הקרנה עבור וריאנטים גנטיים ללא קידוד תפקודיים באמצעות ניידות Electrophoretic Shift Assay (Emsa) ו Assay משקע זיקת DNA (DAPA)

Daniel E. Miller; Zubin H. Patel; Xiaoming Lu; Arthur T. Lynch; Matthew T. Weirauch; Leah C. Kottyan

doi:10.3791/54093

Method Article

הקרנה עבור וריאנטים גנטיים ללא קידוד תפקודיים באמצעות ניידות Electrophoretic Shift Assay (Emsa) ו Assay משקע זיקת DNA (DAPA)

DOI:

10.3791/54093

⸱

August 21st, 2016

Daniel E. Miller¹ , Zubin H. Patel¹^,²^,³ , Xiaoming Lu¹^,³ , Arthur T. Lynch¹ , Matthew T. Weirauch*¹^,⁴ , Leah C. Kottyan*¹

¹Center for Autoimmune Genomics and Etiology, Cincinnati Children's Hospital, ²Medical Scientist Training Program, University of Cincinnati, ³Immunology Graduate Program, University of Cincinnati, ⁴Divisions of Biomedical Informatics and Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים תוכנית אסטרטגית ופרוטוקול לזיהוי וריאנטים גנטיים לא מקודדים המשפיעים על קשירת ה-DNA של גורם השעתוק (TF). פרוטוקול ניסיוני מפורט מסופק לבדיקת משמרת ניידות אלקטרופורטית (EMSA) וניתוח משקעים של זיקה ל-DNA (DAPA) של קשירת TF DNA תלויה בגנוטיפ.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרים גנטיים מבוססי אוכלוסייה ומשפחה מביאים בדרך כלל לזיהוי וריאנטים גנטיים הקשורים סטטיסטית למחלה קלינית או פנוטיפ. עבור מחלות ותכונות רבות, רוב הגרסאות אינן מקודדות, ולכן סביר להניח שהן יפעלו על ידי השפעה על מנגנונים עדינים וקשים יחסית לחיזוי השולטים בביטוי הגנים. כאן, אנו מתארים גישה אסטרטגית כללית לתעדף גרסאות שאינן מקודדות, ולסנן אותן לתפקודן. גישה זו כוללת תעדוף חישובי באמצעות מסדי נתונים גנומיים פונקציונליים ואחריו ניתוח ניסיוני של קשירה דיפרנציאלית של גורמי שעתוק (TFs) לאללים של סיכון ולא סיכון. הן עבור בדיקת שינוי ניידות אלקטרופורטית (EMSA) והן עבור ניתוח משקעים של זיקה ל-DNA (DAPA) של וריאנטים גנטיים, נעשה שימוש באוליגו-נוקלאוטיד DNA סינתטי (אוליגו) לזיהוי גורמים בליזאט הגרעיני של תאים רלוונטיים למחלה או פנוטיפ. עבור EMSA, האוליגונוקלאוטידים עם או בלי גורמים גרעיניים קשורים (לרוב TFs) מנותחים על ידי אלקטרופורזה שאינה דנטורציה על ג'ל פוליאקרילאמיד tris-borate-EDTA (TBE). עבור DAPA, האוליגונוקלאוטידים קשורים לעמוד מגנטי והגורמים הגרעיניים הקושרים באופן ספציפי את רצף ה-DNA נפלטים ומנותחים באמצעות ספקטרומטריית מסה או עם אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE) ואחריו ניתוח כתמים מערביים. ניתן להשתמש בגישה כללית זו באופן נרחב כדי לחקור את התפקוד של וריאנטים גנטיים לא מקודדים הקשורים לכל מחלה, תכונה או פנוטיפ.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סידור מחקרים המבוססים גנוטיפ, כוללים מחקרים אגודים הגנום כולו (GWAS), מחקרי מוקד המועמד, ומחקרי deep-sequencing, זיהו וריאנטים גנטיים רבים הקשורים סטטיסטי עם מחלה, תכונה, או הפנוטיפ. בניגוד לתחזיות המוקדמות, רוב גרסאות אלה (85-93%) נמצאים באזורים ללא קידוד ואל תשנה את רצף החומצות האמיניות של חלבונים ^1,2. פירוש הפונקציה של הגירסות ללא קידוד אלה וקביעת המנגנונים הביולוגיים חיבורם המחלה הקשורה, תכונה, או הפנוטיפ הוכיח מאתגרת ^3-6. פיתחנו אסטרטגיה כללית לזהות את המנגנונים המולקולריים המקשרים גרסאות כדי פנוטיפ ביניים חשוב - ביטוי גנים. צינור זה הוא תוכנן במיוחד כדי לזהות אפנון של TF המחייבת וריאנטים גנטיים. אסטר....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת פתרונות ריאגנטים

