essential for light-touch responses. Science. 324, 1580-1582 (2009).
  17. Reinisch, C. M., Tschachler, E. The touch dome in human skin is supplied by different types of nerve fibers. Ann Neurol. 58, 88-95 (2005).
  18. Doucet, Y. S., Woo, S. H., Ruiz, M. E., Owens, D. M. The touch dome defines an epidermal niche specialized for mechanosensory signaling. Cell Reports. 3, 1759-1765 (2013).
  19. Xiao, Y., et al. Neural Hedgehog signaling maintains stem cell renewal in the sensory touch dome epithelium. Proc Natl Acad Sci USA. 112, 7195-7200 (2015).
  20. English, K. B., Van Norman, D. K. -V., Horch, K. Effects of chronic denervation in type I cutaneous mechanoreceptors (Haarscheiben). Anat Rec. 207, 79-88 (1983).
  21. Burgess, P. R., English, K. B., Horch, K. W., Stensaas, L. J. Patterning in the regeneration of type I cutaneous receptors. J Physiol. 236, 57-82 (1974).
  22. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21, 70-71 (1999).
  23. Wright, M. C., et al. Atoh1+ progenitors maintain the Merkel cell population in embryonic and adult mice. J Cell Biol. 208, 367-379 (2015).
  24. Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends Neurosci. 35, 691-699 (2012).
  25. Rinkevich, Y., et al. Clonal analysis reveals nerve-dependent and independent roles on mammalian hind limb tissue maintenance and regeneration. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 9846-9851 (2014).
  26. Ueno, H., et al. Dependence of corneal stem/progenitor cells on ocular surface innervation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 867-872 (2012).
  27. Westphalen, C. B., et al. Long-lived intestinal tuft cells serve as colon cancer-initiating cells. J Clin Invest. 124, 1283-1295 (2014).
  28. Uhmann, A., et al. The Hedgehog receptor Patched controls lymphoid lineage commitment. Blood. 110, 1814-1823 (2007).
  29. Lau, J., et al. Temporal control of gene deletion in sensory ganglia using a tamoxifen-inducible Advillin-Cre-ERT2 recombinase mouse. Mol Pain. 7, 100(2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Mouse Skin DiseaseTouch Dome MorphologyDorsal Cutaneous NerveWhole Mount StainingGenetic LabelingSham Operated ControlHistological Section AnalysisHedgehog SignalingMerkel Cells

מאמרים קשורים