מאמר שיטה

משלוח siRNA טיפולית על מערכת העצבים המרכזית באמצעות קטיוני anionic ליפוזומים

DOI:

10.3791/54106

⸱

23 ביולי 2016

 ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Colorado State University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרת פרוטוקול זה היא להשתמש בליפוזומים קטיוניים/אניונים עם פפטיד ממוקד עצבי כמערכת העברת מערכת העצבים המרכזית כדי לאפשר ל-siRNA לחצות את ה-BBB. אופטימיזציה של מערכת אספקה לטיפולים, כמו siRNA, תאפשר אפשרויות טיפול נוספות לפריונים ומחלות ניווניות אחרות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלות פריון נובעות מקיפול שגוי של חלבון פריון תאי נורמלי (PrPC) לאיזומר עמיד לפרוטאז חריג הנקרא PrPRes. הופעתן של מחלות פריונים באוכלוסיות חיות בר והאיום הגובר שלהן על בריאות האדם הובילו למאמצים מוגברים למצוא טיפול למחלות אלה. מחקרים אחרונים מצאו תרכובות אנטי-פריון רבות שיכולות לעכב את איזומר ה-PrPRes הזיהומי או לווסת את חלבון הפריון התאי הרגיל. עם זאת, רוב התרכובות הללו אינן חוצות את מחסום הדם במוח כדי לעכב ביעילות היווצרות PrPRes ברקמת המוח, אינן מכוונות ספציפית ל-PrPC עצבי, ולעתים קרובות הן רעילות מדי לשימוש בבעלי חיים או בבני אדם.

בדקנו אם siRNA המועבר תוך וסקולרי וממוקד לעבר PrPC עצבי הוא תרכובת אנטי-פריונים בטוחה ויעילה יותר. דוח זה מתאר פרוטוקול לייצור שני כלי אספקה ליפוזומליים של siRNA, ולאריזה ואספקה של PrP siRNA לתאים עצביים. שני כלי האספקה הליפוזומליים הם 1) ניסוח ליפוזום siRNA מורכב באמצעות ליפוזומים קטיוניים (LSPCs), ו-2) ניסוח ליפוזום siRNA מכוסה באמצעות ליפוזומים קטיוניים או אניונים (PALETS). עבור ה-LSPCs, siRNA טעון שלילי קשור אלקטרוסטטית לליפוזום הקטיוני. לקומפלקס מתווסף פפטיד טעון חיובי (RVG-9r [גליקופרוטאין של נגיף הכלבת]), המכוון באופן ספציפי לקומפלקסים של ליפוזום-siRNA-פפטיד (LSPCs) על פני מחסום הדם-מוח (BBB) לתאי עצב המבטאים אצטילכולין במערכת העצבים המרכזית (CNS). עבור ה-PALETS (פפטיד המתייחס לליפוזום ב-siRNA טיפולי מכוסה), השומנים הקטיוניים והאניונים הוחזרו על ידי ה-PrP siRNA. הליך זה מביא לאנקפסולציה של ה-siRNA בתוך הליפוזומים הקטיוניים או האניוניים. שוב, הנוירופפטיד RVG-9r נקשר לליפוזומים כדי למקד את קומפלקסי ה-siRNA/ליפוזום למערכת העצבים המרכזית. באמצעות ניסוחים אלה, העברנו בהצלחה PrP siRNA לתאי עצב המבטאים AchR, והפחתנו את ביטוי PrPC של נוירונים במערכת העצבים המרכזית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פריונים הן מחלות ניווניות קשות המשפיעות על מערכת העצבים המרכזית. מחלות פריון לנבוע misfolding של חלבון הפריון הסלולרי הרגיל, PRP C, על ידי האיזומר זיהומיות בשם PRP מיל. מחלות אלו משפיעים מגוון רחב של מינים, כולל ספגת המוח בפרות, scrapie בכבשים, חולה במחלה ממארת כרונית cervids, ואת מחלת קרויצפלד-יעקב בבני אדם 1-3. פריונים לגרום ניוון מוחיה שמתחיל עם אובדן הסינפטי, ומתקדם כדי vacuolization, דבק, איבוד עצבי, ופיקדונות פלאק. בסופו של דבר, מה שגרם למותם של בעלי החיים / 4 פרט. במשך עשרות שנים, חוקרים חקרו תרכובות אמורות להאט או לעצור את התקדמות מחלת פריון. עם זאת, חוקרים לא מצאו או טיפול מוצלח או רכב משלוח מערכתי אפקטיבי.