להזמין בדיקות oligonucleotide DNA מותאמות אישית לשימוש Emsa ו DAPA.
1. כדי להפחית חלבון הלא ספציפית מחייב, לעצב oligos קצר (בין 35-45 זוגות בסיסים (bp) אורך) ^30, ומניחים את וריאנט של עניין ישירות במרכז מוקף רצף גנומי אנדוגני שלה 17 נ"ב. לקבלת oligos Emsa, להוסיף fluorophore 5 '. לקבלת oligos DAPA, הוסף תג ביוטין 5 ".
2. להזמין הוא גדיל תחושת הגדיל המשלים ההפוך שלה. לחל....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בסעיף זה, תוצאות נציגים למה לצפות ניתנות בעת ביצוע Emsa או DAPA, ואת ההשתנות לגבי איכות lysate מאופיינת. לדוגמא, הוצע כי הקפאת דגימות חלבון הפשרה מספר פעמים עלולה לגרום denaturation. על מנת לחקור את שחזור של ניתוח Emsa בהקשר של אלה "להקפיא להפשיר" מחזורים, שני 35 oligos נ"ב שונות ב וריאנט גנטי הודגרו עם אצווה אחת של lysate גרעיני כי היה מופשר מחדש קפוא עבור הסכום המצוין . פעמי איור 2 מדגימה כי מקפיא הפשרה B-לימפוציטים מסוימים הזה ה.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות התקדמות בטכנולוגיות רצף גנוטיפ מאוד שפרה את היכולת שלנו לזהות וריאנטים גנטיים הקשורים למחלה, היכולת שלנו להבין את המנגנונים התפקודיים מושפעים הגירסות אלה מפגרת. מקור עיקרי של הבעיה הוא הרבה הגירסות הקשורים למחלות ממוקמות n על-קידוד האזורים בגנום, אשר סביר להשפיע מנגנונים קשים הלא-צפוי שליטת ביטוי גנים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מבוסס על טכניקות Emsa ו DAPA, כלים מולקולריים ערך לזיהוי הגנוטיפ תלוי TF מחייב אירועים שתורמים סבירים לפונקציה של הגירסות רבות ללא קידוד. למרות .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לארין צולר, ג'סיקה בנה ולינדזי הייז על המשוב וההכוונה בפיתוח הפרוטוקול. MTW נתמך בחלקו על ידי NIH R21 HG008186 ומענק פרס נאמן מקרן המחקר של בית החולים לילדים בסינסינטי. ZHP נתמך בחלקו על ידי T32 GM063483-13.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
DNA אוליגונוקלאוטידים מותאמים אישית	טכנולוגיות DNA משולבות http://www.idtdna.com/site/order/oligoentry
אשלגן כלורי	פישר סיינטיפיק	BP366-500	KCl, עבור מאגר CE
HEPES (1 מ')	Fisher Scientific	15630-080	עבור מאגר CE ו-NE
EDTA (0.5M), pH 8.0	Life Technologies	R1021	עבור CE, NE ומאגר חישול
נתרן כלוריד	פישר מדעי	BP358-1	NaCl, עבור מאגר NE
Tris-HCl (1M), pH 8.0	Invitrogen	BP1756-100	לחישול מאגר
פוספט מלוח (1x)	Fisher Scientific	MT21040CM	PBS, לשטיפת תאים
תמיסת DL-Dithiothreitol (1 M)			פרוטאז חומר מפחית
קוקטייל	Thermo Scientific	87786	מונע קטבוליזם של קוקטייל מעכב פוספטאז TFs
	Thermo Scientific	78420	מונע דה-פוספורילציה של TFs
Nonidet P-40 תחליף	IBI Scientific	IB01140	NP-40, למיצוי גרעיני
ערכת בדיקת חלבון BCA	Thermo Scientific	23225	למדידת ריכוז חלבון
Odyssey EMSA	Buffer Kit	Licor 829-07910	מכיל את כל מאגרי EMSA הדרושים
ג'ל TBE, 6%, 12 בארות	Invitrogen	EC6265BOX	עבור EMSA
TBE Buffer (10x)	Thermo Scientific	B52	עבור EMSA
FactorFinder ערכת התחלה	Miltenyi Biotec	130-092-318	מכיל את כל מאגרי ה-DAPA הדרושים
Licor Odyssey CLx	Licor		סורק מומלץ עבור DAPA/EMSA
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062	מכיל 10,000 יחידות/מ"ל פניצילין, 10,000 ומיקרו; גרם/מ"ל של סטרפטומיצין, ו-25 ומיקרו; גרם/מ"ל של Fungizone® סרום בקר עוברי אנטי-מיקוטי
	Gibco	26140-079	FBS, למדיית תרבית
RPMI 1640 בינוני	Gibco	22400-071	מכיל L-גלוטמין ו-25 מ"מ HEPES

מעכב Sigma 646563

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (23), 9362-9367 (2009).
Maurano, M. T., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

הקרנה עבור וריאנטים גנטיים ללא קידוד תפקודיים באמצעות ניידות Electrophoretic Shift Assay (Emsa) ו Assay משקע זיקת DNA (DAPA)

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles