הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

קידום Aggregation 3-D של תאי אפיתל הרתי המטוהר FACS עם EAK 16-II / EAKIIH6 עצמית להרכבת הידרוג'ל

5.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54062

⸱

27 ביוני 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Cellular Therapeutics, Allegheny Health Network, 2Division of Pharmaceutical Sciences, Mylan School of Pharmacy, Duquesne University, 3Department of Biological Sciences, Carnegie Mellon University

במאמר זה

סיכום

סרטון זה מדגים פרוטוקול להעשרת תאי אפיתל תימיים (TECs) עם שיפוע צפיפות לבידוד FACS. הוא גם מראה את השימוש בפפטידים EAK16-II/EAKIIH6 כדי לקדם את היווצרות הצבירה של TEC. המיקרו-סביבות של הידרוג'ל EAK16-II/EAKIIH6 מספקות את התצורה התלת-ממדית הדרושה לשמירה על ההישרדות והתפקוד של ה-TEC.

תקציר

התפתחות בלוטת התימוס, הקשורה להזדקנות או עלבונות פתולוגיים, גורמת לירידה בתפוקה של תאי T בוגרים. שחזור התפקוד של בלוטת התימוס הכושלת הוא חיוני לשמירה על תגובה חיסונית נרכשת יעילה בתיווך תאי T כנגד פתוגנים פולשים. עם זאת, התחדשות התימוס והחייאתו התגלו כמאתגרים, בעיקר בשל הקשיים בשחזור המיקרו-סביבה התלת-ממדית הייחודית של הסטרומה התימית שהיא קריטית להישרדות ולתפקוד של תאי אפיתל תימוס (TECs). פיתחנו מערכת הידרוג'ל חדשה לקידום היווצרותם של אגרגטים TEC, המבוססת על תכונת ההרכבה העצמית של האוליגופפטידים האמפיפיליים EAK16-II והאנלוגי ההיסטידיניל שלו EAKIIH6. TECs הועשרו מתאים תימיים מבודדים עם שיפוע צפיפות, מוינו במיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטי (FACS), וסומנו בנוגדנים של מולקולת הידבקות תאים אנטי-אפיתל (EpCAM) שעוגנו, יחד עם אנטי-His IgGs, על קומפלקסי מתאם החלבון A/G. היווצרות אגרגטים של תאים קודמה על ידי דגירה של TECs עם אוליגופפטידים EAKIIH6 ו-EAK16-II, ולאחר מכן על ידי הגדלת הריכוז היוני של המדיום כדי להתחיל ג'לציה. אגרגטים של TEC המוטבעים בהידרוג'ל EAK יכולים לקדם ביעילות את התפתחותם של תאי T פונקציונליים in vivo כאשר הם מושתלים בעכברים עירומים אתימיים.

מבוא

התימוס הוא איבר הלימפה הראשי אחראי לייצור אוכלוסייה מגוונת של תאי הפתוגן-reactive, עצמי סובלני T כי הוא חיוני לתפקוד של מערכת החיסון הנרכשת. זהו איבר דינמי שבו thymocytes פיתוח, עלה ממח העצם כפי ובתאים הלימפוציטים, נודדים דרך מטריקס תלת מימדי דמוי ספוג (3-D) של stroma הרתי, לעבור השושלת-מפרט והבחנה, ובסופו של דבר להגר כפי בוגרת T-תאי. הצלחתו של תהליך מתוכנת היטב זה תלוי במידה רבה על הצטלבות בין thymocytes נודדות לתאי האפיתל מגורים הרתי (Tecs), האוכלוסייה השלטת של stroma הרתי החיוניים לקביעתם ולקיומם של שלמות במיקרו-סביבה של התימוס.

