גומל אור מיקרוסקופי אלקטרונים ללמוד microglial אינטראקציות עם הפלאק β-עמילואיד

Summary

מאמר זה מתאר פרוטוקול המאפשר הדמיה פלאק Aβ עמילואיד בעכברי מודל למחלת אלצהיימר באמצעות methoxy-X04, אשר חוצה את מחסום הדם-מוח סלקטיבי נקשר בטא קפלים גליונות נמצא הפלאק Aβ ליבה צפופה. זה מאפשר הקרנת טרום סעיפים רקמה המכילה פלאק לפני immunostaining ועיבוד עבור במיקרוסקופ אלקטרונים.

Abstract

פרוטוקול מפורט מסופק כאן כדי לזהות פלאק Aβ עמילואיד חלקים במוח ממודלי עכבר מחלת אלצהיימר לפני immunostaining טרום הטבעה (במיוחד עבור מולקולת מתאם מחייב סידן מיונן 1 (IBA1), חלבון מחייב סידן שהביע microglia) ועיבוד רקמה במיקרוסקופ אלקטרונים (EM). Methoxy-X04 הוא צבע פלואורסצנטי כי חוצה את מחסום הדם-מוח סלקטיבי נקשר בטא קפלים גליונות נמצא הפלאק Aβ ליבה צפופה. הזרקה של החיות עם methoxy-X04 שקדם להקרבת קיבעון במוח מאפשר הקרנת טרום וגיוס כוח החלקים במוח המכיל פלאק לעיבוד נוסף עם מניפולציות זמן רב. זה מועיל במיוחד כאשר לומדים פתולוגיה לספירה מוקדם באיזורים מסויימים במוח או שכבות שעשויות להכיל הפלאק מעט מאוד, נוכח רק חלק קטן של חלקים. עיבוד פוסט מורטם של סעיפים רקמה עם האדום קונגו, Thioflavin S, ו ThioflT יבין (או אפילו עם methoxy-X04) יכול לתייג יריעות β-קפלים, אבל דורשת סליקה נרחבת עם אתנול להסיר עודפי צבע והנהלים אלה אינם עולים בקנה אחד עם שימור ultrastructural. זה גם יהיה לא יעיל לבצע תיוג עבור Aβ (ו סמנים תאיים אחרים כגון IBA1) על כל החלקים במוח מן האזורים של עניין, רק כדי להניב חלק קטן המכיל לוחות Aβ במיקום הנכון. חשוב לציין, הפלאק Aβ עדיין גלויים לאחר עיבוד רקמות עבור EM, המאפשר זיהוי מדויק של אזורים (בדרך כלל עד כמה מרובע מילימטרים) לבחון עם מיקרוסקופ אלקטרונים.

Introduction

היווצרות הפלאק עמילואיד Aβ היא סימן ההיכר נוירו העיקרי של מחלת אלצהיימר (AD). עם זאת ראיה נוספת להשערה מציעה תפקידים חשובים של המערכת החיסונית ^1,2 התקדמות מחלה. בפרט, נתונים חדשים ממחקרים פרה-קליניים וקליניים הוקמו תפקוד לקוי חיסון כנהג ראשי תורם לפתולוגיה לספירה. עם ממצאים אלו, תאי מערכת חיסון מרכזיים והיקפיים צמחו מטרות טיפוליות מבטיחות ובאשר לספירה ^3. הפרוטוקול הבא משלב מיקרוסקופ אור אלקטרונים (EM) כדי לייצר תובנה חדשות אודות הקשר בין בתצהיר פלאק Aβ לבין שינויי פנוטיפי microglial של מחלת אלצהיימר. פרוטוקול זה מאפשר תיוג של הפלאק Aβ במודלים של עכברים של מחלת אלצהיימר באמצעות הזרקת vivo של צבע פלואורסצנטי-X04 methoxy. Methoxy-X04 הוא נגזרת האדום קונגו שיכולים בקלות לחצות את המחסום שבין הדם למוח להיכנס parenchyma המוח לאגד יריעות β-קפלים עם גבוהffinity. מאז לצבוע הוא פלורסנט, ניתן להשתמש בו לצורך זיהוי in vivo של בתצהיר פלאק Aβ עם שני הפוטונים מיקרוסקופיה ^4. לאחר כבול Aβ, methoxy-X04 לא לנתק או להפיץ מחדש הרחק הפלאק, והוא שומר הקרינה לאורך זמן. זה מנוהל בדרך כלל שולי כדי לאפשר הדמיה לא פולשנית של דינמיקת מוח ^5. הקרינה גם נשארת הבאה קיבעון אלדהיד, המאפשר שלאחר מוות גומל מנתח, לרבות חקירת מותו העצבי באזור הפלאק Aβ ^6.

