מאמר זה מתאר פרוטוקול המאפשר הדמיה פלאק Aβ עמילואיד בעכברי מודל למחלת אלצהיימר באמצעות methoxy-X04, אשר חוצה את מחסום הדם-מוח סלקטיבי נקשר בטא קפלים גליונות נמצא הפלאק Aβ ליבה צפופה. זה מאפשר הקרנת טרום סעיפים רקמה המכילה פלאק לפני immunostaining ועיבוד עבור במיקרוסקופ אלקטרונים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
גומל אור מיקרוסקופי אלקטרונים ללמוד microglial אינטראקציות עם הפלאק β-עמילואיד
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
פרוטוקול מפורט מסופק כאן כדי לזהות פלאק Aβ עמילואיד חלקים במוח ממודלי עכבר מחלת אלצהיימר לפני immunostaining טרום הטבעה (במיוחד עבור מולקולת מתאם מחייב סידן מיונן 1 (IBA1), חלבון מחייב סידן שהביע microglia) ועיבוד רקמה במיקרוסקופ אלקטרונים (EM). Methoxy-X04 הוא צבע פלואורסצנטי כי חוצה את מחסום הדם-מוח סלקטיבי נקשר בטא קפלים גליונות נמצא הפלאק Aβ ליבה צפופה. הזרקה של החיות עם methoxy-X04 שקדם להקרבת קיבעון במוח מאפשר הקרנת טרום וגיוס כוח החלקים במוח המכיל פלאק לעיבוד נוסף עם מניפולציות זמן רב. זה מועיל במיוחד כאשר לומדים פתולוגיה לספירה מוקדם באיזורים מסויימים במוח או שכבות שעשויות להכיל הפלאק מעט מאוד, נוכח רק חלק קטן של חלקים. עיבוד פוסט מורטם של סעיפים רקמה עם האדום קונגו, Thioflavin S, ו ThioflT יבין (או אפילו עם methoxy-X04) יכול לתייג יריעות β-קפלים, אבל דורשת סליקה נרחבת עם אתנול להסיר עודפי צבע והנהלים אלה אינם עולים בקנה אחד עם שימור ultrastructural. זה גם יהיה לא יעיל לבצע תיוג עבור Aβ (ו סמנים תאיים אחרים כגון IBA1) על כל החלקים במוח מן האזורים של עניין, רק כדי להניב חלק קטן המכיל לוחות Aβ במיקום הנכון. חשוב לציין, הפלאק Aβ עדיין גלויים לאחר עיבוד רקמות עבור EM, המאפשר זיהוי מדויק של אזורים (בדרך כלל עד כמה מרובע מילימטרים) לבחון עם מיקרוסקופ אלקטרונים.
מבוא
היווצרות הפלאק עמילואיד Aβ היא סימן ההיכר נוירו העיקרי של מחלת אלצהיימר (AD). עם זאת ראיה נוספת להשערה מציעה תפקידים חשובים של המערכת החיסונית 1,2 התקדמות מחלה. בפרט, נתונים חדשים ממחקרים פרה-קליניים וקליניים הוקמו תפקוד לקוי חיסון כנהג ראשי תורם לפתולוגיה לספירה. עם ממצאים אלו, תאי מערכת חיסון מרכזיים והיקפיים צמחו מטרות טיפוליות מבטיחות ובאשר לספירה 3. הפרוטוקול הבא משלב מיקרוסקופ אור אלקטרונים (EM) כדי לייצר תובנה חדשות אודות הקשר בין בתצהיר פלאק Aβ לבין שינויי פנוטיפי microglial של מחלת אלצהיימר. פרוטוקול זה מאפשר תיוג של הפלאק Aβ במודלים של עכברים של מחלת אלצהיימר באמצעות הזרקת vivo של צבע פל....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: כל הניסויים אושרו ובוצעו לפי ההנחיות של ועדת האתיקה המוסדית בעלי החיים, בהתאם המועצה הקנדית על הנחיות טיפול בבעלי החיים כמו מנוהל על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים של האוניברסיטה לאוול. APP-PS1 עכברים זכרים בין 4 ל 21 חודשים של גיל היו בשימוש. חיות אלה שוכנו תחת מחזור אור כהה 12 שעות ב 22 - 25 ° C עם גישה חופשית למזון ומים.
