מאמר שיטה

מודל אפיתל דמה מקלעת מבוססת תאים של הגדר ודם-השדרתי נוזל לחקר זיהום חיידקים מצד basolateral

DOI:

10.3791/54061

⸱

6 במאי 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 2Department of NDU Life Sciences, Nippon Dental University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי האפיתל של מקלעת הכורואיד (CP) יוצרים את מחסום נוזל הדם-מוח (BCSFB). מודל חוץ גופי של BCSFB משתמש בתאי פפילומה מקלעת כורואיד אנושיים (HIBCPP). מאמר זה מתאר תרבית וזיהום בסיסי של תאי HIBCPP באמצעות מערכת הכנסת מסנן תרבית תאים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי האפיתל של מקלעת הכורואיד (CP), הממוקמים במערכת החדרים של המוח, יוצרים את מחסום נוזל הדם-מוח (BCSFB). ה-BCSFB מתפקד בהפרדת נוזל המוח (CSF) מהדם והגבלת ההחלפה המולקולרית במידה מינימלית. מודל מבחנה של BCSFB מבוסס על תאים שמקורם בפפילומה של מקלעת כורואיד אנושית (HIBCPP). תאי HIBCPP מציגים פונקציות מחסום אופייניות כולל היווצרות צמתים הדוקים (TJs), התפתחות התנגדות חשמלית טרנסאפיתליאלית (TEER), כמו גם חדירות קלה למקרומולקולות. ישנם מספר פתוגנים שיכולים להיכנס למערכת העצבים המרכזית (CNS) דרך BCSFB וכתוצאה מכך לגרום למחלה קשה כמו דלקת קרום המוח. אחד הפתוגנים הללו הוא Neisseria meningitidis (N. meningitidis), חיידק ספציפי לאדם. שימוש בתאי HIBCPP במערכת הכנסת מסנן תרבית תאים הפוכה מאפשר לחקור אינטראקציות של פתוגנים עם תאים של BCSFB מצד התא הבסיסי, וזה רלוונטי in vivo. במאמר זה אנו מתארים זריעה ותרבות של תאי HIBCPP על תוספות תרבית תאים. יתר על כן, מודגמת הדבקה של התאים ב-N. meningitidis יחד עם ניתוח של חיידקים שפלשו ונדבקו באמצעות אימונופלואורסצנציה כפולה. מכיוון שתאי ה-CP מעורבים גם במחלות אחרות, כולל הפרעות ניווניות כמו מחלת אלצהיימר וטרשת נפוצה, כמו גם במהלך גרורות במוח של תאי גידול, ניתן ליישם את מערכת המודל גם בתחומי מחקר אחרים. הוא מספק פוטנציאל לפענח מנגנונים מולקולריים ולזהות מטרות טיפוליות חדשות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המכשול נוזל המוח והשדרה דם (BCSFB) הוא אחד האתרים שלושה מחסום בין הדם למוח 1. לתאם מורפולוגיים שלו הם תאי אפיתל של המקלעת דמה (CP) 2,3, גידול convolute האנדותל אפיתל, המהווה כלי דם מאוד וממוקם החדרים של המוח. המחסום משמש כדי לייצר את הנוזל השדרתי (CSF) וכן להפריד האחרון מהדם. על מנת להשיג תפקוד מחסום, לתאי האפיתל CP להראות פעילות pinocytotic נמוכה, להביע מובילים ספציפיים, ומחוברים בצפיפות על ידי רשת רציפה של צומת הדוקים (TJS) 2,3.

הפפילומה מקלעת דמה עין אנושית (HIBCPP) תאים, נגזרים הפפילומה מקלעת דמה ממאיר של אישה 4 יפנית, ששמשו לבנייה פונקציונלית במודל חוץ גופייה של BCSFB. תאי HIBCPP להראות כמה מאפיינים של BCSFB פונקציונלי כמו ההיווצרות של TJגדילים, התפתחות של פוטנציאל הממברנה transepithelial גבוהה כי ניתן לקבוע ההתנגדות החשמלית transepithelial (TEER), ו permeabilities מינור מקרומולקולות. יתר על כן, תאי HIBCPP להביע מובילי מאפיין, אשר יכול לשמש כדי לווסת את המיקרו-הסביבה היונית, ולהראות פסגה / 5,6,7 קוטביויות basolateral.

