הערכת Myofilament Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; עירור-התכווצות לב ביסוד רגישה זיווגים

Zai Hao Zhao; Chun Li Jin; Ji Hyun Jang; Yu Na Wu; Sung Joon Kim; Hong Hua Jin; Lan Cui; Yin Hua Zhang

doi:10.3791/54057

הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הערכת Myofilament Ca

9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54057

⸱

1 באוגוסט 2016

Zai Hao Zhao¹ , Chun Li Jin¹ , Ji Hyun Jang¹ , Yu Na Wu¹ , Sung Joon Kim¹ , Hong Hua Jin² , Lan Cui² , Yin Hua Zhang¹^,²^,³

¹Department of Physiology & Biomedical Sciences, Ischemic/hypoxic Disease Institute, Seoul National University College of Medicine, ²Yan Bian University Hospital, ³Institute of Cardiovascular Sciences, University of Manchester

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מתאר פרוטוקול המעריך את השינויים ברגישות לשריר Ca²⁺ במהלך התכווצות במיוציטים לבביים מבודדים מלב חולדה. יחד עם אלקטרופיזיולוגיה של הלב, רמות ציטוזול סיסטולי/דיאסטולי Ca²⁺ והתכווצות/הרפיה, מדידה זו הכרחית בבסיס המנגנונים המתווכים צימוד עירור-התכווצות לב בלב בריא וחולה.

תקציר

אי ספיקת לב והפרעות קצב הלב הם הגורמים המובילים לתמותה ותחלואה בעולם. עם זאת, המנגנון של מחלה ו תקלת שריר לב בלב החולה נשאר להתברר במלואה. ראיות משכנעות אחרונות מוכיחות כי שינויים ברגישות ²⁺ myofilament Ca להשפיע Ca התאי ²⁺ פעילויות הומאוסטזיס יון ערוץ myocytes הלב, המנגנונים החיוניים אחראים פוטנציאל הפעולה של הלב והתכווצות בלבבות בריאים וחולים. ואכן, פעילויות של תעלות יונים מובילי שבבסיס פוטנציאל פעולת לב (למשל, Na ^+, Ca ^{2 +} ו K ⁺ ערוצים מחליפים Na ⁺ -Ca ²⁺⁾ ו- CA תאי ²⁺ טיפול חלבונים (למשל., קולטנים ryanodine ו- CA ²⁺ -ATPase ב הרטיקולום sarcoplasmic (SERCA2a) או phospholamban ו זירחון שלה) נמדדים כמקובל כדי evaluאכול את המנגנונים הבסיסיים של התכווצות עירור לב (EC) צימוד. שני פעילויות חשמל בקרום והשינויים ²⁺ Ca התאיים הן אותות ההדק של צימוד EC, ואילו myofilament היא היחידה התפקודית של התכווצות והרפיה, ו myofilament Ca רגיש ²⁺ הכרחית ביישום ביצועי myofibril. אף על פי כן, כמה מחקרים לשלב myofilament רגישות Ca ^{2 +} לתוך האנליזה הפונקציונלית של שריר הלב, אלא אם כן הוא המוקד של המחקר. כאן אנו מתארים פרוטוקול המודד קיצור sarcomere / מחדש התארכות ורמת תאיים Ca ^{2 +} באמצעות פורעה -2 AM (זיהוי ratiometric) ולהעריך את השינויים של רגישות ²⁺ myofilament Ca ב myocytes לב מלבבות חולדה. המטרה העיקרית היא להדגיש myofilament שרגישות ²⁺ Ca צריכה להילקח בחשבון צימוד EC לניתוח מכניסטית. חקירה מקיפה של iבערוצים, מובילי יון, טיפול Ca ^{2 +} תאיים, ורגישות ²⁺ myofilament Ca העומדים בבסיס התכווצות myocyte בלבבות בריאים וחולים יספק מידע רב ערך לתכנון אסטרטגיות יעילות יותר של translational ואת הערך טיפולי.