בהתבסס על המיקום האנטומי שלהם פונקציה ייחודית, Tecs ניתן לחלק לשתי קבוצות משנה: הטקאנים בקליפה (cTECs) כי הם responsible לבחירה עצמי MHC (מורכבי histocompatibility גדולים) מוגבל מתאי T (סלקציה חיובית), ואת Tecs ב הלשד (mTECs) כי הם חיוניים עבור ביטול אוטוריאקטיבים תאי T (סלקציה שלילית) 1,2. גורמים רבים (למשל, הזדקנות, זיהום, קרינה, התרופה טיפולים) יכול לגרום נזק בלתי הפיך האפיתל הרתי, וכתוצאה מכך חסינות אדפטיבית נפגעת. למרות ניסיונות רבים, משחזר את תפקוד הרתי כבר מאתגר בשל הקושי לשחזר את המיקרו-סביבה הרתי. יש לציין, הרתי תלת ממדי (3-D) תצורה היא קריטית להישרדות והתפקוד של Tecs, ואילו Tecs תורבת בסביבת 2-D במהירות להקטין את הביטוי של גנים קריטיים עבור 3,4 thymopoiesis.

EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) ו אנלוגי histidinylated C- מסוף שלה EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH) הם משקל מולקולרי נמוך, oligopeptides amphiphilic כי הם מסיסים שתייה ללא יוניםr, אבל לעבור gelation ליצירת β-הסיבים כאשר הם נחשפים כוח יוניים גבוה מ -20 מ"מ NaCl (ריכוז מלח רגיל בנוזל הגוף האנושי הוא 154 מ"מ). נכס תגובה הסביבה זה גורם להם להיות אבני הבניין צדדי כדי ליצור מבנים 3D. The-התג שלו על EAKII-H6 מספק מנגנון עגינה, שבאמצעותו IgGs אנטי שלו / Fc מחייב חלבון רקומביננטי / G (αH6: PA / G) מתחמים יכולים לשמש מתאם לעגן תרופות חלבון ביומולקולות אחר ( למשל, נוגדנים) על מרוכבים הידרוג'ל 5-8.

אנחנו הוכחנו בעבר כי מולקולות ניאון שכותרתו IgG מעוגנות על הידרוג'ל ניתן להיעזר באזור הזריקה עד 13 ימים 9. יתר על כן, כאשר αH6: מתאמי הרשות / G מעוגן עם IgGs אנטי CD4 נוספו EAK16-II / EAKIIH6 (EAK) הידרוג'ל, תאי CD4 + T נתפסו במיוחד 10. באמצעות טכניקה דומה, אנחנו הוכחנו לאחרונה כי צבירת 3-D של ג Tecsולד יקודם הידרוג'ל EAK עם מתחמי מתאם נושאת נוגדנים אנטי EpCAM TEC-ספציפי (αH6: PA / G: αEpCAM). כאשר מושתלים מתחת קפסולות הכליות של עכברים בעירום, אשכולות TEC מוטבעים הידרוג'ל EAK יכולים לתמוך בפיתוח יעיל של תאי T התפקודיים in vivo 11,12.

כאן אנו מדגימים את השיטה שלנו לטהר Tecs במהירות וביעילות עם תא המופעל הקרינה מיון (FACS) וליצור 3-D אגרגטים TEC עם מערכת הידרוג'ל EAK.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל בעלי החיים המשמשים בניסויים שוכנו במתקן החיה במכון מחקר אלגני-זינגר תחת הפרוטוקול נבדק ואושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש המכון לחקר זינגר רשת בריאות אלגני / אלגני.