BCSFB הוכח לתפקד כאתר כניסה פתוגנים (חיידקים, וירוסים ופטריות) במערכת העצבים המרכזית (CNS) 8. הפלישה של פתוגנים, לרבות meningitidis Neisseria (meningitidis נ), חיידק גראם שלילי, יכולה לגרום למחלות קשות כמו דלקת קרום המוח. עדות לכך שהוא מתגבר על מחסום ההגנה האפיתל של CP נתמכת על ידי תצפיות histopathological בחולים עם מחלת קרום המוח מציגה כמויות מוגברות של meningococci על כלי הדם לתאי האפיתל CP 9,10. כדי לזכות כניסת ba תאי מארחיםcteria לעתים קרובות לחטוף מנגנוני endocytotic, אשר מתווכים או מופעלים על ידי קולטנים משטח ספציפיים הממוקמים על תאי מארחים. מאז אינטראקציות של פתוגנים עם קולטנים אלה יכולים להיות מינים ספציפיים 11, במודלים של בעלי חיים ניתן להתייעץ רק במידה מוגבלת. השורה תא HIBCPP מספק הזדמנות ללמוד את תהליך הפלישה כמו גם את המנגנונים המולקולריים שבבסיס בתוך מודל המערכת האנושית. העסקה מוסיפה תרבית תאים מאפשרת לנתח אינטראקציות של פתוגנים עם תאי מארחים משני צדדי תא ברורים. חיידקים רבים, נ כולל meningitidis, כפופים בחריפות את השפעת הכבידה במהלך מבחני זיהום. עבור אינטראקציה אופטימלית של פתוגנים עם תאי HIBCPP במהלך המבחנים, החיידקים בתחילה מתווספים לתוך התא העליון של מערכת כנס מסנן תרבית תאים. כדי לאפשר זיהום מן הפסגה או בצד התא basolateral, בהתאמה, שתי וריאציות של מערכת במבחנה כבר established: במערכת תקן תאי HIBCPP הם זורעים לתוך התא העליון של הכנס המסנן, מחקו את המצב כאשר מיקרואורגניזמים נמצאים על CSF בצד ולקבל במגע עם צד apical של התאים (איור 1 א, ג). לעומת זאת, תוך שימוש בתאי HIBCPP במערכת כנס מסנן תרבית תאים הפוכה משקף את התנאים כאשר חיידקים נכנסו לזרם הדם. מיקרואורגניזמים להפיץ את CP דם המפגש לתאי האפיתל מהצד basolateral (איור 1 ב ', ד'). ראויים לציון, במערכת מודל זה הוכח כי חיידקים לפלוש תאי HIBCPP באופן קוטבי במיוחד מן 5,7 בצד התא basolateral.

בהמשך לזיהום של CP, הפתוגנים פלשו יכולים להיות מוכר על ידי מערכת החיסון המולדת באמצעות קשירה לקולטנים-זיהוי תבניות (PRRs). היטב תיאר חברי PRRs שייכים קולטן דמוי אגרה (TLR) המשפחה. TLRs יכול binד למבנים מאפיינים של מיקרואורגניזמים זיהומיות, אשר דפוסים מולקולריים הפתוגן קשור termed (PAMPs). קשירה של הקולטניים מובילה הפעלה של תא מארח איתות מפלי המפעילות ביטוי של ציטוקינים כמוקינים 12, אשר בתורו לגרות גלגול של תאי מערכת חיסון על פני 13,14 BCSFB. הוכח כי תאי HIBCPP להביע כמה TLRs ברמה mRNA וזיהום כי עם נ meningitidis התוצאה הפרשת ציטוקינים כמה וכמוקינים, כולל CXCL1-3, IL6, IL8 ו TNFα 15,16.

כאן אנו מתארים טיפוח וזיהום של קו תאים אנושיים HIBCPP במערכת להכניס תרבית תאים הפוכה המחקה את BCSFB. מערכת מודל זה מאפשרת ללמוד אינטראקציות של פתוגנים עם צד תא basolateral vivo ב רלוונטי וכן את תגובת התאים הבאה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכין הוספת מסנן תרבית תאים עבור תאי המתזמן HIBCPP ב מערכת מודל הפוך

  1. טרום חם DMEM / F12 (Ham) בתוספת 5 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, 100 U / פניצילין מיליליטר, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין ו -10% עוברי עגל בסרום (FCS).
  2. שימוש במלקחיים סטרילי כדי למקם מוסיף מסנן תרבית תאים 0.33 סמ"ר הצמיחה באזור עם גודל הנקבוביות של 3 מיקרומטר במהופך לתוך צלחת 12-היטב (איור 1E).
  3. מלאו בינוניים לתוך המגירה התחתונה של כנס מסנן תרבית תאים (כ -3 מיליליטר) ו -100 μl על גבי להכניס את המסנן. להציף את הצלחת כמו גם בתא התחתון עם מדיום. לשאוב את המדיום מוגזם בצורה כזאת כי בתא התחתון של להכניס מסנן נשאר מלא (1E איור).
    הערה: מומלץ להשתמש פיפטה סרולוגיות עבור שלב זה.
  4. מכסים בצלחת 12-היטב עם המכסה ולהעביר מחדיר מסנן תרבית תאים מוכן בחממה, 37 ° C,5% CO 2 עד תוספת של תאים.

טיפוח 2. Passaging של תאים HIBCPP

  1. הכן DMEM / F12 (Ham) בתוספת 5 מיקרוגרם / מ"ל, 100 פניצילין U / ml, 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ"ל ו -10% FCS.
  2. בינוני טרום חם PBS באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לשאוב בינוני מן הבקבוק. הוסף 10 מ"ל PBS על הבקבוק ו מערבולת. חזור על פעולה זו פעם.
  3. הוסף 3 מ"ל 0.25% טריפסין-EDTA אל הבקבוק מערבולת. מניחים לתוך החממה, 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  4. לאחר כ -20 דקות להסיר את הבקבוק מן החממה. ודא כי התאים מנותקים מהחלק התחתון של הבקבוק ולהציג צורה עגולה כאשר שנסקרו עם המיקרוסקופ.
    הערה: התאים לא לנתק לחלוטין זה מזה נמצאים בדרך כלל agglomerates. מומלץ להשתמש בתאים עד חלוף 38.
  5. כדי להפסיק trypsinization להוסיף 17 מ"ל בינוני. Resuspend את התאים על ידי pipetting למעלה ולמטה ולהעביר את ההשעיהלתוך צינור 50 מ"ל. צנטריפוגה ב 50 XG במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. Resuspend התאים נפח מתאים של המדיום לספור את התאים באמצעות hemocytometer.
    הערה: ריכוז תאי HIBCPP resuspended צריך להיות 1 x 10 6 תאים / מ"ל. עבור תחזוקה של תאים HIBCPP הוא הציע להעביר סכום של 1-6 x 10 6 תאים 10 מ"ל בינוני עד א-בבקבוק T75. שנה בינונית כל שני וחמישי.