פרוטוקול זה מנצל את המאפיינים של methoxy-X04 כדי לבחור חלקים במוח מעכברים APP _SWE / PS1A _246E (APP-PS1; coexpressing מוטציה כפולה הגן APP Lys670Asn / Met671Leu, וגרסא PS1-A264E presenilin האדם) ⁷ כי התערוכה Aβ הפלאק באזורים ספציפיים של עניין (ההיפוקמפוס CA1, radiatum שכבות, ו-moleculare lacunosumלפני) טרום הטבעת immunostaining נגד מולקולת מתאם מחייב סידן מיונן סמן microglial 1 (IBA1) לדמיין גופי תהליכים בתא microglial עם EM. העכברים מקבלים זריקה intraperitoneal של פתרון methoxy-X04, 24 שעות לפני קיבוע המוח דרך זלוף transcardial. חלקים במוח העטרה מתקבלים באמצעות vibratome. סעיפים המכילים את CA1 בהיפוקמפוס מוקרנים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור הנוכחות של פלאק Aβ ב radiatum שכבות-moleculare lacunosum. Immunostaining עבור IBA1, שלאחר קיבוע tetroxide אוסמיום, והטבעת שרף פלסטיק מבוצעים אז על החלקים במוח שנבחרו. בסוף פרוטוקול זה, ניתן לזהות קטעים לארכיון ללא השפלה ultrastructural נוספת, מוכן חתך ultrathin ובדיקה ultrastructural. חשוב לציין, את הפלאק עדיין הם פלורסנט לאחר immunostaining עם נוגדנים שונים, למשל IBA1 כמו בפרוטוקול הנוכחי. הם הופכים t כהההאן neuropil הסובבת אותם הבאה tetroxide אוסמיום קיבוע פוסט, ללא תלות מכתים methoxy-X04, אשר מסייע לזהות אזורים של עניין במדויק, למטה, בדרך כלל, כמה מילימטרים רבועים, להיבדק עם מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.

גישה גומלת זו מציעה דרך יעילה לזהות חלקים במוח ספציפיים כדי לבחון ברמת ultrastructural. זה מועיל במיוחד כאשר לומדים פתולוגיה לספירה מוקדם, באיזורים מסויימים במוח או שכבות שעשויות להכיל רק כמה הפלאק Aβ, נוכח רק חלק קטן של קטעי רקמה. בזמנים אלה במיוחד, זה יהיה לא יעיל להשתמש immunostaining עבור Aβ (וסימון כפול עבור סמנים תאיים אחרים כגון IBA1) על חלקים במוח כמה פשוט להניב חלק קטן המכיל לוחות Aβ במיקום הנכון. בנוסף, הזרקה של עכברים חיים עם methoxy-X04 שקדמו להקרבה ועיבוד רקמה לא compromisדואר שימור ultrastructural. שיטות חלופיות כגון מכתים שלאחר מוות עם קונגו אדום, Thioflavin S, Thioflavin T או methoxy-X04 על סעיפי רקמות קבועים דורשות בידול מכתים באתנול, ^8-11 אשר גורם ללחץ האוסמוטי ומשבש את ultrastructure. גם האדום קונגו הוא קרצינוגן אדם ידוע ^12.

