הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

תרפיה adenoviral ג'ין עבור סוכרתית keratopathy: השפעות על ריפוי פצע גזע ביטוי נייד מרקר ב קרניות אדם איברים בתרבית תאים לימבלית אפיתל

8.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54058

⸱

7 באפריל 2016

 ,  , 
1Eye Program, Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Departments of Biomedical Sciences and Neurosurgery, Cedars-Sinai Medical Center, 2David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

במאמר זה

סיכום

דוגמה לטיפול גנטי אדנו-ויראלי בקרניות אנושיות בתרבית איברים סוכרתיים מוצגת לקראת נורמליזציה של ריפוי פצעים מושהה והפחתה ניכרת בביטוי סמני תאי גזע אפיתל בקרניות אלה. הוא גם מתאר את האופטימיזציה של תהליך זה בתרביות אפיתל לימבליות מועשרות בתאי גזע.

תקציר

מטרת פרוטוקול זה היא לתאר שינויים מולקולריים קרני סוכרת אדם להדגים כיצד הם ניתן להקל על ידי ריפוי גנטי adenoviral ב קרניות איבר תרבותי. המחלה בקרנית הסוכרתית היא סיבוך של מחלת סוכרת עם מומים תכופים של עצבים קרניים וריפוי פצע אפיתל. גם תעדנו ביטוי ישתנה באופן משמעותי של סמני תא גזע כמה משוערים אפיתל קרניות סוכרת אדם. כדי להקל את השינויים האלה, ריפוי גנטי adenoviral יושם בהצלחה באמצעות גברת ביטוי ביטוי פרוטו-אונקוגן-נפגש ג ו / או downregulation של מטלו-10 מטריקס proteinases (MMP-10) ו cathepsin צלזיוס זה טיפול מואץ ריפוי פצע ב קרניות סוכרת גם כאשר רק תא תאי גזע limbal היה transduced. את התוצאות הטובות ביותר התקבלו עם טיפול משולב. להשתלה לחולה אפשרית של תאי גזע מנורמלים, מוצגת דוגמא גם של optimizatiעל של תמרת גן בתרביות תאים מועשרות גזע באמצעות משפרי polycationic. גישה זו עשויה להיות שימושי לא רק הגנים שנבחרו אלא גם עבור מתווכים אחרים של ריפוי הפצע אפיתל הקרנית גזע תפקוד התא.

מבוא

המחלה בקרנית הסוכרת בעיקר תוצאת אפיתל ניוונית (keratopathy) ואת העצב (נוירופתיה) שינויים. הוא לעתים קרובות לידי ביטוי על ידי הליקויים של ריפוי פצע אפיתל והפחתת עצב קרני 1-4. סוכרת 60-70% העריכו יש 1,3 בעיות קרניות שונות. המחקרים שלנו זיהו מספר חלבונים סמן עם ביטוי שונה ב קרניות סוכרת האדם כולל downregulation של (הקולטן לגורם הצמיחה hepatocyte) פרוטו-אונקוגן-נפגשו ג ואת הגברת הביטוי של מטלו-10 מטריקס (MMP-10) ו cathepsin F 5, 6. גם תעדנו ירד באופן משמעותי ביטוי מספר סמני תא גזע המשוערת אפיתל קרניות סוכרת האדם.

במחקרים הקודמים פתחנו ריפוי גנטי adenoviral המבוסס לנרמל את רמות הסמנים שינה סוכרת באמצעות מערכת התרבות איבר קרנית סוכרת אדם, אשר מציגה ריפוי פצע איטי, סוכרתשינויי סמן, גזע הפחתת התא סמן ביטוי דומה קרניות vivo לשעבר 7,8. התמדה זו של שינויים שנראה בשל קיומו של זיכרון מטבולי אפיגנטיים 9. מערכת תרבות זה הייתה מעבר למה משומש עבור ריפוי גנטי. היעדים עבור טיפול זה נבחרו מתוך סמנים גם עם ביטוי מופחת ב קרניות סוכרתיות (נפגש-ג פרוטו-אונקוגן), או ביטוי מוגבר (MMP-10 ו F cathepsin).

טיפול adenoviral (AV) שמש ב קרניות האיבר תרבותי השלמות או בתא לימבלית ההיקפי corneoscleral בלבד. תא זה מטפח בתאי גזע אפיתל שמתחדשים האפיתל של הקרנית ולהשתתף באופן פעיל ריפוי הפצע 4,10-15. הנה, פרוטוקולים מסופקים תרבות איבר קרנית אנושית בריאה סוכרתית, ריפוי פצעים אפיתל, בידוד ואפיון של תרביות תאים לימבלית מועשרות בתאי גזע, ותא adenoviral תמרה קרנית. שֶׁלָנוּתוצאות מראות את הכדאיות של טיפול זה לנרמול ביטוי סמן ואת ריפוי פצעים קרני סוכרת להשתלה עתידית אפשרית. הם גם מראים כי הטיפול המשולב הוא הדרך היעילה ביותר כדי לשחזר דפוס סמן נורמלי ולריפוי אפיתל הקרני סוכרת 16-18.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

המחלף הלאומי למחקר מחלות (NDRI, פילדלפיה, פנסילבניה) ספק עיניים קרניות אדם בריאים סוכרת שלאחר מוות הסכימו. פרוטוקול אוסף אדם רקמות של NDRI יאושר על ידי הוועדה הניהולית ובכפוף National Institutes of Health הפיקוח. מחקר זה נערך תחת דירקטוריון הסקירה המוסדי במרכז הרפואי Cedars-Sinai אשר (IRB) פרוטוקול פטור EX-1055. שיתוף פעולת מנתחים קרניים, בני זוג. א Maguen וי רבינוביץ, סיפק חישוקי corneoscleral שנזרקו לבידוד תרמי של תרבויות אפיתל הקרנית גזע מועשר התא. מחקר זה נערך תחת פרוטוקול IRB אשר Pro00019393.

1. תרבות איברי אדם קרנית

הערה: קרניות רגילות סוכרת או עיניים כולו מתקבלות במדיום אחסון קרני מצונן (למשל, Optisol GS) תוך 48 שעות לאחר מותו מהספק הלאומי NDRI.

  1. הסר את קרניות ממכל אחסון עם מלקחיים ולשטוף אותם פעמיים in את התערובת אנטיביוטיקה antimycotic (ABAM). במקרה של עיניים שלמות, לחתוך את הקרניות מתוך גלובס במספריים מעוגלים. השאר לפחות שפת 5 מ"מ הלחמית וגם לשטוף את הקרניות ב ABAM.
  2. מכינים את תערובת להציב קעירות הקרנית. הוא מורכב מדיום חיוני מינימום סרום ללא (MEM) ABAM המכיל, 1 מ"ג / מ"ל ​​עגל העור קולגן (עשוי פתרון המניות של 10 מ"ג / מ"ל ​​בחומצה 0.1 N אצטית), 1% אגר, ו-סלניט אינסולין-transferrin להשלים 7.
  3. מיקרוגל תערובת זו רותחת לעיקור והתפרקות אגרה. זה עלול לקחת עד 1 דקות לכל דבר לפזר. השאר את כובע הצינור פתוח מעט בגלל התערובת גולש בקלות כשזה שחין. מסיבה זו, מספר מחזורים רותחים עשויים להידרש, כל 10-15 שניות. לצנן את התערובת 37-39 מעלות צלזיוס.
  4. מניחים את קרניות הצד אפיתל למטה ב -60 סטרילי מ"מ צלחות. מלא את הקעירות הקרנית עם כ 0.5 מיליליטר של התערובת מתוארת 1.2. התערובת מבצר על הקרניות בתוך 2 דקות.
  5. מניח את הקרניות צד אגר למטה במנות 60 מ"מ סטרילי ולהוסיף המדיום המלא המכיל ממ עם ABAM, והאינסולין-transferrin-סלניט תוספת 7 (37 ° C) כדי לשמור על הרמה שלה כ בבית לימבוס לתרבות ממשק נוזל אוויר. היקף המדיום הוא 7-8 מ"ל לכל צלחת.
  6. מניח את הכלים עם הקרניות לתוך חממת 5% CO 2 humidified עם מחבת מים (בדרך זו, רמת לחות נשמרת בבית או מעל 95%) ב 35 ° C (טמפרטורת קרנית נורמלית). הוספת 100 בינוני μl (שתי טיפות) יומי על האפיתל כדי ללחלח את הקרניות.
  7. לפקח על המורפולוגיה הקרנית ואת כדאיות תא אפיתל מיקרוסקופית תחת אור עובר באמצעות מיקרוסקופ רגיל עם מטרת 4X. לעשות זאת פעם אחת ביום.
  8. שנה את בינונית כל שלושה ימים. הקרניות יכולות להיות מתורבתות במשך שלושה שבועות לפחות. עבור ניסויי הריפוי הגנטי, התרבות הקרנית למשך 3-5 ימים, ולאחר מכן, אנקודריםדואר עם גנים של עניין (4.1-4.4), להשאיר למשך 3-5 ימים נוספים תלוי transgene ובכפוף פרוטוקול ריפוי הפצע (2.1-2.4).