3. מתזמן Inverted נייד הוספת מסנן תרבות עם תאי HIBCPP

  1. בראש כל כנס מסנן הפוך (כלומר בצד התחתון של המסנן) להוסיף 80 μl של השעית תא (כלומר. 8 x 10 4 תאים) (איור 1E).
    הערה: ודא כי התאים מופצים בצורה אחידה בתוך ההשעיה על ידי צינור היפוך לפני הזריעה.
  2. מכסה את מוסיף מסנן התרבות הזורע תאים עם המכסה של הצלחת 12-היטב ולהעביר בחממה, 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  3. ביום הראשון, למלא 1 בינוני מ"ל לתוך הבארות של צלחת 24 גם. הרם את מוסיף מסנן תרבית תאים באמצעות מלקחיים מתוך צלחת 12-היטב, להשליך את המדיום פנימה, להדליק את מוסיף מסנן ומניחים אותם בכיוון סטנדרטי לתוך צלחת 24 גם מוכן (איור 1E).
  4. מניחים את התאים לתוך מדיום חדש כל שני וחמישי. כן 24 בארות עם מדיום חדש ולהעביר את מוסיף המסנן אליו. מלאו מוסיף עם מדיום חדש 0.5 מ"ל. בדוק TEER כל יום כמפורט בסעיף 4.
  5. כאשר ערכים TEER של תאים שנזרעו HIBCPP על מוסיף תרבית תאים עולה 70 Ω x סמ"ר (כ 4 ימים לאחר הזריעה), ולאחר מכן להמשיך תרבית תאים במדיום המכיל FCS 1% ו 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​אינסולין. הכן 24 גם צלחות עם המדיום 1 מ"ל לכל היטב. העבר מוסיף מסנן על הבארות המוכנות והבינוני חילופיים בתא העליון.
    הערה: נסיגת סרום זה לאחר confluency מובילה להיווצרות שלפוטנציאל הממברנה גבוה.
  6. לשאוב בינוני מתא מסנן, להעביר מוכן היטב ולמלא עם 500 בינוני μl. חזור על פעולה זו פעם. שים את תאי לילה לתוך החממה, 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.

4. מדידה של ההתנגדות החשמלית Transepithelial (TEER)

  1. לטבול טיפים אלקטרודה של voltohmmeter רקמות אפיתל במשך 15 דקות באתנול 80%. העבר voltohmmeter מתחת למכסה המנוע ולתת להתייבש אלקטרודה לרגע. מניח אלקטרודה לתוך מדיום תרבות בהתאמה המשמש את התאים במשך 15 דקות אחרות כדי לאזן.
  2. לבצע מדידות על ידי מיצוב הזרוע הארוכה של האלקטרודה כך שהוא נוגע בתחתית המגירה התחתונה בכל פעם, במקום זרוע הקצר לתוך תא הכנס המסנן.
    הערה: ערכי התנגדות של מוסיף מסנן תרבית תאים ללא תאים בינוניים אמורה לשמש ערכי ריק כמו ((ערך נמדד (Ω) - ערך ריק (Ω)) x מסנןמשטח (כלומר 0.33 סמ"ר)).
  3. אחרי בדיקת המקום האלקטרודה בחזרה לתוך אתנול 80% במשך 15 דקות. אחסן בתוך שפופרת יבשה.

5. קביעת חדירות Paracellular

  1. ממיסים 1 גרם FITC-אינולין ב 200 מ"ל בינוני תרבות בתוספת 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​אינסולין 1% FCS. החל 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​של הפתרון לתוך תא מסנן העליון לפני ההדבקה של תאים.
  2. לאחר ההדבקה לאסוף דגימות בינוניות מהבאר הנמוכה כדי לקבוע כמה אינולין עבר מתא המסנן דרך שכבת התאים.
  3. כן פתרון סטנדרטי FITC-אינולין ולבצע 1: 2 דילולים, 10 פעמים (100%, 50%, 25%, 12.5%, 6.25%, 3.13%, 1.56%, 0.78%, 0.39%, 0.2% ו 0%) . לקבוע קרינה על ידי מדידת כל דגימות קורא microplate.