מבוא

צימוד עירור-התכווצות הלב (EC) הוא ערכת היסוד לניתוח תכונות מכניות של שריר הלב, כלומר, הפונקציה התכווצות של הלב ^1,2. צימוד EC הוא שיזם שלילת קוטביות הממברנה משנית לפעילות של תעלות יונים sarcolemmal (למשל, ערוץ Na ⁺ מתח מגודרת, אשר ניתן למדוד באמצעות טכניקות תיקון- clamp). ההפעלה הבאה של זרם מתח מגודר L- סוג Ca ^{2 +} ערוצים (LTCCs) ו Ca ^{2 +} דרך LTCCs לעורר את חלק הארי של Ca ^{2 +} שחרור דרך קולטני ryanodine (RyRs), גברת ריכוז cytosolic Ca ^{2 +} מ nanomolar (ננומטר ) כדי מיקרו ברמה (מיקרומטר). כגון עלייה Ca cytosolic ²⁺ מקדמת Ca ^{2 +} מחייבת טרופונין C (TNC) ב חוטים דקים מעוררת שינויים מרחביים של מתחם הנימה כדי להקל על האינטראקציה תקטין שרירן ומשיגה myocardi אל התכווצות ^3. מנגד, cytosolic Ca ^{2 +} מחדש uptaken בחזרה הרטיקולום sarcoplasmic (SR) דרך Ca ^{2 +} -ATPase ב SR (SERCA2a) או הנמתח מן myocyte באמצעות מחליפי Na ⁺ / Ca ^{2 +} ואת plasmalemmal Ca ^{2 +} ATPase ^1,2. כתוצאה מכך, הירידה Ca cytosolic ²⁺ instigates שינויים מרחביים של חוטים דקים חזרה למצב המקורי, וכתוצאה מכך ניתוק של אקטין שרירן myocyte הרפיה ^1-3. לפי שיטה זו, את הפעילות של SERCA2a נחשבת בדרך כלל כדי לקבוע את המהירות של הרפיה שריר הלב כי זה חשבונות עבור 70 - 90% של הסרת cytosolic Ca ^{2 +} ברוב תאי לב יונקים ^1. ככזה, טיפול Ca ²⁺ נורמלי ידי LTCC, RyR ו SERCA2a, וכו 'כבר נחשב המנגנונים העיקריים עבור התכווצות לקויה ורוגע בלב החולה ^1-4.

> במציאות, חינם cytosolic Ca ^{2 +} שמתפקד השליח בחשבונות צימוד EC כ 1% בסך הכל Ca תאיים ²⁺ ואת רוב Ca ^{2 +} מאוגד מאגרים תאיים Ca ^{2 +} ^5,6. זאת בשל העובדה כי מאגרים שונים Ca ²⁺ נמצאים בשפע myocytes לב, למשל, פוספוליפידים בממברנה, ATP, phosphocreatine, calmodulin, parvalbumin, myofibril TNC, שרירן, SERCA2a, ו calsequestrin ב SR. ^5,6,7. ביניהם, SERCA2a ו TNC הם מאגרי Ca ²⁺ השולט ^5,6,7. יתר על כן, Ca ^{2 +} מחייב המאגרים שלה הוא תהליך דינמי במהלך עווית (למשל, 30-50% של Ca ^{2 +} נקשרו TNC ו לנתק ממנו במהלך Ca ^{2 +} ארעיים ⁷⁾ ושינוי Ca ^{2 +} מחייב גורם נוסף "לשחרר" של חינם Ca ^{2 +} אל cytosol, תוצאות בהתאמות של Ca התאי ²⁺ קונצרט כלשהוentration. כתוצאה מכך, הפרעות של רמת תאיים Ca ^{2 +} גורמות תנועות myofilament חריגות, אשר הן המבשרים של חוסר תפקוד התכווצות והפרעות קצב ^8,9. גורמים רבים (הן פיזיולוגיים ופתולוגיים) יכול להיות מקורות שינויים שלאחר תעתיק של חלבונים myofilament, המשפיעים חציצה myofilament Ca ²⁺ myofilament רגישות Ca ^{2 +} ^8-10. לאחרונה, דווח כי מוטציות בחלבוני myofilament להגדיל את Ca ^{2 +} זיקה מחייבת וטיפול תאיים Ca ^{2 +,} מפעיל הגברה תלוית הפסקה של Ca ^{2 +} ארעי, חריגת Ca ^{2 +} שחרור, הפרעות קצב ^8. עולים בקנה אחד עם המושג הזה, אנחנו גם הראינו כי הפחתת רגישות myofilament Ca ²⁺ בלבבות חולדה עם יתר לחץ דם משתי לרגולציה-אפ של synthase תחמוצת חנקן העצבית קשורות הדיאסטולי מוגבה סיסטולי Ca ^{2 +} רמות^11, אשר בתורו, מגביר את הפגיעות של LTCC כדי האיון התלוי ²⁺ Ca ^12. לפיכך, רגישות ²⁺ myofilament Ca הוא רגולטור "פעיל" של פונקצית התכווצות הומאוסטזיס תאית Ca ^{2 +} ו myocyte. זה הפך להיות צורך לנתח אינטראקציות בין myofilament ו Ca ^{2 +} טיפול חלבונים לחקירה יסודית של צימוד myocyte EC ותפקוד הלב.