ריפוי 2. אפיתל הפצע

הערה: הקרניות הסוכרות, את הטריה אפיתל על ידי גירוד מכאני הוא לא ריאלית מכיוון הקרום במרתף אפיתל שברירי מנותק בתהליך, מה שלא קורה ב הקרניות הנורמליות. לכן, כדי לשמור על הקרניות הנורמליות סוכרת בתנאים דומים של ריפוי פצעים, הסרה כימית של האפיתל עם n-heptanol משמשת 19. הליך זה מסיר את האפיתל אך מותיר אחריו קרום במרתף ללא פגע בשתי הקרניות הנורמליות סוכרתיות.

  1. כדי לבצע טרי אפיתל מרכזי 20, למקם דיסק נייר סינון 5 מ"מ טבול n-heptanol על פני השטח הקדמי של הקרנית המרכזי עבור 75 שניות.
  2. הסר את המסנן ולשטוף את הקרניות במדיום מלא. מלאו את קעירות עם 0.5 מ"ל קולגן אגרתערובת ותרבות כמו 1.4. לאחר טרי, לתאי האפיתל בדרך כלל מתים ו להשיל והותירו אחריו קרום במרתף ללא פגע מיקרוסקופי 7.
  3. השתמש 8.5 מ"מ דיסקים ליצור פצעים אפיתל גדולים בניסויים עם הריפוי הגנטי לימבלית בלבד. פעולה זו תבטיח את מעורבותם של תאי גזע limbal בתהליך הריפוי.
  4. לפקח על הריפוי הקרני מיקרוסקופי. הפוך צילומים בבית 4X ו 10X כל יום עד הפגם אפיתל נרפא לחלוטין. תהליך ההחלמה יכול להימשך בין 2 עד 15 ימים, בהתאם למדינה (רגיל או סוכרת) וגודל פצע.
    הערה: במהלך תהליך הריפוי, תאי עכביש דמוי שחורים הם נצפו על מישור המוקד העליון. תאים אלה הם keratocytes סטרומה אפופטוטיים מת לאחר הסרת האפיתל 4. הריפוי הוא נחוש בדעתו להיות שלם כאשר תאים המתים אלה הם מגודלים על ידי האפיתל הריפוי אינם גלוי (איור 2, הבלעה).
  5. לאחר ריפויהשלמתי, לחתוך את הקרניות לשתיים, להטביע אותם במתחם אוקטובר ותהליכים, immunofluorescence עקיפה על סעיפי cryostat או כתמים מערביים 16,21.

3. בידוד של תאים לימבלית ותחזוקה של תרבויות גזע מועשר ניידות

הערה: הכן את תאי הגזע אפיתל limbal העיקרי (LESC) תרבויות -enriched מן המכון corneoscleral. החישוקים מגיעים מתורמים בריאים מושלכים לאחר השתלות קרניות מתקבלות המנתחים הפעולה במדיום האחסון קרני הסטנדרטי (למשל, Optisol). אחרת, התרבויות מועשרות LESC ניתן לקבל חישוקי הניכרת מן הקרניות כולו נורמליות סוכרות או גלובס שהתקבלו NDRI במדיום האחסון הקרני.