6. הכנת חיידקים עבור זיהום של תאי HIBCPP על הוספת מסנן תרבית תאים

  1. יום אחד לפני הניסוי, לגרד tהוא נ קפוא meningitidis זנים מחוץ מניה-גליצרול פס על אגר שוקולד עם Vitox. לגדול לילה בחממה, על 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO 2.
  2. חלץ 20-30 מושבות מתרבות לילה ולהעביר לתוך שפופרת המכילה 8 מ"ל Proteose Peptone בינוני בתוספת 0.042% 3 NaHCO, 0.01 M MgCl 2 ו -1% Polyvitex.
  3. לנער את החיידקים עבור 1.25 שעות ב 220 סל"ד, 37 ° C. גלולה חיידקים על ידי צנטריפוגה ב 2684 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. בטל supernatant ו resuspend גלולה חיידקי עם 8 מ"ל סרום ללא בינוני. וורטקס כדי להבטיח השעיה אפילו.
  4. כדי לקבוע צפיפות תרבות, למדוד דילול של 1:10 ב צפיפות אופטית (OD) של 600 ננומטר. התאם את השעית החיידקים כדי OD 600 של 0.1.
    הערה: השעיה זו מכילה כ. 1 x 10 8 CFU / ml.
  5. כדי לאשר את ריכוז תא החיידק, לדלל את בשלבי ההשעיה (1:10) עדדילול של 10 -5 צלחת לצלחות אגר שוקולד.
    הערה: דילולים סדרתי דומה צריך להתבצע לחשב עקומות התפתחות חיידקים.

7. זיהום של תאי HIBCPP על הוספת מסנן תרבית תאים ו קביעת פלישת חיידקים ידי Immunofluorescence הזוגי

  1. לאחר שתמשיך תרבית תאים במדיום המכיל FCS 1% ואינסולין 5 מיקרוגרם / מ"ל, למדוד תאים מדי יום באמצעות voltohmmeter רקמת האפיתל. אם התאים הגיעו TEER של כ -500 Ω x cm², לבצע את הזיהום.
  2. להדביק את התאים עם השעית החיידקים המוכנה על ריבוי של זיהום (משרד פנים) של 10. חנות התאים הנגועים בחממה, על 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO 2 לתקופה המצוינת של זמן.
    הערה: משרד הפנים יכול להיות מחושב על ידי לקיחה בחשבון את מספר תאים לכל כנס מסנן תרבית תאים בנקודת המפגש (1.21 x 10 6 תאים / 2 סנטימטר).
  3. עצור את להדביקיון על ידי שטיפה שלוש פעמים עם 500 μl בינוני סרום ללא (SFM) המכיל אלבומין 1% שור (BSA) להחיל את תא מסנן, 1 מ"ל ל המגירה התחתונה.
  4. חסום עם 500 SFM μl המכיל 1% חיץ BSA בתא לסנן 1 מ"ל בתא התחתון במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי למנוע הדבקות של נוגדנים אתרי הקישור נוקבים.
  5. דגירה עם 100 נ העיקרי μl נוגדן אנטי meningtidis α-OMP (1: 200) בתא לסנן 500 μl בתא התחתון במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: אם נדרש, ריכוז הנוגדן צריך להיות טיטרציה.
  6. שוטפים את התאים על ידי aspirating המדיום מתא מסנן, להעביר את הכנס כדי לסנן SFM מוכן היטב עם 1 מ"ל המכיל BSA 1% ולמלא את תא מסנן רוקנו עם 500 μl SFM המכיל 1% BSA. חזור על פעולה זו פעמיים.
  7. תקן תאים עם 500 μl פורמלדהיד 4% compa מסנןrtment, 1 מ"ל בתא התחתון במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. שוטפים את התאים על ידי aspirating המדיום מתא מסנן, להעביר את הכנס כדי לסנן PBS מוכן היטב עם 1 מ"ל ולמלא את תא מסנן רוקנו עם 500 μl PBS. חזור על פעולה זו פעם.
    הערה: דוגמאות ניתן לאחסן לילה PBS ב 4 ° C.
  9. תרבות Cut תא קבוע מסננת של מוסיף ולשטוף עם 250 μl PBS המכיל 1% BSA. דגירה תאים עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר עם 250 μl ניאון שכותרתו (עירור גל 594 ננומטר) משני נוגדנים עוף ארנב נגד (1: 500) להכתים חיידקים תאיים.
    הערה: אם נדרש, ריכוז הנוגדן צריך להיות טיטרציה.
  10. Permeabilize תאים עם 250 μl PBS המכיל BSA 1% ו -0.5% Triton X-100 עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר. שטפו תאים שלוש פעמים עם 250 μl PBS המכיל 1% BSA.
  11. דגירה עם 250 נ העיקרי μl נוגדן אנטי meningitidis α-OMP (1: 200) למשך 30 דקות להכתים חיידקים חוּץ ו תאיים. שטפו תאים שלוש פעמים עם 250 μl PBS המכיל 1% BSA.
  12. החל 250 μl של ניאון שכותרתו (גל עירור 488 ננומטר) נוגדנים משני (1: 500), שכותרתו ניאון (גל עירור 660 ננומטר) Phalloidin (1: 250) ו 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) ( 1: 50,000) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר להכתים חיידקי חוּץ ו תאיים, cytoskeleton יקטין וגרעינים.
    הערה: אם נדרש, ריכוז הנוגדן צריך להיות טיטרציה.
  13. שטפו תאים שלוש פעמים עם 250 μl PBS המכיל 1% BSA. שבץ תאי הרכבה בינוני ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד בדיקה באמצעות מיקרוסקופ.
  14. לקבוע מספר החיידקים פלשו לכל שדה מוגדר מראש. האם זה על ידי ספירת 20 שדות לכל קרום מסנן. חישוב אחוזי חיידקים פלשו.
    הערה: הכפל את ספירת חיידקי ממוצע של 20 שדות מיקרוסקופיים עם שטח קואפיקient. התוצאה מבטאת את כמות החיידקים הכולל נוכח להכניס מסנן תרבית תאים 0.33 סמ"ר. מחלקי ערך זה על ידי כמות החיידקים גדלו בתקשורת במהלך תקופת ההדבקה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים culturing וזיהום של תאי HIBCPP במערכת להכניס תרבית תאים הפוכה. מודל זה מאפשר לנו לחקור מנגנוני פלישה ואת מסלולי איתות מולקולרית שבבסיס מצד התא basolateral, להתרבות מצב פיסיולוגי של חיידקים בהפצה והזנת תאי אפיתל דרך זרם הדם (איור 1).