1. הכנת פתרון methoxy-X04
- הכן פתרון 5 מ"ג / מ"ל של methoxy-X04 9 על ידי המסת methoxy-X04 לתוך תמיסה המכילה sulfoxide דימתיל 10% (DMSO),....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
סעיף זה ממחיש את התוצאות ניתן לקבל שלבים קריטיים שונים של הפרוטוקול. בפרט התוצאות מראות דוגמאות של חלקים במוח המכיל methoxy-X04 הפלאק מוכתמים באזור מסוים ושכבות של עניין: CA1 בהיפוקמפוס, רבדים radiatum, ו lacunosum-moleculare. הפלאק ואת ארגון אזורי / שבשבת של ההיפוקמפוס הם דמיינו ברציפות באמצעות שילוב של UV ומסנן שדה בהיר (איור 1). סעיפי המוח שנבחרו לאחר מכן הם immunostained ומעובד EM תוך שמירה על מסלול של הפלאק Aβ שלהם, בהתחשב כי .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מסביר גישה המצטרפת למיקוד פלאק Aβ ליבה צפופה עם EM. Methoxy-X04 הזרקת vivo מאפשרת בחירה מהירה של חלקים במוח המכילים פלאק Aβ בתוך אזורים מסוימים ושכבות של עניין, למשל CA1 בהיפוקמפוס, radiatum שכבות, ו lacunosum-moleculare. בדוגמה הנוכחית, methoxy-X04-הקרנת טרום אוחד עם טרום הטבעה immunostaining עבור IBA1 ללמוד כיצד שונה פנוטיפים microglial אינטראקציה עם סינפסות ברמה ultrastructural בנוכחות פלאק Aβ ליבה צפופה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
אנו אסירי תודה לד"ר סצ'יקו סאטו וג'ולי-כריסטין לווסק בפלטפורמת ההדמיה הביולוגית של המרכז למחקר ב-CHU בקוויבק על הסיוע הטכני שלהם. מענקים ממועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC) RGPIN-2014-05308, קרן המחקר בנטינג וקרן הצדקה הסקוטית של קנדה ל-M.E.T תמכו בעבודה זו.
H.E.H. הוא זוכה מלגה ממשרד החינוך וההשכלה הגבוהה הלבנוני, ו-K.B. מהפקולטה לרפואה של אוניברסיטת לאוואל.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Methoxy-X04 | Tocris Bioscience | 4920 | 10 מ"ג מצע לטבליה |
| פרופילן גליקול | סיגמא אולדריץ' | W294004 | |
| דימתיל סולפוקסיד (DMSO) | פישר ביו-ריאגנטים | BP231-1 | זהירות: |
| נתרן כלורי רעיל NaCl | Sigma | S9625 | |
| נתרן פוספט מונוהידראט מונו-בסיסי | Sigma | S9638 | |
| נתרן פוספט דו-בסיסי | Sigma | S0876 | |
| Tris Hydrochloride | פישר ביו-ריאגנטים | BP153500 | |
| אקרוליין | סיגמא | 110221 | זהירות: |
| מיקרוסקופיה | גרגירית פרפורמלדהיד | רעיל 19210 | זהירות: |
| נייר סינון | פישר | 09-790-14F | |
| משאבה פריסטלטית עם צינורות | ColeParmer | cp.78023-00 | |
| סט איסוף דם מכונף אקסל מחטים 25 G | Becton Dickinson | 367341 | |
| מלקחיים עדינים במיוחד | FST | 11152-10 | צורת קצה: מספריים מעוקלים |
| FST | 14090-09 | צורת קצה: ישר | |
| Hartman Hemostats | FST | 13003-10 | צורת קצה: |
| מספריים כירורגיים | FST | 14004-16 | צורת קצה: |
| מספריים מיקרו חיתוך | חנות כירורגית ROBOZ | 5818 | |
| בקבוקוני נצנוץ זכוכית | Fisher Scientific | 74515-20 | |
| להב רוטט Microtome Leica VT1000 S | Leica Biosystems | ||
| 14047235612 להבי ויברטום | מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים | 71990 | |
| שקופיות מיקרוסקופ | פישר סיינטיפיק | 12-550-15 | |
| צלחות תרבית רקמות 24 בארות | פישר סיינטיפיק | 353047 | |
| אתילן גליקול | פישר ביו-ריאגנטים | BP230-4 | |
| גליצרול | פישר ביו-ריאגנטים | BP229-4 | |
| מי חמצן, 30% | J.T.BAKER | חתול: 2186-01 | |
| נתרן בורוהידריד | סיגמא | 480886 | |
| Tris HCl | Fisher | BP153-500ML | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | Sigma Aldrich | F1051 | |
| סרום בקר אלבומין (BSA), חלק V | תומאס סיינטיפיק | C001H24 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| אנטי IBA1, ארנב | WAKO | 019-19741 | |
| עיזים נגד ארנב IgG | Jackson Immunoresearch | 111066046 | |
| ערכת VECTASTAIN Elite ABC (סטנדרטית) | Vector Labs | PK-6100 | |
| 3.3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB) | Sigma | D5905-50TAB | זהירות: |
| טטרוקסיד אוסמיום רעיל, תמיסה 4% | מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית | 19150 | זהירות: |
| Durcupan&trade רעיל; ACM רכיב יחיד A | Sigma | 44611 | שרף זהירות: |
| Durcupan רעיל וסחר; ACM רכיב יחיד B | Sigma | 44612 | מקשה זהירות: |
| Durcupan רעיל; ACM רכיב יחיד C | Sigma | 44613 | פלסטיק זהירות: |
| Durcupan ומסחר רעיל; מאיץ ACM חד רכיבי D | Sigma | 44614 | זהירות: |
| אתנול | LesAlcoolsdeComerce | 151-01-15N | |
| תחמוצת פרופילן | סיגמא | 110205 | זהירות: |
| אלומיניום מאכל שוקל כלים | מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית | 70048-01 | |
| ACLAR® – סרטי פלואורופולימר | מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית | 50425 | |
| תנור / אינקובטור | VWR |
מקורות
- Heneka, M. T., Carson, M. J., et al. Neuroinflammation in Alzheimer's disease. The Lancet Neurol. 14 (4), 388-405 (2015).
- Herrup, K. The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis. Nat. Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).
- Heppner, F. L., Ransohoff, R. M., Becher,....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