1. לעכל את התימוס עם Collagenase

  1. בלוטות התימוס קציר.
    1. להרדים 3-5 שבועות בן עכברים C57BL6 / J בתוך הפחמן הדו-חמצני (CO 2) תא למסוק בלוטות התימוס. בפירוט, מניחים את העכברים בתא תחת אינדוקציה 2 CO 3-5 דקות ולאשר למוות על ידי אימות דום לב או נשימה.
    2. הנח את הפגר על גבו להרטיב את הגוף עם אתנול 70%. לעשות חתך אופקי קטן עם מספרי לנתח חד, ישר על הבטן שלה דרך העור. משוך את העור משני הקצוות (ראש ורגליים), כך הוא גם הפוך לחלוטין.
    3. ביצוע חתך אופקי עם המספריים לנתח רק תחתהצלע הנמוכה ביותר לחתוך דרך הסרעפת לצדדים. החזק את תהליך xiphoid עם מלקחיים ולחתוך באמצע הצלעות שתמשיך עד משני הצדדים. משוך כלפי מעלה את הצלעות / עצם החזה כך התימוס נראה בבירור.
      הערה: קורנית שוכנת ישירות על החלק העליון של הלב, מורכבת מ -2 אונות והוא בצבע לבן שקוף.
    4. בעזרת מלקחיים מעוקלים, בעדינות לגרוף ולמשוך אונות התימוס ההנחה של רקמות חיבור העביר בתמיסת כביסה (ראה רשימה של חומרים).
  2. הכן פתרון העיכול על ידי ערבוב 9 מ"ל RPMI-1640 (מכון ממוריאל פארק רוזוול בינוני-1640), 0.025 מ"ג / collagenase מטוהרים מ"ל, 10 HEPES מ"מ [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic חומצה], ו -0.2 מ"ג / מ"ל DNase אני בתוך שפופרת 50 צנטריפוגות מ"ל. שמור את הפתרון העיכול ב -37 מעלות צלזיוס המים באמבטיה עד השימוש.
    הערה: סכום פתרון העיכול המוכן מספיק thymi עכבר עד חמישה מבוגרים, אשר יכול להיות מודגרות יחד עגול קלקר אחד 5 מיליליטרצינור תחתון.
  3. מעבירים את התימוס לצלחת בתרבית רקמה 60 מ"מ המכיל 5-6 מ"ל RPMI-1640.
  4. לנתח את בלוטת התימוס עם 28 G אינסולין מזרק מחט לחתיכות קטנות (ריבוע 1 מ"מ 3 על) כדי לאפשר לזרום החוצה לימפוציטים.
  5. שוטפים את חתיכות הרתי עם RPMI-1640 כי הוא בצלחת פטרי עם פיפטה זכוכית פסטר. הטה את הצלחת ולתת שברי הרתי ליישב לתחתית. לאט לשאוב וזורקים supernatant RPMI-1640 באמצעות פיפטה מזכוכית. חזור על שלב שטיפה זה עם 5-6 מ"ל RPMI-1640 עבור 4-5 פעמים עם פיפטה זכוכית עד הפתרון הוא פחות אטום.
    הערה: טפטפות זכוכית מומלץ בשלב זה, שכן שברי הרתי נוטים לדבוק פלסטיק, וכתוצאה מכך אובדן מוגזם של רקמות הרתי. עבור שאר ההליך, להשתמש טפטפות פלסטיק.
  6. לאחר השטיפה הסופית, לבטל את supernatant כמתואר בשלב 1.5. הוסף פתרון העיכול 3 מ"ל ולהעביר את חתיכות התימוס והפתרון לתוך 5 מ"ל p מסביב לתחתיתצינור olystyrene.
  7. מניחים את הצינור על הכתף צינור לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות במהירות סיבוב של 12 סל"ד.
  8. לאחר דגירה, לתת את שברי הרתי ליישב לתחתית של התחתית על ידי כוח הכבידה. אסוף את supernatant עם פיפטה פסטר ולהעביר לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל עם 10 מ"ל של תמיסת שטיפה. צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות, לבטל את supernatant ו resuspend התאים בתמיסה לשטיפת 10 מ"ל. שמור על הקרח.
  9. חזור על שלבים 1.6-1.8 פעמיים על שברי הרתי ב -5 מ"ל מסביב לתחתית צינור קלקר. לרכז את supernatant בצינור אותו 50 מ"ל.
    הערה: צנטריפוגה אין צורך השני לשטוף השלישי.
  10. לאחר העיכול הסופי, pipet למעלה ולמטה עם 2 מיליליטר פיפטה סרולוגיות פלסטיק לשבור כל שברים שנותרו בצינור והעברת צינור צנטריפוגות 50 המ"ל.
  11. צנטריפוגה שפופרת 50 מ"ל ב 300 XG במשך 5 דקות, לשאוב supernatant, resuspend ב 10 מ"ל של שטיפת buffer ולסנן דרך 100 מיקרומטר תא מסנן. שמור על הקרח.