תאי HIBCPP להציג פונקציות מחסום מסוימות, אשר מאפשרות להם להגביל חליפין מולקולריים לרמ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לתאי האפיתל של CP מהווים את BCSFB שמפריד בין CSF מן 2,3 דם. לאחרונה הקים את הקו הסלולרי HIBCPP כמודל אנושי מתפקד של BCSFB. התאים להציג פונקציות מחסום חשובות של BCSFB במבחנה, כוללים הפיתוח של פוטנציאל הממברנה גבוה, חדירות נמוכות עבור מקרומולקולות, כמו גם הנוכחות של גדילים רציפים של TJS 5. חלבוני TJ לתרום קוטביות פסגה / basolateral של התאים. הקוטביות היא בעלת חשיבות גבוהה עבור לוקליזציה בבימויו של הקולטנים כמו גם חלבונים טרנספורטר ספציפיים. הראינו לוקל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להודות לפרופ' הרטוויג וולבורג על ביצוע מיקרוסקופ האלקטרונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.25% טריפסין-EDTAGibco25200-056
4´,6 דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI)Life TechnologiesD1306
צלחות 12 בארותStarlabCC7682-7512
צלחות 24 בארותStarlabCC7682-7524
Anti Neisseria meningitidis α-OMPנוגדן זה היה מתנה מד"ר ה. קלאוס ו-U. Vogel (אוניברסיטת Wü רצבורג, גרמניה)
Alexa Fluor 488 (עוף נגד ארנב)InvitrogenA21441
Alexa Fluor 594 (עוף נגד ארנב)InvitrogenA21442
Alexa Fluor 660 PhalloidinInvitrogenA22285
סרום בקר אלבומין (BSA)Calbiochem12659
צלחות אגר שוקולדBiomerieux43109
ציטוכלזין DSigmaC8273
DMEM/F12 + L-Glut + 15 מ"מ HEPESGibco31330-095
DMEM/F12 + L-Glut + 15 מ"מ HEPES ללא פנולרדGibco11039-047
דימתיל סולפוקסידSigmaD2650
סרום עגל עוברי (FCS)Life Technologies10270106
FITC-InulinסיגמאF3272
אינסוליןסיגמא19278
MgCl2Sigma2393
NaHCO3Sigma55761
PBS + Mg + CaGibco14040-174
פניצילין/סטרפטומיציןMP ביו-רפואי1670049
פוליוויטקסBiomerieux55651
Proteose peptoneBD211684
בינוני ללא סרוםGibco10902-096
מוסיף תרבית תאים דקים לצלחות 24 בארות, גודל נקבוביות 3 ומיקרו; mGreiner662630
בקבוק תרבית רקמות 75 ס"מ² כובע אדום סטריליגריינר658175
Triton X-100SigmaT8787
וולט-אוהם מטר Millicell-ERS2 עם אלקטרודה MERSSTX01MilliporeMERSSTX00