Protocol

הערה: כל הניסויים אושרו ובוצעו לפי ההנחיות של ועדת האתיקה המוסדית בעלי החיים, בהתאם המועצה הקנדית על הנחיות טיפול בבעלי החיים כמו מנוהל על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים של האוניברסיטה לאוול. APP-PS1 עכברים זכרים בין 4 ל 21 חודשים של גיל היו בשימוש. חיות אלה שוכנו תחת מחזור אור כהה 12 שעות ב 22 - 25 ° C עם גישה חופשית למזון ומים.

1. הכנת פתרון methoxy-X04

1. הכן פתרון 5 מ"ג / מ"ל של methoxy-X04 ⁹ על ידי המסת methoxy-X04 לתוך תמיסה המכילה sulfoxide דימתיל 10% (DMSO), 45% פרופילן גליקול, ואת בופר פוספט נתרן 45% (0.9% NaCl חיץ פוספט 100 מ"מ , pH 7.4).
   1. באמצעות microbalance, שוקל 5 מ"ג של המתחם methoxy-X04. מתחת למכסה המנוע קטר, לפזר את methoxy-X04 ב DMSO ומערבבים עד פתרון ירקרק ברור מתקבל. ברציפות להוסיף פרופילן גליקול ו phosphate חיץ מלוח תוך ערבוב עם כל תוספת.
   2. מערבבים את הפתרון על 4 מעלות צלזיוס על הכתף O / N. השג תחליב ירוק צהבהב. הפתרון עשוי להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודשים ללא שפלה.

2. הזרקת פתרון methoxy-X04

1. hr 24 לפני זלוף, לשקול את העכברים ולתת כל עכבר זריקה intraperitoneal של methoxy-X04 במינון של 10 מ"ג / ק"ג משקל גוף באמצעות מחט 27 ½ G.