  1. אם הקרניות או הגלובוסים השלמים משמשות, בתחילה מבודד באזורים לימבלית. לשם כך, למקם את הקרנית על צלחת פלסטיק סטרילי עם צד אפיתל עד ולהסיר באזור המרכז עם מקדחת 9 מ"מ (סכין קרני מעגלי).מחק חלק מרכזי זה. אז שתחתוך את האזור לימבלית באמצעות מקדחת 13 מ"מימ וזורקים את חלק הלחמית החיצוני. כדי לבודד תאים להשתמש השפה לימבלית דמוית בייגל. לפני בידוד תא, להסיר את תאי האנדותל ושאריות דבקות של הקשתית מהצד הפנימי של הקרנית הפוכה האפיתל משטח עם מקלון צמר גפן סטרילי.
  2. לבודד גליונות תא לימבלית באמצעות טיפול dispase. דגירה כל שפת corneoscleral עם dispase 2.4 U / ml II ב 1.5 מ"ל keratinocyte סרום ללא בינוני (KSFM) בתוספת 10% עוברי בסרום שור (FBS) ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות 22.
  3. הזז בעדינות את גיליון תא אפיתל limbal מעבר לשפת תחת מיקרוסקופ סטריאו לנתח עם מלקחיים לנתק את התאים ב 1 מ"ל של טריפסין 0.25% - פתרון EDTA 0.02% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. שוטפים את התאים ב 10 מ"ל של מדיום (למשל, Epilife) ו גלולה אותם XG ב 300 בצנטריפוגה בטבלה העליונה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. ה resuspendתאי דואר במדיום תרבות: בינוני עם N2, B27 ותוספי צמיחה keratinocyte אדם, ו -10 גורם הגדילה באפידרמיס ng / ml (EGF).
  6. זרעים התאים ב 3,000-5,000 תאים / מ"ל צלוחיות או 60 מנות מ"מ מצופה בתערובת של חלבונים בממברנה במרתף האדם כולל פיברונקטין, קולגן מסוג IV, ו laminin (FCL), ב 0.5-1 מיקרוגרם / 2 ס"מ, ב KSFM בֵּינוֹנִי.
  7. התרבות התאים בתוך (% 95 או לחות גבוהה) humidified CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עד שהם יוצרים monolayers ומחוברות במלואו. פעולה זו עשויה להימשך 1-2 שבועות.
    הערה: באופן קבוע לאשר את זהות התא על ידי מכתים immunocytochemical חיובית עבור סמנים המשוערת LESC כולל Pax6, קרטין (K) 14, K15, K17, ו ΔNp63α. הפרטים המכתימים כולל הנוגדנים הראשוניים פורסמו 8,16-18,22.
  8. למעבר התאים והמחוברים, להתייחס אליהם עם 1 מיליליטר של 0.05% פתרון טריפסין (1: 5 דילול של פתרון 0.25%) במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הוסף 5 מ"ל סויה trפתרון ypsin מעכב (10 מ"ג / מ"ל) מדולל 1: 4 במדיום, צנטריפוגות התאים כמו 3.5.
  9. שטוף את התא הגלול ב 3 מיליליטר של תמיסת מעכב טריפסין סויה מדוללת. פלייט תאים על-מצופה FCL (ראה 3.7) מנות או שקופיות קאמרית זכוכית ב 2 x 10 4 תאים / מ"ל.

4. תמרת adenoviral של קרניות איברים-תרבותיים

הערה: adenoviruses רקומביננטי (AV) כוללים AV-וקטור (לא הגן הוכנס), AV-cmet (עם מסגרת קריאה פתוחה גן-נפגשו ג), AV-shM10 (עם shRNA כדי MMP-10), ו AV-shCF ( עם shRNA כדי cathepsin F). הם E1 / E3-deleted סוג 5 AV לבטא גנים תחת השליטה של ​​אמרגן ציטומגלווירוס מוקדם המיידי הגדול. וירוסי AV-cmet נוצרים באמצעות כרית וקטור AV / CMV / V5-DEST 16. הוירוסים AV-shRNA נוצרות מותאם אישית על ידי subcloning של רצפי shRNA יחד עם האמרגן HH1 ורצף תג ה- GFP מן וקטור iLenti-EGFP לתוך שכפול-יוצלח (-E1 / -E3) הומאn AV סוג 5 הגנום באמצעות Adeno-4 ביטוי במערכת 17.