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37, 13-25 (2009).
  2. Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 75-88 (2010).
  3. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Imunopathol. 31, 497-511 (2009).
  4. Ishiwata, I., Ishiwata, C., Ishiwata, E., Sato, Y., Kiguchi, K., Tachibana, T., et al. Establishment and characterization of a human malignant choroid plexus papilloma cell line (HIBCPP). Hum Cell. 18, 67-72 (2005).
  5. Schwerk, C., Papandreou, T., Schuhmann, D., Nickol, L., Borkowski, J., Steinmann, U., et al. Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in anovel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. PloS One. 7, e30069(2012).
  6. Bernd, A., Ott, M., Ishikawa, H., Schroten, H., Schwerk, C., Fricker, G. Characterization of efflux transport proteins of the human choroid plecus papilloma cell line HIBCPP, a functional in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Pharm Res. , (2014).
  7. Gründler, T., Quednau, N., Stump, C., Orian-Rousseau, V., Ishikawa, H., Wolburg, H., et al. The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).
  8. Schwerk, C., Tenenbaum, T., Kwang, S. K., Schroten, H. The choroid plexus - a multi-role player during infectious diseases of the CNS. Front Cell Neurosci. 9, 80(2015).
  9. Pron, B., Taha, M. K., Rambaud, C., Fournet, J. C., Pattey, N., Monnet, J. P., et al. Interaction of Neisseria meningtidis with the components of the blood-brain barrier correlates with increased expression of PilC. J Infect Dis. 176, 1285-1292 (1997).
  10. Guarner, J., Greer, P. W., Whitney, A., Shieh, W. J., Fischer, M., White, E. H., Carlone, G. M., et al. Pathogenesis and diagnosis of human meningococcal disease using immunohistochemical and PCR assays assays. Am J Clin Pathol. 122, 754-764 (2004).
  11. Pizarro-Cerda, J., Kuhbacher, A., Cossart, P. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, (2012).
  12. Beutler, B. Microbe sensing, positive feedback loops and the pathogenesis of inflammatory diseases. Immunol. Rev. 227, 248-263 (2009).
  13. Wilson, E. H., Weninger, W., Hunter, C. A. Trafficking of immune cells in the central nervous system. J Clin Invest. 120, 1368-1379 (2010).
  14. Meeker, R. B., Williams, K., Killebrew, D. A., Hudson, L. C. Cell trafficking through the choroid plexus. Cell Adh Migr. 6, 390-396 (2012).
  15. Borkowski, J., Li, L., Steinmann, U., Quednau, N., Stump-Guthier, C., Weiss, C., et al. Neisseria meningitidis elicits a pro-inflammatory response involving I kappa B zeta in a human blood-cerebrospinal fluid barrier model. J Neuroinflammation. 11, 163(2014).
  16. Steinmann, U., Borkowski, J., Wolburg, H., Schroppel, B., Findeisen, P., Weiss, C., et al. Transmigration of polymorphnuclear neutrophils and monocytes through the human blood-cerebrospinal fluid barrier after bacterial infection in vitro. J Neuroinflammation. 10, 30(2013).
  17. McGuiness, B. T., Clarke, I. N., Lambden, P. R., Barlow, A. K., Poolman, J. T., Heckels, J. E. Point mutation in meningococcal por A gene associated with increased endemic disease. Lancet. 337, 514-517 (1991).
  18. Ram, S., Cox, A. D., Wright, J. C., Vogel, U., Getzlaff, S., Boden, R. Neisserial lipopolysaccharide is a target for complement component C4b. inner core phosphoethanolamine residues define C4b linkage specificity. J Biol Chem. 278, 50853-50862 (2003).