כאן אנו מתארים פרוטוקול מעריך את השינויים של רגישות ²⁺ myofilament Ca ב myocytes לב מבודד. ניתוח מקיף של פרופיל תאיים Ca ^{2 +,} Ca ^{2 +} myofilament רגישות וההתכווצות לחפור מנגנוני רומן מכניקת שריר לב בסיסית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הפרוטוקול הוא בהתאם מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה שפורסם על ידי המכונים הלאומיים האו"ם הבריאות (פרסום NIH מס 85-23, מתוקנת 1996). זה אושר על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) של האוניברסיטה הלאומית בסיאול (אישור IACUC לא .: SNU-101,213-1).

הכנת הצפה 1. (חומרי שולחן וציוד)

הכן 300 מ"ל של פתרון בידוד טריים ביום של הניסוי (מ"מ: NaCl, 135; KCl, 5.4; ₂ MgCl, 3.5; גלוקוז, 5; HEPES, 5; Na ₂ ₄ HPO, 0.4; טאורין, 20; pH 7.4 עם NaOH).
הכן 100 מ"ל של פתרון אחסון טריים ביום של הניסוי (מ"מ: 120 NaCl; KCl 5.4; MgSO ₄ 5; CaCl ₂ 0.2; נתרן-פירובט 5; גלוקוז 5.5; טאורין 20; HEPES 10; מניטול 29; pH 7.4 עם NaOH).
הכן 1 ליטר של פתרון זלוף (מ"מ: NaCl, 141.4; KCl, 4; לאא ₂ ₄ PO, 0.33; MGCl _2, 1; HEPES, 10; גלוקוז, 5.5; ₂ CaCl, 1.8; מניטול, 14.5; pH 7.4 עם NaOH).
הכן 30 מ"ל של תמיסת collagenase 1 על ידי הוספת collagenase (1 מ"ג / מ"ל), פרוטאז (0.1 מ"ג / מ"ל), אלבומין בסרום שור (BSA, 1.67mg / מ"ל), ו Ca ^{2 +} (0.05 מ"מ) עד 25 מ"ל של בידוד פִּתָרוֹן.
הכן 20 מ"ל של תמיסת collagenase 2 על ידי הוספת collagenase (1 מ"ג / מ"ל), ארגון ה- BSA (1.67 מ"ג / מ"ל), ו Ca ^{2 +} (0.05 מ"מ) 16.7 מ"ל של פתרון בידוד.
הכן 40 מ"ל של תמיסת BSA על ידי הוספת 0.4 גרם של BSA 40 מ"ל של פתרון בידוד. הפרד 10 מ"ל ו -30 מ"ל לשתי כוסות. הוספת Ca ^{2 +} 30 מ"ל של תמיסת BSA כך הריכוז הסופי Ca ^{2 +} בתמיסה BSA הוא 1 מ"מ.