  1. Transduce קרני איבר תרבותי אחד מכל זוג עם וקטור AV ועוד קרני, עם AV ויסות-ביטוי גנים. השתמש-cmet AV 0.8 כדי 1.25 x 10 8 יחידות להרכיב פלאק (pfu) לכל קרנית במדיום התרבות במשך 48 שעות ב 37 ° C שמירת הקרניות מתחת לפני השטח הבינוני כל אחד טוב של צלחת 24 באר. השתמש וירוסי AV-shRNA ב 1-2 x 10 8 pfu לכל קרנית.
  2. השתמש וירוסים עבור התמרה במדיום מלא בתוספת 75 מיקרוגרם / מ"ל ​​סילדנאפיל. מגיב זה מפעיל את תחבורת caveolin הקלה ספיגה ויראלי ידי לתאי האפיתל 21. בשל מחצית חיים קצרים של sildenafil בתמיסות מימיות, מחדש להוסיף את אותה הכמות של 4-5 שעות הבינוניות מאוחר יותר. הטיפול הסטנדרטי הוא למשך 48 שעות.
  3. עבר קרניות כדי מנות חדשות עם מרית תרבות סטרילי סוף סיבוב במדיום ללא AV שמירה על הרמה הבינונית בבית לימבוס. לאחר ההרחבהitional 4-8 ימים בממשק הנוזל-האוויר, תהליך קרני שטופל AV עבור ניתוחים או בדיקה שונים לריפוי פצע אפיתל (ראה לעיל). באופן שגרתי ללחלח את הקרניות במהלך התרבות על ידי הוספת 100 בינוני μl (שתי טיפות) על גבי הקרנית.
  4. עבור התמרה של תאים לימבלית בלבד, דגירת הווירוסים עם הקרניות על הממשק הנוזל אוויר עם רמה בינונית בבית לימבוס, כדי למנוע תמרה של האפיתל המרכזי.

5. התמרה adenoviral של תאים בתרבית לימבלית

  1. שמירה על תרבויות LESC מועשר בטווח הבינוני עם 10 ng / ml EGF (ראה 3.5) על צלחות פלסטיק מצופה בתערובת FCL ברמה של 0.5 מיקרוגרם / 2 ס"מ.
  2. Transduce תאים בתרבית שהגיעו 70-80% confluency עם AV מחסה הגן חלבון פלואורסצנטי ירוק (AV-GFP) או shRNA-GFP-מקושקשות AV במגוון של ריבוי של זיהום (משרד הפנים: 1-300 pfu / תא) , בטווח הבינוני עם 2 ng / ml EGF. בצעו את transduction עבור 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס בהיקף מינימלי (0.2 מ"ל) ואחריו 20 שעות ב 0.5 מ"ל בינוני. Sildenafil מפעיל התחבורה caveolin אינו נחוץ עבור התמרה תרבית תאים.
  3. השתמש באחת ריאגנטים הבאים המאפשרים AV מחייב פני התא כדי לשפר את היעילות התמרה AV: או polycations מגיב התמרה (1 מיקרוגרם / מ"ל ​​פולי- L- ליזין או 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​polybrene), או 6 μl / מ"ל ​​( למשל, ViraDuctin), או 20 μl / מ"ל משפר התמרה (למשל, ibiBoost).
  4. לאחר ההחלפה הבינונית עבור אחד ללא AV, דגירת תאים בתרבית למשך 4 ימים, בחממת humidified CO 2 ולהעריך רמת ביטוי GFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך.
  5. השתמש assay ריפוי פצע השריטה להעריך נדידת תאים בתרבויות-transduced AV. לגדל את תאי השקופיות הקאמריות multiwell. הפוך את הפצעים בשכבה ידי גירוד תאים בתנועה ליניארית ישר עם pi 200 μlטיפ pette. לאחר ופצעו, לשנות את המדיום עבור אחד טרי כדי להסיר את התאים מנותקים.
  6. לצלם את אבריהם כל יום עם מצלמה דיגיטלית המחוברת מיקרוסקופ הפוכה בהגדלה 4X. רשמו את הזמן שבו הריפוי יושלם (בקצות הפצע באים במגע לאורך הפצע כולו).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הראינו בעבר כי בתרבויות האיברים הקרניות, ההבדלים בביטוי של סמנים סוכרים (למשל, חלבונים בממברנה מרתף integrin α3β1) וריפוי פצעים בין הקרניות הנורמליות סוכרת נשמרים. מערכת תרבות זו הייתה נתון הריפוי הגנטי שמטרתה נרמול רמות סמנים שינה-סוכרת, c-Met, MMP-10, ו cathepsin פ