ביטוי PRP C אנדוגני נדרש לפיתוח מחלות הפריון 5 . לכן, הפחתה או ביטול ביטוי PRP C עלול לגרום עיכוב או שיפור של מחלה. מספר קבוצות יצרו עכברים טרנסגניים עם רמות נמוכות של PRP C או lentivectors מוזרק המבטא shRNA ישירות לתוך רקמת המוח בעכברים לחקור את התפקיד של רמות הביטוי PRP C במחלת הפריון. חוקרים אלה מצאו הפחתת כמות העצבית PRP C הביא לעצירת בנוירופתולוגיה מתקדמת של מחלות הפריון והאריך את החיים של בעלי החיים 6-9. אנחנו דיווחנו על תוצאות טיפול PRP C siRNA בסילוק של PRP מיל בתאי נוירובלסטומה עכבר 10. מחקרים אלה מראים כי השימוש של טיפולים כדי להפחית את רמות ביטוי PRP C, כמו RNA התערבות הקטן (siRNA), אשר מסלק mRNA, אולי מספיק לעכב את התקדמות מחלות פריון. עם זאת, רוב הטיפולים נחקר למחלות הפריון נמסרו בדרכים לא יהיה מעשיבמסגרת רפואית. לכן, טיפול siRNA צריך מערכת משלוח מערכתית, אשר מועברת דרך וריד וממוקד אל מערכת העצבים המרכזי.

החוקרים חקרו את השימוש ליפוזומים כרכב משלוח למוצרי ריפוי גנטי. שומני קטיוני anionic הוא משמשים ההיווצרות של ליפוזומים. שומני קטיוני משמשים באופן נרחב יותר מאשר שומני anionic כי הבדל התשלום בין שומני קטיוני ה- DNA / RNA מאפשר אריזה יעילה. יתרון נוסף של שומני קטיוני הוא שהם לחצות את קרום התא בקלות רבה יותר מאשר שומנים אחרים 11-14. עם זאת, שומנים קטיוני יותר immunogenic מאשר שומנים anionic 13,14. לכן, החוקרים החלו המעבר משימוש קטיוני כדי anionic שומנים ליפוזומים. ג'ין מוצרי טיפול ניתן לארוז ביעילות לתוך ליפוזומים anionic באמצעות סולפט protamine פפטיד בעלי מטען חשמלי חיובי, אשר מתעבה מולקולות DNA / RNA 15-19. מאז lipi anionicds פחות immunogenic מאשר שומנים קטיוני הם עשויים גדלו פעמים במחזור, ועלול להיות נסבל יותר במודלים של בעלי חיים 13,14. ליפוזומים ממוקדים רקמות ספציפיות באמצעות מיקוד פפטידים מחוברים אל ליפוזומים. ונוירופפטידים RVG-9R, אשר נקשר לקולטנים אצטילכולין ניקוטינית, נעשה שימוש כדי למקד siRNA ו ליפוזומים אל CNS 17-20.

דו"ח זה מתאר פרוטוקול לייצר שלושה כלי רכב משלוח siRNA, וכדי לארוז ולספק את siRNA לתאי נוירונים (איור 1). Liposome-siRNA-פפטיד מתחמי (LSPCs) מורכבים ליפוזומים עם siRNA ואת RVG-9R מיקוד פפטיד אלקטרוסטטי מחובר אל פני השטח החיצוני של liposome. פפטיד התייחס ליפוזום כמוס siRNA (PALETS) טיפוליות מורכבות siRNA ו protamine כמוס בתוך liposome, עם ערובה RVG-9R קוולנטית לקבוצות PEG השומנים. באמצעות השיטות הבאות כדי ליצור LSPCs ו PaletS, PRP C siRNA פוחתת ביטוי PRP C עד 90% ב תאים עצביים, אשר טומן בחובו הבטחה עצומה לרפא או מהותית לעכב את התחלתה של פתולוגיה מחלת הפריון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל העכברים גידלו ומתוחזק על משאבי חיית מעבדה, מוכר על ידי האגודה הערכה וההסמכה של הבינלאומי טיפול בבעלי חיים מעבדה, בהתאם הפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש באוניברסיטת קולורדו.