2. העשרה של Tecs עם שיפוע צפיפות רציף

  1. הכן פתרון שיפוע צפיפות 21% על ידי ערבוב 2.4 מ"ל בינוני שיפוע צפיפות (60% w / v של iodixanol במים) פתרון הכביסה 9.6 מ"ל.
  2. צנטריפוגה התאים הרתי ניתק בצינור 50 מ"ל אוסף משלב 1.11 ב XG 300 במשך 5 דקות ו resuspend במאגר כביסה 2.5 מ"ל.
  3. הוסף 20 מ"ל בינוני RPMI-1640 על השעיית התא.
  4. מלאו 12 מ"ל של תמיסת שיפוע צפיפות 21% בתוך pipet סרולוגיות 10 מ"ל עם פיפטור אלקטרוני. מניחים את קצה pipet סרולוגיות בתחתית הצינור צנטריפוגה 50 מ"ל תאים המכילים, ולאפשר הפתרון שיפוע צפיפות לנקז אל החלק התחתון של הצינור באמצעות כוח הכבידה.
    1. בעדינות לגרש פתרון שיפוע צפיפות מ pipet לסיים שהניב שתי השכבות של צפיפויות שונות.
  5. צנטריפוגה ב 600 XG FOr 20 דקות ב RT ב הרוטור מתנדנד-דלי. הגדר את קצב ההאטה ברמה האיטית ביותר.
  6. מעבירים את השכבה העליונה ואת ממשק לצינור חדש 50 מ"ל.
    הערה: רוב Tecs נשמרים בממשק. לימפוציטים יהיה להאיץ לתחתית הצינור לאחר צנטריפוגה. אם תאים אלה ישמשו למטרות אחרות, יש לשטוף את הגלולה עם פתרון כביסה 20 מיליליטר במשך שלוש פעמים. Resuspend התאים 10 מ"ל של חיץ הכביסה.
  7. הוסף פתרון כביסה עד 40 מ"ל אל הצינור בשלב 2.6 ו צנטריפוגות ב 400 XG במשך 6 דקות ב 4 ° C. כדי להסיר את supernatant, לשאוב עם pipet.
  8. חזור על הכביסה פי 2 השאיפה כמתואר בשלב 2.7.
  9. Resuspend ב 2 מ"ל של תמיסת שטיפה לספור את התאים עם hemocytometer.

3. Tecs בידוד עם FACS

  1. התאם התאים משלב 2.9 בריכוז של 1x10 6 תאים / 100 μl עם פתרון כביסה והעברתהתאים לצינור 5 מ"ל מסביב לתחתית (פוליפרופילן או קלקר, כפי שהומלץ על ידי ההנחיות של סדרן זרימה).
  2. מוסיפים 2 IgG הקולטן אנטי Fc μl לכל 1x10 6 תאים דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
  3. תוספת CD45 אנטי (דילול 1: 150, 10 μl לדגימה) ואנטי-EpCAM (1: 100 דילול, 10 μl לדגימה) נוגדני דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך יותר מ -20 דקות.
  4. שוטפים את התאים עם פתרון צנטריפוגות כביסה 2 מ"ל ב 400 XG במשך 6 דקות ב 4 ° C. לשאוב supernatant עם טפטפת.
  5. Resuspend התאים שנאגרו מלוחים פוספט 1x 1 מ"ל (PBS).
  6. סינון דרך מסננת 100 מיקרומטר.
  7. החל את התאים למכשיר מיון. בחר את הלימפוציטים ואוכלוסיית TEC למעט התאים הקטנים ביותר על אור המפוזר בצד (SSC) / אור-מפוזר קדימה פנל (FSC) (תאים מתים), אז שער על האוכלוסייה שנבחרה CD45- EpCAM + למיון 13.