כאשר האפיתל של הקרנית כולה transduced עם AV-cmet, או AV-shRNA כדי MMP-10 ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הקרנית שנראית רקמות אידיאליות עבור ריפוי גנטי בשל המיקום פני השטח שלו שבו למסירת הגן, כמו גם להערכת השפעות היעילות בצד, קלה. עם זאת, תרגום קליני של גישה חזקה זה עדיין איטי בשל מידע נדיר על גורמים גנטיים של המחלות הקרניות ואת מטרות הריפוי הגנטי 24. סיבוכים סוכרים כולל שינויים בקרנית עלולים להיות אפיגנטיים בעיקר בטבע, אשר מיתרגם זיכרון מטבולי 9. מסיבה זו, הרקמות הסוכרות והתאים לשמר הליקויים שלהם לשעבר vivo ו ניתן ללמוד בתרבות האיברים ורקמות. כמו כן, סו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים.

תודות

אנו מודים בתודה על התמיכה הכספית של NIH/NEI R01 EY13431 (AVL), מענק CTSI UL 1RR033176 (AVL), ומענקים מהמכון לרפואה רגנרטיבית, המרכז הרפואי Cedars-Cedars.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מדיום חיוני מינימליתרמו פישר סיינטיפיק11095-080
אופטיזול-GS באוש & Lomb50006-OPT
ABAM תערובת אנטיביוטית-אנטי-פטרייתיתThermo Fisher Scientific15240062
קולגן עור עגל סיגמא-אולדריץ' אגר C9791
דרגת תרבית רקמותסיגמא-אולדריץ' A1296
n-הפטנולסיגמא-אולדריץ' 72954-5ML-F
O.C.T. תרכובת VWR International25608-930
Dispase II Roche Applied Science4942078001
מדיום נטול סרום קרטינוציטים (KSFM) תרמו פישר סיינטיפיק17005042
מדיום EpiLife עם סידןתרמו פישר סיינטיפיקMEPI500CA
תוסף N2 בינוני, 100xתרמו פישר סיינטיפיק17502-048
B27 תוסף בינוני, 50xתרמו פישר סיינטיפיק17504-044
תוסף גידול קרטינוציטים אנושיים, 100xתרמו פישר סיינטיפיקS-001-5
טריפסין 0.25% - EDTA 0.02% עם פנול אדוםתרמו פישר סיינטיפיק25200056
טריפסין 0.25% עם פנול אדוםתרמו פישר סיינטיפיק15050065
מעכב טריפסין סויה סיגמא-אולדריץ' T6414
סרום בקר עובריThermo Fisher Scientific26140079
תוסף אינסולין-טרנספרין-סלניט (ITS)Sigma-Aldrich I3146-5ML
נוגדן לקרטין 14סנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-53253
נוגדן לקרטין 15סנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-47697
נוגדן לקרטין 17סנטה קרוז ביוטכנולוגיהSC-58726
נוגדן ל &דלתא; Np63 ואלפא;נוגדן Santa Cruz Biotechnologysc-8609
ל-PAX6נוגדן BioLegendPRB-278P-100
ל-nidogen-1R& D SystemsMAB2570
נוגדנים לאינטגרין ואלפא; 3&בטא; 1EMD MilliporeMAB1992
פיברונקטין אנושיBD Biosciences354008
למינין אנושיSigma-Aldrich L4445
קולגן אנושי מסוג IVסיגמא-אולדריץ' C6745-1ML
אדנו-וירוס המבטא MMP-10 shRNACapital BioSciencesבהתאמה
אדנו-וירוס המבטא קטפסין F shRNACapital BioSciencesבהתאמה
אדנו-וירוס המבטא shRNA מקושקש ו-GFPCapital BioSciencesבהתאמה
אדנו-וירוס המבטא c-metOriGene (פלסמיד)SC323278
אדנו-וירוס המבטא GFPKeraFASTFVQ002
סילדנפיל ציטראט, 25 מ"גפייזרמגורם
 תרמו פישר סיינטיפיקPHG0311
פולי-L-ליזיןסיגמא-אולדריץ' P4707
פוליברןסיגמא-אולדריץ' 107689-10G
ViraDuctinCell BiolabsAD-200
ibiBoostibidi, גרמניה50301
פוספט חוצץ מלח (PBS)Thermo Fisher Scientific10010049
Corning מרית קצה עגול Dow Corning3005
60 מ"מ צלחות פטריThermo Fisher Scientific174888
Nunc Lab-Tek II שקופיות תא מרובות סיגמא-אולדריץ'C6807
200 μ l טיפים פיפטBioexpressP-1233-200ספקים אחרים זמינים
מיקרוסקופ הפוך ניקוןדיאפוטספקים / דגמים אחרים זמינים
לח CO2 חממה Thermo Fisher Scientific370 (Steri-Cycle)ספקים / דגמים אחרים זמינים
מיקרוסקופ פלורסנטאולימפוס, יפןBX-40ספקים / דגמים אחרים זמינים
ניתוח מיקרוסקופ סטריאוLeica, גרמניהS4 Eספקים / דגמים אחרים זמינים
, אישיתאישיתאישית גדילה אפידרמלי בית מרקחת