  19. Claus, H., Maiden, M. C., Maag, R., Frosch, M., Vogel, U. Many carried meningococci lack the genes required for capsule synthesis and transport. Microbiology. 148, 1813-1819 (2002).
  20. Claus, H., Maiden, M. C., Wilson, D. J., Mccarthy, N. D., Jolley, K. A., Urwin, R., et al. Genetic analysis of meningococci carried by children and young adults. J Infect Dis. 191, 1263-1271 (2005).
  21. Tenenbaum, T., Papandreou, T., Gellrich, D., Friedrichs, U., Seibt, A., Adam, R., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cell Microbiol. 11, 323-336 (2009).
  22. Laflamme, N., Echchannaoui, H., Landmann, R., Rivest, S. Cooperation between toll-like receptor 2 and 4 in the brain of mice challenged with cell wall components derived from gram-negative and gram-positive bacteria. Eur J Immunol. 33, 1127-1138 (2003).
  23. Laflamme, S., Rivest, S. Toll-like receptor 4: the missing link of the cerebral innate immune response triggered by circulating gram-negative bacterial cell wall components. FASEB J. 15, 155-163 (2001).
  24. Zughaier, S. M. Neisseria meningitidis capsular polysaccharides indice inflammatory responses via TLR2 and TLR4-MD-2. J Leukoc Biol. 89, 469-480 (2011).
  25. Yamamoto, M., Yamazaki, S., Uematsu, S., Sato, S., Hemmi, M., Hoshino, K., et al. Regulation of Toll/IL-1-receptor -mediated gene expression by the inducible nuclear protein IkappaBzeta. Nature. 430, 218-222 (2004).
  26. Lorenz, J., Zahlten, J., Pollok, I., Lippmann, J., Scharf, S., N'Guessan, P. D., et al. Legionella pheumophila-induced IkappaBzeta-dependent expression of interleukin-6 in lung epithelium. Eur Respir J. 37, 648-657 (2011).
  27. Jaerve, A., Muller, H. W. Chemokines in CNS injury and repair. Cell Tissue Res. 349, 229-248 (2012).
  28. Schneider, H., Weber, C. E., Schoeller, J., Steinmann, U., Borkowski, J., Ishikawa, H., et al. Chemotaxis of T-cells after infection of human choroid plexus papilloma cells with Echovirus 30 in an in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Virus Res. 170, 66-74 (2012).
  29. Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. Choroid plexus: Target for polypeptides and site of their synthesis. Microsc. Res. Tech. 52, 65-82 (2001).
  30. Dickson, P. W., Schreiber, G. High levels of messenger RNA for transthyretin (prealbumin) in human choroid plexus. Neurosci. Lett. 66, 311-315 (1986).
  31. Stylianopoulou, F., Herbert, J., Soares, M. B., Efstratiadis, A. Expression of the insulin-like growth factor II gene in the choroid plexus and the leptomeninges of the adult rat central nervous system. Proc Natl Acad Sci USA. 85, 141-145 (1988).
  32. Lim, L., Zhou, H., Costa, R. H. The winged helix transcription factor HFH-4 is expressed during choroid plexus epithelial development in the mouse embryo. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94, 3094-3099 (1997).
  33. Vandenhaute, E., Stump-Guthier, C., Lasierra Losada, M., Tenenbaum, T., Rudolph, H., Ishikawa, H., et al. The choroid plexus may be an underestimated site of tumor invasion to the brain: an in vitro study using neuroblastoma cell lines. Cancer Cell Int. , 15-102 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Neisseria meningitidisFITCZO 1Occludin Claudin

מאמרים קשורים