4. Generation של TEC / EAK אגרגטים

הערה: יש לבצע הכנה מגיב וצעדים מעורבים תא ערבוב מתחת למכסה המנוע למינרית.

  1. הכן מתחמי מתאם PA / G על ידי ערבוב 4 μl של IgG אנטי-שלו-תג, 8 μl של IgG אנטי EpCAM ו -2.6 μl של הרשות / G בתוך שפופרת microcentrifuge סטרילי 1.5 מ"ל, ו לדגור על RT במשך 5 דקות.
  2. התאם את Tecs מסודרים משלב 3.7 ל 5x10 4 תאים / מ"ל עם פתרון כביסה, ו pipet 100 μl כדי אחד טוב של אויר נמוך, 96-גם צלחת בתרבית רקמה מסביב לתחתית. להוסיף 14.6 מתחמי מתאם PA / G μl אל התאים. מניח את הצלחת על פלטפורמת נדנדה במשך 20 דקות ב 4 °.
  3. שטפי פעם עם 200 פתרון הכביסה μl. צנטריפוגה את הצלחת ב 400 XG במשך 6 דקות. בטל supernatant עם micropipette.
  4. שטפי פעם עם תמיסת סוכרוז 200 μl 10%. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 6 דקות. בטל supernatant עם micropipette.
  5. תאים Resuspend ב 30 μl 10% sתמיסת סוכרוז terile לכל טוב.
  6. הוסף 10 μl של EAKIIH6 (7.5 מ"ג / מ"ל) ו דגירה במשך 5 דקות ב RT.
  7. הוסף 20 μl של EAK16-II (10 מ"ג / מ"ל) לתערובת TEC.
  8. הוספת 100 μl של מדיום מלא למערכת ליזום gelation. מניחים את הצלחת על שייקר פלטפורמה 15-20 דקות ב RT.
  9. מניח את הצלחת בחממה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. לאחר 2-4 שעות, להוסיף עוד 100 μl של בינוני מלא.
  10. שנה בינונית בכל יום אחר עד השימוש.
    1. לשאוב 100 μl של המדיום מפני השטח מבלי להפריע את הג'ל באמצעות micropipette בעדינות להוסיף 100 μl של מדיום מראש חימם ידי הצבת קצה פיפטה אל הקיר של הבאר.

אפיון 5. של אגרגטים TEC / EAK

  1. כדי לבחון את הפונקציה של אגרגטים TEC / EAK in vivo, לאסוף את TEC / הידרוג'ל EAK לאחר O / N תרבות השתלת תחת הקפסולה כליות של athymic בעירוםעכבר, באמצעות שתואר לעיל הליך 11,14.
  2. לפקח על התפתחות תאי T בפריפריה על ידי קצירת 50-100 דגימות דם μl לתוך צינור איסוף דם המכיל EDTA מן העכברים בעירום 4-6 שבועות לפרסם השתלה ואת כתם עם קוקטייל של CD4 אנטי, -CD8, -CD45 , ו -CD3 נוגדנים 12.
  3. לנתח את האחוזים של לימפוציטים מסוג T ב לויקוציטים דם היקפיים עם cytometry זרימה (FCM), באמצעות תוכנת ניתוח תא בודד 12.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי לבחון את האפקטיביות של השימוש בפרוטוקול ההפרדה שיפוע צפיפות להעשיר את תאי סטרומה CD45-, תאים שנקטפו משני הממשק ואת כדורי הלימפוציטים זירז הוכתמו אנטי CD45 ונוגדנים אנטי EpCAM. שני 1 אנטי Ulex Europaeus agglutinin (UEA1) ונוגדנים נגד MHC Class II נכללו גם קוקטייל מכתים להמשיך לזהות את תת cTEC ו Mtec. כפי שניתן לראות בתרשים 1, הצלחנו להשיג שגרתי קרוב ל 15-20 פעמים העשרה של Tecs.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בעוד Tecs הם האוכלוסייה השלטת של stroma הרתי ולשחק תפקידים חיוניים עבור המבנה והתפקוד של בלוטות התימוס, הם מהווים רק 0.1-0.5% של cellularity הרתי הכולל. הם גם תאי שברירי כמו באחוזים גבוהים של מוות של תאים הם נצפו לעתים בעקבות עיכול collagenase, כלומר, הטיפול לנתק Tecs מן מטריקס (ECM). הנדירות שלהם (~ 200,000 לכל התימוס עכבר) והשברירי, היו זו משימה מאתגרת לבודד Tecs. הניצול האחרון של collagenase הנקי במיוחד בבידוד TEC הגדיל באופן משמעותי את מספרם של תאי חיים בעקבות העיכול ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים.