3. Transcardial זלוף של עכברים שהוזרק

1. ביום שלפני זלוף, להכין כרכים מתאימים של בופר פוספט (PBS), 3.5% acrolein, ו -4% paraformaldehyde (PFA) פתרונות ¹³ ולאחסן אותם ב 4 ° CO / N.
   הערה: פתרונות אלה ישמשו הן זלוף טרום הטבעת אימונוהיסטוכימיה. זהירות כאשר עובד עם acrolein, כפי שהוא מאכל רעיל לשניחוקרים ואיכות הסביבה. בנוסף, מאז acrolein הוא מאכל כדי פלסטיק, תמיד להשתמש זכוכית מתאימה כדי להכין פתרונות acrolein.
2. ביום זלוף, לסנן את PFA ו acrolein באמצעות נייר סינון גס של כושר סינון 25 מיקרומטר.
3. במהלך זלוף, השתמש משאבה peristaltic לספק 15 מ"ל של PBS, 75 מ"ל של acrolein, ו -150 מ"ל של PFA ברציפות לתוך מחזור העכבר, בקצב זרימה של 25 מ"ל / דקה.
   היזהר. בצע זלוף בקפדנות בתוך במנדף להימנע אדים מזיקים של PFA ו acrolein.
   1. כדי להגדיר את המשאבה, כנס קצה אחד אל פתרון PBS, למלא את הצינורות (מחזיקים כ 15 מיליליטר) עם PBS, ולתקן מחט איסוף דם מכונפת 25 G לצד השני. בכל פעילויות שלנו, להבטיח כי הצינורות הנם נקיים מכל בועות אוויר שנלכדו.
   2. מניח את הצינור ישירות בבקבוק acrolein לאחר הגדרת המשאבה זלוף עם הצינורות מלאים PBS.
4. aesthetize עכבר אחד בכל פעם עם 90 מ"ג / ק"ג של מנה משקל הגוף של נתרן pentobarbital מוזרק intraperitoneally באמצעות מחט 27 ½ G. להעריך תגובות צובטות זנב / בוהן. המשך רק אם העכבר אינו מגיב לגירויים מרתיעים, כה כואבים.
5. אבטח את העכבר במצב שכיבה (שוכב על הגב עם הפנים כלפי מעלה) על ידי הקשה על הרגליים הקדמיות ואת hindpaws אל משטח העבודה ובזהירות לחשוף את הלב מבלי לגרום נזק לאיברים אחרים. הקפד לעבוד מהר לאחר ניקוב הסרעפת.
   1. בצע חתך דרך העור עם מספרי כירורגיות לאורך קו האמצע החזי החל זנב החזה והמשך מקורה עצם הבריח.
   2. לעשות שני חתכים לרוחב נוספים לאורך הבסיס של בית חזה הגחון. בעדינות להזיז ואת סיכת שני קפלי עור, והקפד לחשוף את חלל בית החזה כולו.
   3. החזק את תהליך xiphoid עם מלקחיים בוטים לחשוף את חלל בית החזה לייצב את המספריים המחודדיםים. חותך דרך הסרעפת ואת בית החזה, נזהר למנוע ניקוב הריאות, ולהמשיך את מקורי חתך הבריח. הקפד לעבוד מהר לאחר ניקוב הסרעפת.
6. בעדינות לקרוע את צק קרום הלב עם מלקחיים בוטים. החזק את הלב יציב עם מלקחיים בוטים, לחתוך את אטריום ימין, ולהתחיל העירוי של PBS. מיד להכניס את המחט דם אוסף לתוך החדר השמאלי.
7. Perfuse את העכבר עם PBS (בצינור) ואחריו Acrolein במשך 3 דקות (המקביל ל 75 מ"ל) ולאחר מכן לעבור PFA עבור 6 דקות (המקביל ל -150 מ"ל). הקפד להשהות את זרימת המשאבה לפני מעבר פתרון כדי למנוע בועות מלהיכנס הצינור.
8. לערוף את העכבר ולחלץ המוח הקבוע, ולמקם אותו ישירות לתוך בקבוקון זכוכית המכיל 4% PFA במשך שעה לפחות 2 ב 4 ° C.
   1. כדי לחלץ את המוח, להשתמש מספריים פינצטה לחתוך את העור כדי לחשוף את הגולגולת. בזהירות לשבור את אופ הגולגולתen שבין העיניים, ואת השבב מעל חתיכות קטנות של אותו לחשוף המוח הבסיסי.
   2. מוציאים בזהירות את התיקון המוח ופוסט חשף אותה עם 4% PFA עבור שעה 2 נוסף לפני שתמשיך עבור חתך vibratome.

4. המוח חתך באמצעות vibratome

1. שטוף את המוח 3 פעמים הקבועות עם PBS הקר. באמצעות סכין גילוח חד, להסיר את נורת חוש הריח (אלא אם האזור הזה נמצא תחת חקירה) וחותך את המוח transversally לתוך 2 - 3 חתיכות של גובה שווה כ, כל מה שיכול להיות מחולקת זמנית כדי להאיץ את התהליך.
2. מדביק את פיסות רקמת המוח אנכית לצלחת הדגימה המאובטחת למגש. ודא כי המשטח לחתוך חלק בתקיפות מקלות צלחת הדגימה אינו מקבל וחלץ במהלך הליך החתך. הוסף מספיק פתרון PBS לתוך המגש עד משטח המוח כולו שקוע לחלוטין. חשוב לשמור על החתיכות מוח דואר וחתכים לאחר שקועות לגמרי PBS ברחבי שלב זה.
3. מניחים את המגש vibratome, להתאים את מהירות חתך 0.5 מ"מ / sec, תדירות חתך עד 90 הרץ, ואת עובי להאכיל 50 מיקרומטר כדי להניב 50 מיקרומטר חלקים עבים. ואז להעביר את חלקים לתוך צלוחיות זכוכית 20 מ"ל המכיל פתרון cryoprotectant (40% PBS, 30% אתילן גליקול, ו -30% גליצרול) באמצעות מכחול בסדר. אחסן את הבקבוקונים ב -20 ° C עד לשימוש נוסף. לחלופין, לשמור את הסעיפים PBS להקרנה מיידית כמתואר בשלבים הבאים.