1. הכנת LSPCs

  1. השתמש 1: DOTAP 1 (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-פרופאן): יחס כולסטרול עבור LSPCs. לקבלת הכנה liposome 4 nmole, לערבב 2 nmoles של DOTAP ו -2 nmoles של כולסטרול לתוך 10 מ"ל של 1: פתרון מתנול בבקבוק: כלורופורם 1.
  2. להתאדות 9 מ"ל של כלורופורם: פתרון מתנול באמצעות גז N 2 במנדף. לאדות את 1 מ"ל האחרון של ממס במנדף לילה בלי גז. שים סרט שומנים דק על החלק התחתון של הבקבוק.
  3. מקצה 10 מ"ל של תמיסת סוכרוז 10% ל -55 מעלות צלזיוס.
  4. יוצקים את הפתרון סוכרוז 10% מחומם על הסרט השומנים דק לאט, כלומר 1 מ"ל / דקה, תוך gently מתערבל את הבקבוק. לשמור על 10% סוכרוז בקבוק עם שומנים ב 55 מעלות צלזיוס, כך שמולקולות השומנים להישאר בשלב ג'ל נוזלי. תוצאות Rehydration ב שלפוחית ​​multilamellar היווצרות (MLV).
  5. אפשר שומני רעננותם על 55 מעלות צלזיוס לפחות שעה אחת לפני אומד את ליפוזומים.
  6. להרכיב מכבש לפי הוראות יצרן עם 1.0 מיקרומטר מסננים או להשתמש במסנני מזרק 1.0 מיקרומטר עבור אומדת.
  7. הוסף 1 מ"ל של ההשעיה liposome מחוממת לאחד מזרקים על מכבש, ולהעביר את ההשעיה בין שני מזרקים 11 פעמים. ודא כי ההשעיה היא בתוך המזרק מול מ המזרק המתחילות לאחר 11 המעברים.
  8. את הגודל ליפוזומים שוב דרך 0.45 מיקרומטר אז 0.2 מיקרומטר מסנן כדי ליצור שלפוחית ​​unilamellar גדולה (חביבה). שמור את השעית liposome המחוממת עבור אומדת קלה.
  9. דגירה 20 μl של השעיה liposome 4 nmole (200 מיקרומטר) עם 200 μl של 20 מיקרומטר (4סך nmole) פתרון siRNA מניה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  10. דגירה 80 μl של 500 מיקרומטר (40 nmole סה"כ) פתרון המניות RVG-9R עם הפתרון siRNA / ליפוזום במשך 10 דקות ב RT. LSPCs אמור לשמש בהקדם האפשרי, אך ניתן להשתמש עד כמה שעות לאחר ההכנה. LSPCs חנות ב 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שעות לאחר ההכנה.

2. הכנת PALETS

  1. השתמש 55: 40: יחס טוחנת -5 או DSPE (1,2-distearoyl-SN-glycero-3-phosphoethanolamine): כולסטרול: DSPE-PEG או DOTAP: כולסטרול: DSPE-PEG עבור PALETS. לקבלת הכנה liposome 4 nmole, לערבב 2.2 nmoles מאחד DSPE או DOTAP, 1.6 nmoles של כולסטרול, ו -0.2 nmoles של DSPE-PEG לתוך 10 מ"ל של 2: פתרון מתנול בבקבוק: כלורופורם 1.
  2. כן השעית liposome בדיוק כמתואר שלב 1.1 ו -1.2 לעיל. רעננותם ליפוזומים DSPE ב 10 מ"ל של 1x PBS מחומם ל 75 מעלות צלזיוס, הוספת 1 מ"ל / דקה. אפשר שומני רעננותם על 75 מעלות צלזיוס למשך1 לפחות שעה לפני אומדת.
  3. גודל ההשעיה liposome בדיוק כמתואר שלב 1.6-1.8.
  4. Pipet 20 μl של כל אחד 4 nmole (200 מיקרומטר) השעיות liposome לתוך aliquots ליחד לאחר ליפוזומים DOTAP ו DSPE כבר בגודל, ו Lyophilize למשך 30 דקות באמצעות מייבש הקפאה benchtop (איור 2).
  5. דגירה 200 μl של 20 מיקרומטר פתרון siRNA המניה (4 nmole הכל) עם 1.4 μl של סולפט 26.6 מיקרומטר פתרון של protamine במשך 10 דקות ב RT עבור siRNA כי היא להיות במארז לתוך ליפוזומים DSPE PALETS.
  6. רעננותם ליפוזומים DOTAP PALETS עם 200 μl של פתרון המניות 4 nmole של siRNA או רעננותם ליפוזומים DSPE PALETS עם 201.4 μl של פתרון siRNA / protamine. דגירה פתרון liposome / siRNA למשך 10 דקות ב RT.
  7. הוסף 10 μl של hydrochloride carbodiimide 60 מ"מ 1-אתיל-3- (3-dimethylaminopropyl) (EDC) פתרון פתרון liposome / siRNA לשני DOTAP ו DSPE PALETS.
  8. הוסף 10 μl של פתרון 150 מ"מ N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) לפתרון ליפוזום / siRNA לשני DOTAP ו DSPE PALETS.
  9. דגירה EDC ו sulfo-NHS עם ההשעיה siRNA / liposome עבור שעה 2 ב RT.
  10. דגירה 80 μl של 500 מיקרומטר (40 nmole סה"כ) פתרון המניות RVG-9R עם ליפוזום siRNA / crosslinking פתרון במשך 10 דקות ב RT.
    הערה: EDC / sulfo-NHS מאפשר RVG-9R לאיגרת קוולנטית את השומנים PEG. השתמש PALETS בתוך כמה שעות לאחר הכנה. PALETS חנות ב 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שעות לאחר ההכנה.
  11. כדי לקבוע את יעילות אנקפסולציה siRNA של PALETS:
    1. למדוד את הריכוז של siRNA לפני ואחרי התוספת של protamine ו ליפוזומים באמצעות ספקטרופוטומטר להגדיר ב 260 ננומטר.
    2. סנן את siRNA unencapsulated מן ההשעיה siRNA ליפוזום / כמוס באמצעות 50 מסננים צנטריפוגלי kDa. צנטריפוגה XG ב 1000 עבור 20 דקות.
    3. למדוד את הריכוז שלsiRNA unencapsulated ב תסנין ואת הריכוז של siRNA הגלום retentate באמצעות ספקטרופוטומטר ב 260 ננומטר.