תודות

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים R21 AI113000 (WSM) ו R01 AI123392 (YF).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>TEC בידוד
70% אתנולDecon Laboratories2701 (1 ליטר)אתנול 200 הוכחה, מספריים לניתוח מים נטולי יונים
, ישרFine Science Tools, Inc.91460-11
מלקחיים של Graefe, ישרFine Science Tools, Inc.11053-10
מלקחיים של Graefe,Fine Science Tools, Inc.11052-10
תמיסת1x PBS, 0.1% BSA, 2  mM EDTA
1x PBS (תמיסת מלח חוצצת פוספט)Gibco10010-023
BSA (אלבומין בסרום בקר)SigmaA1470-100G
EDTA (חומצה אתילנדיאמינטטראצטית)Invitrogen15575-038
תמיסת9 מ"ל RPMI-1640, 0.025  מ"ג/מ"ל Liberase TM ציון מחקר, 10  מ"מ HEPES, 0.2  מ"ג/מ"ל DNaseI
RPMI-1640Gibco11879-020
Liberase TM Research GradeRoche05 401 127 001המכונה "קולגנאז מטוהר"
1  M HEPESLonza17-737E
Dnase IRoche10 104 159 001
50  צינור צנטריפוגה מ"לקורנינג430290
60  צלחת תרבית רקמות מ"מפלקון353002
1/2  מזרק אינסולין cc U-100 28  1/2  ג'יבקטון דיקינסון329461
5  מ"ל פוליסטירן צינור תחתון עגולפלקון352058
5  מ"ל צינור זכוכיתפישר הלת'13-678-27Eהשתמש לשטיפת שברי התימוס. שברי תימוס נוטים להיצמד לקיר בעזרת צנרת פלסטיק.
מסובב צינור MACSmixMiltenyi130-090-753
100  ומיקרו; מסננת תאים mFalcon352360
מדיום שיפוע צפיפות: OptiPrepAxis-Shield
<מיון תאים חזק>
5  מ"ל פוליפרופילן צינור תחתון עגולFalcon352063
נגד עכבר CD16/CD32 (FC Block)BD Biosciences553142להשתמש כלא מדולל, 2  ומיקרו; l לכל דגימה
נגד עכבר CD45-PercpCy5.5eBioscience45-0451-80השתמש ב 1:150, 10  ומיקרו; l לכל דגימה
נגד עכבר CD326 (EpCAM)-PEeBioscience12-5791-82השתמש ב-1:100, 10  ומיקרו; l לכל דגימה
BD InfluxBD Biosciences
FlowJo
EAK ג'ל הרכבה
אנטי-היס-תגAnaSpec29673"אנטי-היס-תג IgG"
מטוהר נגד עכבר CD326 (EpCAM)BioLegend118202"אנטי-EpCAM IgG"
חלבון רקומביננטי A/Gפירס ביוטכנולוגיה
1.5  ml Safe-Lock Tubes, Biopur, SterileFisher Healthcare05-402-24Bהמכונה "1.5  צינור מיקרוצנטריפוגה מ"ל "
96 בארות, צלחת תרבית רקמות, תחתית עגולה עם מכסה אידוי נמוךBD Falcon353917
פלטפורמת נדנדה: מיקסר Nutator מס' 1105BD Clay Adams
10% סוכרוזSigmaS0389הכן עם מים מזוקקים סטריליים
EAK16-II (AcNH-AEAEAKAEAEAKAK-CONH2)American Peptide Company& נ.ב.פ;מסונתז בהתאמה אישית, 10  מ"ג/מ"ל
EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2)חברת הפפטידים האמריקאית מסונתז בהתאמה אישית, 7.5  מ"ג/מ"ל
בינוני, 10% FBS, 1% עט/סטרפטוק, 1% L-גלוטמין, 1% NEAA, 5  מ"מ HEPES, 50  ומיקרו; M 2-מרקפטואתנול
RPMI-1640ג'יבקו11879-020
FBS (סרום בקר עוברי)Atlanta BiologicalsS11150מושבת בחום לפני השימוש
עט/סטרפטוקוקוסגיבקו15140-122
L-גלוטמין 200  מ"מ (100x)גיבקו25030-081
NEAA (חומצת אמינו לא חיונית) 100xגיבקו11140-050
1  M HEPESBioWhittaker17-737E
2-Mercaptoethanol (100x)MilliporeES-007-E
שייקר פלטפורמה: רקדנית הבטןStovall Life Sciences Inc.דגם: USBDbo
כביסה עיכול תוכנה לניתוח תאים בודדים RPMI-1640 מלא