הקרנת סעיף 5. עבור נוכחות של הפלאק מוכתם methoxy-X04

1. בעזרת מוח עכבר stereotaxic אטלס ^14, חלקים במוח בחרו המכילים את האזור של עניין, למשל, בהיפוקמפוס CA1 כפי שמוצג בדוגמא הנוכחית. מניחים כל חלק לתוך באר בתוך צלחת תרבות 24 גם המכיל פתרון מספיק cryoprotectantכדי למנוע את הסעיפים מהתייבשות.
2. לבחון כל קטע ברציפות, כדי למנוע התייבשות החלקים, באמצעות ההליך הבא:
   1. להוסיף טיפה של PBS לשקופית מיקרוסקופ עם טפטפת הפנויה, ומניחים את החלק על אגל.
   2. בדוק את הסעיף תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לזהות אזורים המכילים פלאק Aβ שכותרתו methoxy-X04.
      הערה: methoxy-X04 ניתן מדמיין בקלות באמצעות אולטרה סגול קרינה (UV) מסנן (עירור 340 - 380 ננומטר).
3. צלם תמונות של אזורים של עניין (ROI) בתחום בהיר כמו גם במצב קרינה מבלי להזיז את במת מיקרוסקופ, שכן כל תמונה חייבת להראות באותו האזור בשני התחומים על מנת לתאם את נוכחותם של הפלאק ישירות לאזור המבני של סעיף הרקמה.
4. שמור שם את התמונות שצולמו על פי מספר בעלי החיים. כמו כן לרשום את המספר היטב את הצלחת בתחום התמונות ת"אקן. לדוגמה, אקס: 9978A1B; מספר בעלי חיים: 9978; ובכן מספר: A1; שדה: מואר. מניחים את החלק האחורי ב המיועד שלה גם לאחר השלמת הדמיה.
   הערה: בסופו של דבר, עבור כל מקטע בחן, שתי תמונות מתקבלים, אחד בתחום בהיר אחר בתחום UV.
5. פתח את שתי תמונות של אותו ROI (אחד בתחום בהיר והשני בתחום UV) ב J תמונה, ושימוש תוסף MosaicJ, יישר את הקצוות של שתי תמונות ולשמור את התמונה בציר בשילוב לפי מספר טוב זה הגיע מ.
6. שמור את התמונה בתיקייה נפרדת עם מספר של חיה מסוימת. מערבב את התמונות לזהות למקם את הפלאק קטע הרקמה, ויש לי את כל המידע לגבי הקטע השלם בשני התחומים השונים (הבהיר UV).
7. לאחר תהליך המיון הושלם, לאחסן את הסעיפים שנבדקו ב -20 ° C בצלחת תרבות 24 גם המכילה cryoprotectant עד immunostaining או עיבוד נוסף הוא carried החוצה.

6. טרום הטבעת Immunostaining עבור IBA1

הערה: בצע את immunostaining עבור IBA1 על סעיפים בחופשיות-צפה שנבחרו על ידי נחת הצלחת על כיסא נדנדה נעה באיטיות ב RT.