2. הכנה עבור הבידוד של החדר השמאלי (LV) myocytes

עבר 8-12 בן שבוע, ספראג-Dawley זכר (SD) חולדות בכלובי תחבורה נקיות ממתקן החיה לחדר ההכנה ובידוד.
Hלאכול שתי אמבטיות מים ל -37 ^מעלות צלסיוס
הערה: השתמש באמבט מים אחד על המים - המאגר במקטורן ואת צינורות טפטוף של מערכת זלוף Langendorff. השתמש באמבט מים אחרים כדי להתסיס גזעי רקמת שריר הלב על מנת להפריד myocytes יחיד.
הוסף 5 מ"ל ו 3.3 מ"ל של תמיסת BSA (ללא Ca ^{2 +)} ל -25 מ"ל של collagenase פתרון 1 פתרון collagenase 16.7 מ"ל 2 לפצות את נפח 30 מ"ל ו 20 מ"ל, בהתאמה.
הוסף פתרון הבידוד (100 מ"ל) ו collagenase פתרון 1 (30 מ"ל) לעמודה 1 (אל"מ 1) ועמודה 2 (אל"מ 2) במערכת זלוף Langendorff, בהתאמה (איור 1 א).
חמצן פתרון הבידוד collagenase פתרון 1 אל"מ 1 ו Col.2 דרך צינור חיבור חמצן במערכת זלוף Langendorff (איור 1 א). בדומה לכך, פתרון collagenase oxygenate 2 והפתרון BSA באמבט מים רועד 100% O ₂ דרךצינור חיבור חמצן.

3. בידוד של LV myocytes

להרדים חולדה SD באמצעות זריקה intraperitoneal של נתרן pentobarbital (30 מ"ג / ק"ג) ולאשר את מצב הרדמה על ידי הבוהן צובט וחוסר השתקפות הנסיגה.
הזז את החולדה מגש לנתיחה. במצב שכיבה, לאבטח את ארבע רגליו אל צידי הגוף עם קלטת.
החל חתכים-ציריים באמצע חזה עם מספרי כירורגיות כדי לפתוח את החזה, הבטחה שלא לפגוע בלב. השתמש עוד זוג מספרי נקי לנתח את הלב מכלי החיבור (למשל, הווריד נבוב עליון ונחות, כלי ריאתי, ואב עורקים) ואת קרום קרום לב ^13.
השאירו חלק של אבי העורקים של אורך מספיק (5 - 8 מ"מ), מהדק את אבי העורקים עם מלקחיים בסדר, במהירות הר צינורית של מערכת זלוף Langendorff בתוך דקות 1 (איור 1 א). לקשור תפר חוט 4/0 בחוזקה על אבי העורקים.
הפעל את שסתום על אל"מ 1 ו perfuse בלב מבודד עם פתרון בידוד מראש התחמם מחומצן במשך 10 דקות (שיעור זלוף: 12-14 מ"ל / דקה). כבה את השסתום על אל"מ 1, להפעיל את השסתום על אל"מ 2 ו perfuse את הלב עם פתרון collagenase 1 עבור 8 - 10 דקות.
לרדת בלב מתעכל על ידי חיתוך אבי העורקים ולהעביר אותו על ידי לחיצה על אבי העורקים עם מלקחיים לתוך הבקבוק המכיל פתרון בידוד טריים (איור 1Bi). השתמש במספריים בסדר מלקחיים לחתוך את רוב הקיר בחינם LV (כולל מחצה) לחתיכות קטנות יותר (~ 22 מ"מ, איור 1Bii).
מעבירים את חתיכות לתוך בקבוק המכיל תמיסת collagenase טרי מראש התחמם מחומצן 2 (איור 1Biii). Shake למשך 10 דקות. שמור אספקת חמצן פתרון collagenase המכיל myocyte 2.
הזז את myocyte - ההשעיה לצינור 10 מ"ל צנטריפוגות באמצעות טפטפות עם נורת שאיבה ולהוסיף Ca ^{2 +} - המכיל פתרון BSA (1: 1 בנפח). צנטריפוגה ב 30 גרם במשך 2 דקות וזורקים supernatant. Re- להשעות גלולה myocyte ב 5 מ"ל של תמיסת BSA. צנטריפוגה וזורקים supernatant.
לפזר את כדורי myocyte ולשמור מיוציטים ב 10 מ"ל של פתרון האחסון מראש מחומצן ב RT (איור 1Biv-vi).
חזור על נהלים (שלבים 3.7 - 3.9) עם רקמות LV שנותרו בבקבוק.
הערה: המשך לחזור ההליכים (שלבים 3.7 - 3.9) שוב עד שרוב רקמות LV נעלמת להשיג תשואה טובה של מיוציטים.
שמור את מיוציטים בתמיסה אחסון במשך 6-8 שעות ב RT עד תום הניסויים.