מקורות

  1. Bikbova, G., Oshitari, T., Tawada, A., Yamamoto, S. Corneal changes in diabetes mellitus. Curr Diabetes Rev. 8 (4), 294-302 (2012).
  2. Calvo-Maroto, A. M., Perez-Cambrodí, R. J., Albarán-Diego, C., Pons, A., Cerviño, A. Optical quality of the diabetic eye: a review. Eye (Lond). 28 (11), 1271-1280 (2014).
  3. Tripathy, K., Chawla, R., Sharma, Y. R., Venkatesh, P., Vohra, R. Corneal changes in diabetes mellitus. DOS Times. 20 (5), 55-58 (2015).
  4. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Prog Retin Eye Res. 49, 17-45 (2015).
  5. Saghizadeh, M., et al. Overexpression of matrix metalloproteinase-10 and matrix metalloproteinase-3 in human diabetic corneas: a possible mechanism of basement membrane and integrin alterations. Am J Pathol. 158 (2), 723-734 (2001).
  6. Saghizadeh, M., et al. Proteinase and growth factor alterations revealed by gene microarray analysis of human diabetic corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (10), 3604-3615 (2005).
  7. Kabosova, A., Kramerov, A. A., Aoki, A. M., Murphy, G., Zieske, J. D., Ljubimov, A. V. Human diabetic corneas preserve wound healing, basement membrane, integrin and MMP-10 differences from normal corneas in organ culture. Exp Eye Res. 77 (2), 211-217 (2003).
  8. Saghizadeh, M., et al. Alterations of epithelial stem cell marker patterns in human diabetic corneas and effects of c-met gene therapy. Mol Vis. 17, 2177-2190 (2011).
  9. Kowluru, R. A., Kowluru, A., Mishra, M., Kumar, B. Oxidative stress and epigenetic modifications in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 48 (Sep), 40-61 (2015).
  10. Lehrer, M. S., Sun, T. T., Lavker, R. M. Strategies of epithelial repair: modulation of stem cell and transit amplifying cell proliferation. J Cell Sci. 111 (Pt 19), 2867-2875 (1998).
  11. Lu, L., Reinach, P., Kao, W. W. Corneal epithelial wound healing. Exp Biol Med. 226 (7), 653-664 (2001).
  12. Rama, P., et al. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. N Engl J Med. 363 (2), 147-155 (2010).
  13. Di Girolamo, N., et al. Tracing the fate of limbal epithelial progenitor cells in the murine cornea. Stem Cells. 48 (1), 203-225 (2014).
  14. Amitai-Lange, A., et al. Lineage tracing of stem and progenitor cells of the murine corneal epithelium. Stem Cells. 33 (1), 230-239 (2015).
  15. Di Girolamo, N. Moving epithelia: Tracking the fate of mammalian limbal epithelial stem cells. Prog Retin Eye Res. 48 (Sep), 203-225 (2015).
  16. Saghizadeh, M., Kramerov, A. A., Yu, F. S., Castro, M. G., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-met gene. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (4), 1970-1980 (2010).
  17. Saghizadeh, M., et al. Enhanced wound healing, kinase and stem cell marker expression in diabetic organ-cultured human corneas upon MMP-10 and cathepsin F gene silencing. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8172-8180 (2013).
  18. Saghizadeh, M., Dib, C. M., Brunken, W. J., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and stem cell marker patterns in organ-cultured human diabetic corneas by gene therapy of limbal cells. Exp Eye Res. 129 (Dec), 66-73 (2014).
  19. Hatchell, D. L., et al. Damage to the epithelial basement membrane in the corneas of diabetic rabbits. Arch Ophthalmol. 101 (3), 469-471 (1983).