1. ביסודיות לשטוף את סעיפים 3 פעמים עם כ 1 מ"ל PBS, לשטוף כל שנמשך 10 דקות.
2. להרוות peroxidases אנדוגני עם מי חמצן 0.3% בפתרון PBS במשך 10 דקות. פעולה זו מונעת פעילות peroxidase הלא ספציפית, וזה חשוב כדי למנוע מכתים רקע.
3. שטפו את הרקמה PBS 3 פעמים במשך 10 דקות כל אחד.
4. דגירת מקטעי borohydride נתרן 0.1% בפתרון PBS למשך 30 דקות. שלב זה חשוב כדי להפחית אלדהידים הנותרים משלב הקיבעון, והיא חשובה במיוחד אם acrolein משמש קיבעון רקמות.
5. שטפו את הרקמה 3 פעמים PBS במשך 10 דקות בכל פעם ולוודא כדי להסיר את כל הבועות.
6. חסום את הסעיפים 1 שעה.נוגדנים שונים עשויים לדרוש פעמים ופתרונות חסימה שונות. לקבלת IBA1, להכין חיץ חסימת המכילה סרום שור 10% עוברית, 3% בסרום שור אלבומין, ו 0.01% Triton X-100 ב 50 מ"מ טריס שנאגרו מלוחים (TBS; pH 7.4).
   הערה: צעד החסימה הוא למנוע ספציפי המחייב של הנוגדן הראשוני. הריכוז הנמוך של טריטון X-100 מאפשר permeabilization הקל של ממברנות מכתים טוב יותר, והוא נמוך מספיק כדי לשמר רוב תכונות ultrastructural של רקמה תחת EM.
7. הסר את חוצץ החסימה מן הרקמה, הדגירה בתמיסת נוגדן ראשונית (ארנב נגד IBA1, בדילול [1: 1,000] חיץ חסימה) ב 4 ° CO / N.
8. לשטוף ב TBS 3 פעמים במשך 10 דקות בכל פעם.
9. מדגירים את נוגדנים משני (מצומדות נגד ארנב עז כדי ביוטין) [1: 200] ב 0.05 M TBS למשך 90 דקות.
10. לשטוף ב TBS 5 פעמים במשך 5 דקות בכל פעם.
11. מדגירים את פתרון מורכב avidin-ביוטין (avidin [1: 100], ביוטין [1: 100]) ב TBSפתרון עבור שעה 1.
12. לשטוף ב TBS 5 פעמים במשך 5 דקות בכל פעם.
13. לחשוף את מכתים IBA1 עם 0.05% diaminobenzidine (DAB) ו 0.015 מי חמצן% ב TBS במשך 8 דקות.
    הערה: התזמון של פיתוח DAB עשוי להשתנות מן פרוטוקול הפרוטוקול צריך להיקבע במהירות על ידי בחינת החלקים מוכתמים תחת מיקרוסקופ אור.
    הערה: IBA1, אחד צריך להיות מסוגל לדמיין את גופי התא בבירור ותהליכים של שריר כלשהו מוכתם IBA1 ב 20X (ראה איור 2 למשל נציג). היה זהיר באמצעות DAB, כפי שהוא מסרטן ידוע.
14. הימנע יתר לפתח בקפידה על ידי ניטור חלקים (כמתואר לעיל) במהלך שלב זה. עצור את התגובה על ידי שטיפת הפרקים, PB המצונן 5 פעמים במשך 5 דקות בכל פעם.