4. מדידות סימולטני של הארעית ²⁺ Ca התאי Myocyte התכווצות

מיוציטים LV טען עם אסתר acetoxymethyl פורעה -2 AM (2 מיקרומטר).
הערה: בצע את כל נהלי העמסת ניסויים עם מיוציטים טעונים בתוך שפופרת כהה (האיור 1Bvii).
1. centrifuge ההשעיה myocyte (1 מ"ל) XG ב 2000 במשך 10 שניות. בטל supernatant מחדש להשעות גלולה myocyte ב 1 מ"ל של תמיסת Tyrode עם ריכוז נמוך Ca ^{2 +} (250 מיקרומטר, לוח חומרים וציוד).
2. להוסיף פורעה-02:00 ו poloxamer 407 (2 μl), בעדינות לפיזור ההשעיה myocyte, ולשמור את התערובת ב RT (20 - 24 ^מעלות צלסיוס) במשך 15 דקות (איור 1Bvii).
3. צנטריפוגה את התערובת במשך 5 שניות, לבטל את supernatant לפזר את גלולה myocyte ב 1 מ"ל של תמיסת זלוף המכיל 500 מיקרומטר Ca ^{2 +.} לאחר 10 דקות, צנטריפוגה את התערובת במשך 5 שניות וזורקים supernatant.
4. הוסף פתרון זלוף טריים (500 מיקרומטר Ca ^{2 +,} 1 מ"ל) ולשמור את פורעה-02:00 - גלולה myocyte טעון בפתרון זה עבור הקלטות.
מדידה של התכווצות myocyte LV ו- CA התאי ²⁺
1. לפני ההקלטה, למלא את הצינור זלוף שיוצא דרךז'קט מים עם פתרון Tyrode, שהוא מחומם מראש ל 36 ^מעלות צלסיוס
2. מניחים כמה טיפות של AM 2 פורעה - השעיה myocyte LV טעון על החדר של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה במשך 5 - דקות 8. לאט perfuse הפתרון Tyrode (2.2 mL / min).
3. לחץ על כפתור "התחל" על הפנל הקדמי של הממריץ הדיגיטלי להתחיל גירוי שדה (2 הרץ).
  הערה: מתח המוצא (10 V, 5 msec משך) מוחלים על מיוציטים בתא באמצעות חוטי פלטינה ממוקמים משני צדי האולם.
  1. מיוציטים בוחר שחוזה ביציבות (לא אלה מוצגים פיגמנטציית-יתר או התכווצות היפו) להקלטה.
4. התאם את myocyte של בחירה במצב האופקי של מערכת זיהוי מבוסס וידאו sarcomere ולהתאים את הפוקוס של המיקרוסקופ כדי להשיג תמונות אופטימליות של סרקומר. מקם את הקופסה המלבנית הסגולה על האזור שבו סרקומר ברור הם נצפו בבירור עד לממוצעבאורכי sarcomere (שיא אדום) מציג פסגה חדה יחידה (איור 2 א, תמונה תחתונה).
5. רשום את השינויים באורך sarcomere בתגובה לגירוי שדה (איור 2 א 'וב').
  הערה: השתמש מיוציטים טעונים בתוך 1 - 2 שעות.
6. התאם את הצמצם של המצלמה כך שהשדה במערכת זיהוי sarcomere וידאו מבוסס הוא בגודל של (איור 2 א) myocyte. לעורר את myocyte עם עירור ב 360 ננומטר / 380 ננומטר פליטה ב 510 ננומטר (תדירות הרכישה 1,000 הרץ). קיצור sarcomere שיא ויחס AM Fura2 עם גירוי שדה (תרשים 2B).