מקורות

  1. Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
  2. Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
  3. Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
  4. Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
  5. Fung, S. Y., Yang, H., Chen, P. Formation of colloidal suspension of hydrophobic compounds with an amphiphilic self-assembling peptide. Colloids Surf B Biointerfaces. 55, 200-211 (2007).
  6. Jun, S., et al. Self-assembly of the ionic peptide EAK16: the effect of charge distributions on self-assembly. Biophys J. 87, 1249-1259 (2004).
  7. Saunders, M. J., et al. Engineering fluorogen activating proteins into self-assembling materials. Bioconjug Chem. 24, 803-810 (2013).
  8. Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc of the Natl Acad Sci U S A. 90, 3334-3338 (1993).
  9. Wen, Y., et al. Coassembly of amphiphilic peptide EAK16-II with histidinylated analogues and implications for functionalization of beta-sheet fibrils in vivo. Biomaterials. 35, 5196-5205 (2014).
  10. Zheng, Y., et al. A peptide-based material platform for displaying antibodies to engage T cells. Biomaterials. 32, 249-257 (2011).
  11. Tajima, A., et al. Bioengineering mini functional thymic units with EAK16-II/EAKIIH6 self-assembling hydrogel. Clin Immunol. 160, 82-89 (2015).
  12. Fan, Y., et al. Bioengineering Thymus Organoids to Restore Thymic Function and Induce Donor-Specific Immune Tolerance to Allografts. Mol Ther. 23, 1262-1277 (2015).
  13. Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
  14. Fan, Y., et al. Compromised central tolerance of ICA69 induces multiple organ autoimmunity. J Autoimmun. 53, 10-25 (2014).
  15. Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
  16. Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin Transl Sci. 2, 279-285 (2009).
  17. McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J Immunol Methods. 367, 85-94 (2011).
  18. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol methods. 385, 23-34 (2012).
  19. Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells. J Vis Exp. , e51780(2014).
  20. Graham, J. M. Separation of monocytes from whole human blood. ScientificWorldJournal. 2, 1540-1543 (2002).
  21. Li, X., Donowitz, M. Fractionation of subcellular membrane vesicles of epithelial and nonepithelial cells by OptiPrep density gradient ultracentrifugation. Methods Mol Biol. 440, 97-110 (2008).
  22. Mita, A., et al. Purification method using iodixanol (OptiPrep)-based density gradient significantly reduces cytokine chemokine production from human islet preparations, leading to prolonged beta-cell survival during pretransplantation culture. Transplant Proc. 41, 314-315 (2009).
  23. Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
  24. Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annu Rev Immunol. 24, 571-606 (2006).
  25. St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Sci Rep. 3, 1860(2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

FACSEAKProtein A GEpCAM
קידום Aggregation 3-D של תאי אפיתל הרתי המטוהר FACS עם EAK 16-II / EAKIIH6 עצמית להרכבת הידרוג'ל
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.