עיבוד 7. אלקטרונים מיקרוסקופים

1. כן פתרון אוסמיום tetroxide 1% PBS ב בקבוקון זכוכית. tetroxide אוסמיום הוא רגיש; לכסות את gבקבוקון ילדה עם רדיד אלומיניום על מנת להגן על הפתרון מן האור.
   היה זהיר באמצעות tetroxide אוסמיום, כפי שהוא כימיקל מסוכן מאוד. בצע זה ואת הצעדים הבאים בתוך במנדף.
2. הסר את PBS מן הסעיפים ומשטח אותם באמצעות מכחול בסדר. ביצועים טובים שלך צעד אחד בכל פעם, כדי לשמור על סעיפים מהתייבשות. הקפד לשטח את הסעיפים מייד לפני הוספת tetroxide אוסמיום, כמו קפלים כל בסעיפים יהפכו קבועים ומנסה לשטח קיבעון אוסמיום פוסט רקמה תהיה רק ​​לשבור את הסעיפים.
3. לטבול את הסעיפים tetroxide אוסמיום למשך 30 דקות ב RT, הוספת טיפה אחת של tetroxide אוסמיום בכל פעם עם טפטפת העברה, כדי למנוע קטעים מתוך קיפול. מכסים את היטב בנייר אלומיניום כדי להגן על חלקים מן האור.
   הערה: צעד זה פותר את השומנים בתוך הסעיפים. הרקמה תופיע כהה מאוד לאחר קיבוע פוסט אוסמיום.
4. בעוד חלקים נמצאים אוסמיום טטרוxide, להכין שרף פלסטיק בכוס חד פעמי על ידי ערבוב רכיב 20 גרם, 20 גרם רכיב B, C רכיב 0.6 גרם, ו -0.4 מרכיב g ד מערבבים את המרכיבים יחד לפי הסדר האמור ומערבבים אותם היטב בעזרת פיפטה סרולוגיות 10 מ"ל עד צבע אחיד מתקבל.
5. מעבירים את התערובת מוכנה מנות במשקל אלומיניום. הם יקבלו את קטעי הרקמה ברגע שהם כבר מיובשים.
6. מייבש את סעיפי ריכוז גדל והולך של אתנול למשך 2 דקות לפי הסדר הבא: 35%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90%, 100%, 100%, 100%.
7. כדי להסיר אתנול שיורית, לטבול את הסעיפים פרופילן אוקסיד 3 פעמים במשך 2 דקות בכל פעם. הסר את החתכים המיובשים מהצלחת התרבות 24 גם לתוך צלוחיות זכוכית 20 מיליליטר. השתמש תמיד צלוחיות זכוכית כשעובדים עם פרופילן אוקסיד כפי שהוא מתמוסס פלסטיק, לשמור על זהירות, כפי שהוא מסוכן.
8. השתמש קצה פיפטה זכוכית מכופף או מכחול עדין להעביר את הקטעים מתוך soluti פרופילן אוקסידעל לתוך השרף ולהשאיר O / N חדירה ב RT. היזהר שלא לדלל את השרף עם פרופילן אוקסיד.
9. שבץ קטע עם שרף על פולי-כלורו-תלת-fluoro-אתילן (PCTFE) filmsheets:
   1. מניח את הכלים במשקל האלומיניום המכילים דגימות לתוך 50 - תנור C 60 מעלות במשך 10 - 15 דקות לפני הטבעת מדורי filmsheets PCTFE.
   2. כאשר הטבעה חלקה, לעבוד עם אלומיניום אחד במשקל מנה בכל פעם. באמצעות מכחול בסדר, לצייר שכבה דקה של שרף על-גבי גיליון הסרט PCTFE אחד.
   3. עבר קטע רקמה אחת בכל פעם מן האלומיניום במשקל תבשיל כדי גיליון סרט PCTFE. הסר שרף עודף סביב הרקמה, נזהר שלא לגעת בה.
   4. לאחר המעבר כל החלקים מאחד במשקל התבשיל כדי גיליון הסרט PCTFE, הנח גיליון PCTFE השני על הראשון, יצירת כריך של רקמות שרף בין 2 גליונות.
10. לפלמר שרף באינקובטור במשך 3 ימים ב 55 - 60 ° C.
11. החומר מוכן כעת חתך ultrathin ובדיקת ultrastructural, טכניקות מיוחדות אשר מבוצעות בדרך כלל על ידי מתקני גרעין EM. אחסן את הדגימות בין סדיני סרט PCTFE בבטחה ב RT ללא שפלת ultrastructural.
    הערה: השלבים הבאים עבור ultrathin חתך בדיקה מיקרוסקופית אלקטרונים חודרת מוסברים בפרוטוקול נפרד ^13.

Results

סעיף זה ממחיש את התוצאות ניתן לקבל שלבים קריטיים שונים של הפרוטוקול. בפרט התוצאות מראות דוגמאות של חלקים במוח המכיל methoxy-X04 הפלאק מוכתמים באזור מסוים ושכבות של עניין: CA1 בהיפוקמפוס, רבדים radiatum, ו lacunosum-moleculare. הפלאק ואת ארגון אזורי / שבשבת של ההיפוקמפוס הם דמיינו ברציפות באמצעות שילוב של UV ומסנן שדה בהיר (איור 1). סעיפי המוח שנבחרו לאחר מכן הם immunostained ומעובד EM תוך שמירה על מסלול של הפלאק Aβ שלהם, בהתחשב כי ...