5. הערכת רגישות ²⁺ Myofilament Ca

ממוצע אורכי sarcomere ו Ca ^{2 +} ארעי ב יציב (10 - 20 עקבות) ואת עלילת לולאת שלב המטוס של יחס פורעה-2 לעומת אורך sarcomere מאותו myocyte (שניהם עם ערך נמדדשינויים של ודלתה; איור 2 ג).
בכל עלילה, להגדיר יחס -2 פורעה ב -50 הרפיה% ₍₅₀ EC, איור 2C). השוואת שתי הלולאה ו- EC ₅₀ של כל התערבות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מיוציטים LV מבודדים לבבות עכברוש נורמלי יתר לחץ דם. רוד בצורה מיוציטים עם פסים ברורים (מייצג סרקומר) ואת צירים יציבים בתגובה לגירוי שדה נחשבים להיות מיוציטים האופטימלי ונבחרים להקלטות (איור 2 א). בדוגמה המוצגת F igure 2A, פורעה 2 לפני הצהריים -loaded myocyte LV ממוצבת בצורה אופקית ואת הצמצם של המצלמה מותאמת כך myocyte תופסת את רוב בתחום ההקלטה ואזור רקע מינימלי כלול. בתחום ההקלטה, להתאים את ממדי המלבן הסגול ידי לחי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן אנו מתארים את הפרוטוקולים כדי להעריך את השינויים של רגישות ²⁺ myofilament Ca ב myocyte הלב יחיד מבודד ולהדגיש את החשיבות של מדידת פרמטר זה לצד תכונות אלקטרו, הארעיים Ca ^{2 +} תאיים, ודינמיקה myofilament. הסיבה לכך היא כי ההקלטות של אחד או שניים מהפרמטרים לא יכולות להסביר את מנגנוני התכווצות לב ורגיעה. בניגוד לשיטות קונבנציונליות המודדים התכווצות myocyte ופרופיל Ca ^{2 +} תאי בנפרד ^1, השיטה הנוכחית בוחנת גם פרמטרים במקביל באותו myocytes