  20. Chung, J. H., Kim, W. K., Lee, J. S., Pae, Y. S., Kim, H. J. Effect of topical Na-hyaluronan on hemidesmosome formation in n-heptanol-induced corneal injury. Ophthalmic Res. 30 (2), 96-100 (1998).
  21. Saghizadeh, M., et al. Adenovirus-driven overexpression of proteinases in organ-cultured normal human corneas leads to diabetic-like changes. Brain Res Bull. 81 (2-3), 262-272 (2010).
  22. Sareen, D., et al. Differentiation of human limbal-derived induced pluripotent stem cells into limbal-like epithelium. Stem Cells Transl Med. 3 (9), 1002-1012 (2014).
  23. Funari, V. A., et al. Differentially expressed wound healing-related microRNAs in the human diabetic cornea. PLoS One. 8 (12), e84425(2013).
  24. Mohan, R. R., Rodier, J. T., Sharma, A. Corneal gene therapy: basic science and translational perspective. Ocul Surf. 11 (3), 150-164 (2013).
  25. Liu, J., et al. Different tropism of adenoviruses and adeno-associated viruses to corneal cells: implications for corneal gene therapy. Mol Vis. 14, 2087-2096 (2008).
  26. Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4 (5), 346-358 (2003).
  27. Sharma, G. D., He, J., Bazan, H. E. P38 and ERK1/2 coordinate cellular migration and proliferation in epithelial wound healing: evidence of cross-talk activation between MAP kinase cascades. J Biol Chem. 278 (24), 21989-21997 (2003).
  28. Saika, S., et al. Role of p38 MAP kinase in regulation of cell migration and proliferation in healing corneal epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (1), 100-109 (2004).
  29. Xu, K. P., Li, Y., Ljubimov, A. V., Yu, F. S. High glucose suppresses epidermal growth factor receptor/phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathway and attenuates corneal epithelial wound healing. Diabetes. 58 (5), 1077-1085 (2009).
  30. Xu, K., Yu, F. S. Impaired epithelial wound healing and EGFR signaling pathways in the corneas of diabetic rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (6), 3301-3308 (2011).
  31. Takamura, Y., et al. Aldose reductase inhibitor counteracts the enhanced expression of matrix metalloproteinase-10 and improves corneal wound healing in galactose-fed rats. Mol Vis. 19, 2477-2486 (2013).
  32. Byun, Y. S., Kang, B., Yoo, Y. S., Joo, C. K. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves corneal epithelial innervation and wound healing in diabetic rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1948-1955 (2015).
  33. Deng, S. X., et al. Characterization of limbal stem cell deficiency by in vivo laser scanning confocal microscopy: a microstructural approach. Arch Ophthalmol. 130 (4), 440-445 (2012).
  34. Lagali, N., et al. In vivo morphology of the limbal palisades of Vogt correlates with progressive stem cell deficiency in aniridia-related keratopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (8), 5333-5342 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

פרוטו-אונקוגן c-metדה-רגולציה של MMP-10עיכוב קאתפסין Fמחזקים פוליקטיוניים
תרפיה adenoviral ג'ין עבור סוכרתית keratopathy: השפעות על ריפוי פצע גזע ביטוי נייד מרקר ב קרניות אדם איברים בתרבית תאים לימבלית אפיתל
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.