Discussion

פרוטוקול זה מסביר גישה המצטרפת למיקוד פלאק Aβ ליבה צפופה עם EM. Methoxy-X04 הזרקת vivo מאפשרת בחירה מהירה של חלקים במוח המכילים פלאק Aβ בתוך אזורים מסוימים ושכבות של עניין, למשל CA1 בהיפוקמפוס, radiatum שכבות, ו lacunosum-moleculare. בדוגמה הנוכחית, methoxy-X04-הקרנת טרום אוחד עם טרום הטבעה immunostaining עבור IBA1 ללמוד כיצד שונה פנוטיפים microglial אינטראקציה עם סינפסות ברמה ultrastructural בנוכחות פלאק Aβ ליבה צפופה.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methoxy-X04	Tocris Bioscience	4920	10 מ"ג מצע לטבליה
פרופילן גליקול	סיגמא אולדריץ'	W294004
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)	פישר ביו-ריאגנטים	BP231-1	זהירות:
נתרן כלורי רעיל NaCl	Sigma	S9625
נתרן פוספט מונוהידראט מונו-בסיסי	Sigma	S9638
נתרן פוספט דו-בסיסי	Sigma	S0876
Tris Hydrochloride	פישר ביו-ריאגנטים	BP153500
אקרוליין	סיגמא	110221	זהירות:
מיקרוסקופיה	גרגירית פרפורמלדהיד	רעיל 19210	זהירות:
נייר סינון	פישר	09-790-14F
משאבה פריסטלטית עם צינורות	ColeParmer	cp.78023-00
סט איסוף דם מכונף אקסל מחטים 25  G	Becton Dickinson	367341
מלקחיים עדינים במיוחד	FST	11152-10	צורת קצה: מספריים מעוקלים
	FST	14090-09	צורת קצה: ישר
Hartman Hemostats	FST	13003-10	צורת קצה:
מספריים כירורגיים	FST	14004-16	צורת קצה:
מספריים מיקרו חיתוך	חנות כירורגית ROBOZ	5818
בקבוקוני נצנוץ זכוכית	Fisher Scientific	74515-20
להב רוטט Microtome Leica VT1000 S	Leica Biosystems
14047235612 להבי ויברטום	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	71990
שקופיות מיקרוסקופ	פישר סיינטיפיק	12-550-15
צלחות תרבית רקמות 24 בארות	פישר סיינטיפיק	353047
אתילן גליקול	פישר ביו-ריאגנטים	BP230-4
גליצרול	פישר ביו-ריאגנטים	BP229-4
מי חמצן, 30%	J.T.BAKER	חתול: 2186-01
נתרן בורוהידריד	סיגמא	480886
Tris HCl	Fisher	BP153-500ML
סרום בקר עוברי (FBS)	Sigma Aldrich	F1051
סרום בקר אלבומין (BSA), חלק V	תומאס סיינטיפיק	C001H24
Triton X-100	Sigma	T8787
אנטי IBA1, ארנב	WAKO	019-19741
עיזים נגד ארנב IgG	Jackson Immunoresearch	111066046
ערכת VECTASTAIN Elite ABC (סטנדרטית)	Vector Labs	PK-6100
3.3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB)	Sigma	D5905-50TAB	זהירות:
טטרוקסיד אוסמיום רעיל, תמיסה 4%	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	19150	זהירות:
Durcupan&trade רעיל; ACM רכיב יחיד A	Sigma	44611	שרף זהירות:
Durcupan רעיל וסחר; ACM רכיב יחיד B	Sigma	44612	מקשה זהירות:
Durcupan רעיל; ACM רכיב יחיד C	Sigma	44613	פלסטיק זהירות:
Durcupan ומסחר רעיל; מאיץ ACM חד רכיבי D	Sigma	44614	זהירות:
אתנול	LesAlcoolsdeComerce	151-01-15N
תחמוצת פרופילן	סיגמא	110205	זהירות:
אלומיניום מאכל שוקל כלים	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	70048-01
ACLAR® – סרטי פלואורופולימר	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	50425
תנור / אינקובטור	VWR