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

מחקר זה מומן על ידי תוכנית המחקר למדע בסיסי באמצעות קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) במימון משרד החינוך, המדע והטכנולוגיה (2013068067); על ידי התכנית הבוגרת 21 מוח קוריאה של משרד קוריאני חינוך, מדע והטכנולוגיה, אונ' הלאומית בסיאול החולה, האגודה הקוריאנית של יתר לחץ דם (2013), קרן מחקר SK טלקום (לא. 3420130290) ומן הקרן הלאומית למדע הטבעי של סין (NSFC 31,460,265; NSFC 81,260,035).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Sprague Dawley חולדה	Koatech		8-12 שבועות
פנטוברביטל נתרן	Hanlim Pharmaceutical (קוריאה)	AHN901	קוד ביטוח: 645301220
NaCl	Sigma	S9625
KCl	Sigma	P4504
NaH₂PO₄	Sigma	S8282
HEPES	Sigma	H3375
גלוקוז		G8270
CaCl₂	Biosesang	C2002
MgCl₂	Biosesang	M2001
מניטול	Sigma	M4125
MgSO₄	Sigma	M5921
נתרן פירובט	סיגמא	P2256
טאורין	Merck	8.08616.1000
Na₂HPO₄	Sigma	71649
אלבומין עוברי בקר	סיגמא	A7906
קולגנאז סוג 2	וורת'ינגטון	LS004177
פרוטאז	סיגמא	P6911
Fura-2 (AM)	בדיקות מולקולריות	F1221
פלורוניק F127 תמיסה 20% ב-DMSO	Invitrogen	P3000MP
אמבט מים רועדים	צ'אנג שין דגם מדעי	: C-108
IonWizard Softwae Suite	IonOptix Ltd		רכישה וניתוח של נתוני צימוד EC במיוציטים
מיוציטים סידן & מערכת הקלטת התכווצות	IonOptix Ltd
אמבט מים במחזור	BS-Tech	BW2-8
מיקרוסקופ פלואורסצנטי מיוציטים	Nikon	DIATPHOTO 200
MyoCam-S Power	IonOptix
פלואורסצנטי & זיהוי וידאו	IonOptix	MyoCam-S
CFA300
PMT400
פלואורסצנטי & ממשק מערכת	IonOptix	FSI700
עירור מקור אור	IonOptix	mSTEP
מנורת ARC בעוצמה גבוהה ספק כוח	Cairn Reseach
בקר גלגל	מסנן IonOptix	GB/MUS200
ממריץ דיגיטלי	מערכות רפואיות Corpart	S-98 Mutimode
קומפוזיציות של פתרונות ניסיוניים
שם	חברה	>מספר קטלוגי	Comments
Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	ריכוז (mmol) 135
ריכוז KCl	Sigma	P4504	(ממול) 5.4
ריכוז HEPES	Sigma	H3375	(ממול) 5
ריכוז גלוקוז	סיגמא	G8270	(ממול) 5
MgCl₂	Biosesang	M2001	ריכוז (ממול) 3.5
ריכוז CB2742654 טאורין	סיגמא		(ממול) 20
Na₂HPO₄	סיגמא	71649	ריכוז (ממול) 0.4
תמיסת אחסון (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	ריכוז (ממול) 120
KCl	סיגמא	P4504	ריכוז (ממול) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	ריכוז (ממול) 10
גלוקוז	סיגמא	G8270	ריכוז (ממול) 5.5
CaCl₂	Biosesang	C2002	ריכוז (מול) 0.2
מניטול	סיגמא	M4125	ריכוז (ממול) 29
מ"ג<תת>4	סיגמא	M5921	ריכוז (ממול) 5
נתרן פירובט	סיגמא	P2256	ריכוז (ממול) 5
טאורין	סיגמא		ריכוז CB2742654 (mmol) 20
תמיסת זלוף (תמיסת Tyrode, pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	ריכוז (mmol) 141.4
KCl	Sigma	P4504	ריכוז (mmol) 4
NaH₂PO₄	Sigma	S8282	ריכוז (mmol) 0.33
ריכוז HEPES	Sigma	H3375	(ממול) 10
גלוקוז	סיגמא	G8270	ריכוז (ממול) 5.5
CaCl₂	Biosesang	C2002	ריכוז (מילימול) 1.8 עבור העמסת Fura 2AM, ריכוזי CaCl2 הם 0.25 מ"מ ו-0.5 מ"מ
MgCl₂	Biosesang	M2001	ריכוז (mmol) 1
ריכוז מניטול	סיגמא	M4125	(mmol) 14.5
תמיסת קולנגנאז 1
תמיסת בידוד (30 מ"ל)
אלבומין עוברי בקר (תמיסת BSA 5 מ"ל)			ריכוז (מול) 1.67 מ"ג/מ"ל
קולגנאז סוג 2	ריכוז LS004177 וורת'ינגטון		(מול) 1 מ"ג/מ"ל
ריכוז פרוטאז	סיגמא	P6911	(ממול) 0.1 מ"ג/מ"ל
CaCl₂	Biosesang	C2002	ריכוז (ממול) 0.05 מ"מ
תמיסת קולנגנאז 2
תמיסת בידוד ( 20 מ"ל)
אלבומין עוברי בקר (תמיסת BSA 3.3 מ"ל)			ריכוז (מ"ל) 1.67 מ"ג/מ"ל
קולגנאז סוג 2	ריכוז LS004177 וורת'ינגטון		(מילי) 1 מ"ג/מ"ל
CaCl<תת>2	Biosesang	C2002	ריכוז (מ"מ) 0.05 מ"מ
תמיסת בידוד תמיסת
( 40 מ"ל)
ריכוז אלבומין עוברי בקר	סיגמא	A7906	(ממול) 400 מ"ג
CaCl₂	Biosesang	C2002	ריכוז (מול) 1 מ"מ

BSA

מקורות

Bers, D. M., et al. Cardiac excitation-contraction coupling. Nature. 415 (6868), 198-205 (2002).
Eisner, D. A., et al. Integrative analysis of calcium cycling in cardiac muscle. Circ Res. 87 (12), 1087-1094 (2000).
Palmiter, K. A., et al. Molecular mechanisms regulating the myofilament response to Ca2+: implications of mutations causal for familial hypertrophic cardiomyopathy. Basic Res Cardiol. 92 (S1), 63-74 (1997).
Missiaen, L., et al. Abnormal intracellular Ca2+ homeostasis and disease. Cell Calcium. 28 (1), 1-21 (2000).
Trafford, A. W., et al. A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes. Pflugers Arch. 437 (3), 501-503 (1999).
Berlin, J. R., et al. Intrinsic cytosolic calcium buffering properties of single rat cardiac myocytes. Biophys J. 67 (4), 1775-1787 (1994).
Robertson, S. P., et al. The time-course of Ca2+ exchange with calmodulin, troponin, parvalbumin, and myosin in response to transient increases in Ca2+. Biophys J. 34 (3), 559-569 (1981).
Schober, T., et al. Myofilament Ca2+ sensitization increases cytosolic Ca2+ binding affinity, alters intracellular Ca2+ homeostasis, and causes pause-dependent Ca2+-triggered arrhythmia. Circ Res. 112 (2), 170-179 (2012).
Briston, S. J., et al. Balanced changes in Ca buffering by SERCA and troponin contribute to Ca handling during β-adrenergic stimulation in cardiac myocytes. Cardiovasc Res. 104 (2), 347-354 (2014).
Patel, B. G., Wilder, T., John Solaro, R. J., et al. Novel control of cardiac myofilament response to calcium by S-glutathionylation at specific sites of myosin binding protein C. Front Physiol. 4, 336(2013).
Jin, C. Z., et al. Myofilament Ca2+ desensitization mediates positive lusitropic effect of neuronal nitric oxide synthase in left ventricular myocytes from murine hypertensive heart. J Mol Cell Cardiol. 60, 107-115 (2013).
Wang, Y., et al. Modulation of L-type Ca2+ channel activity by neuronal nitric oxide synthase and myofilament Ca2+ sensitivity in cardiac myocytes from hypertensive rat. Cell Calcium. 58 (3), 264-274 (2015).
Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M., et al. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. J Mol Cell Cardiol. 51 (3), 288-298 (2011).
Spurgeon, H. A., et al. Cytosolic calcium and myofilaments in single rat cardiac myocytes achieve a dynamic equilibrium during twitch relaxation. J Physiol. 447, 83-102 (1992).
Preston, L. C., et al. Functional effects of the DCM mutant Gly159Asp troponin C in skinned muscle fibres. Pflugers Arch. 453 (6), 771-776 (2007).
Willott, R. H., et al. Mutations in Troponin that cause HCM, DCM AND RCM: what can we learn about thin filament function? J Mol Cell Cardiol. 48 (5), 882-892 (2010).
Yasuda, S. I., et al. A novel method to study contraction characteristics of a single cardiac myocyte using carbon fibers. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (3), H1442-H1446 (2001).
Sears, C. E., et al. Cardiac neuronal nitric oxide synthase isoform regulates myocardial contraction and calcium handling. Circ Res. 92 (5), e52-e59 (2003).
Ashley, E. A., et al. Cardiac nitric oxide synthase 1 regulates basal and beta-adrenergic contractility in murine ventricular myocytes. Circulation. 105 (25), 3011-3016 (2002).
Zhang, Y. H., et al. Reduced phospholamban phosphorylation is associated with impaired relaxation in left ventricular myocytes from neuronal NO synthase-deficient mice. Circ Res. 102 (2), 242-249 (2008).
Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B., et al. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
Grynkiewicz, G., et al. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Fura 2AM Langendorff Patch Clamp