3. הזרקת עכברים עם LSPCs או PALETS

  1. לחשוף עכברים למשך 5-10 דקות כדי מנורת חום כדי להרחיב כלי דם.
  2. להרדים עכבר עם חמצן 2-3% isofluorane / לזרום 5-10 דקות לפני ההזרקה, ובמהלך הזריקה. אשר הרדמה כאשר חיים אינם מתנועעים ואת הנשימות האטו על ידי ביצוע קמצוץ בוהן. מניחים את העכבר על גבו או על צידו כדי לגשת וריד הזנב. השתמש במשחת וטרינר על העיניים של העכבר כדי למנוע התייבשות לאחר הרדמה.
  3. נגב / לרסס את הזנב עם 70% EtOH ולהזריק 300 μl של LSPCs או PALETS על וריד הזנב של העכבר באמצעות מזרק אינסולין 26 G. התחל הזרקת distally לווריד הזנב ולעבור proximally אם הווריד מתמוטט או קרעים.
  4. מניחים עכבר בכלוב נקי עד שהוא מקיים שכיבה sternal. אל תניח מולהשתמש עם חבריהם לכלוב אחרים, עד שהיא התאוששה לחלוטין. עכברים צריכים להתאושש 5 עד 15 דקות. הם יכולים להיות ממוקמים על כרית חימום או תחת מנורת חום כדי לשמור על טמפרטורת גוף אם ההתאוששות אורכת זמן רב יותר. צריך להיות במעקב עכברים מקרוב כדי להגן מפני התחממות יתר.
  5. לפקח על מספר שעות חיה לאחר הזרקה על מנת להבטיח הרדמה פגה, ואין השפעות שליליות של הטיפול. אפשר LSPCs או PALETS להפיץ לפחות 24 שעות.

ניתוח 4. ביטוי חלבון באמצעות cytometry הזרימה

  1. להרדים עכברים עם קצב זרימה 20% CO 2 במשך 15 דקות.
  2. לנתח את חצי חצי כדור של המוח על ידי חיתוך משם את עור הגולגולת של העכבר באמצעות מספריים. לקלף חצי חצי כדור של המוח מן הגולגולת באמצעות מלקחיים או סוף זוג מספריים.
  3. חצי לחצו חצי כדור של המוח מפני כל עכבר דרך מסננת תא רשת 40 מיקרומטר באמצעות 2.5 מ"ל של חיץ FACS (1x; PBS, 1% בסרום שור עוברי, 10 EDTA מ"מ) בצלחת פטרי עם הבוכנה של מזרק.
  4. יש לשטוף את מסננת תא צלחת פטרי עם מאגר 2.5 מיליליטר נוסף של FACS. שים את ההשעיה תא בודד בתוך שפופרת חרוטי 15 מ"ל על הקרח.
  5. Pipet 100 μl של ההשעיה תא 5 מ"ל יחיד לתוך צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 350 x ז. מחק את התא גלולה supernatant ו resuspend ב 1 מ"ל של חיץ FACS. ספין ב 350 XG במשך 5 דקות. חזור עם עוד 1 מ"ל של חיץ FACS. שמור על השעיית התא על קרח.
  6. דגירה התאים ב 100 μl של 1: 100 דילול של חיץ 0.5 מ"ג / מ"ל ​​עכברוש אנטי עכבר Fc לחסום FACS 30-60 דקות על הקרח. גלולה לשטוף את התאים כמו בשלב 4.5. שמור על השעיית התא על קרח.
  7. דגירה התאים ב 100 μl של נוגדן פלורסנט 20 מיקרוגרם / מ"ל נגד העכבר PRP C בסרום העכבר 7% חיץ FACS על קרח למשך 30-60 דקות. גלולה לשטוף את התאים כמו בשלב 4.5. שמור את ההשעיה תאעל קרח.
  8. גלולה מחדש להשעות את התאים 1 מ"ל של חיץ תמוגה RBC (PBS 1x, 155 מ"מ NH 4 Cl, 12 מ"מ NaHCO 3, 0.1 EDTA מ"מ) 1 דקות. גלולה כמו בשלב 4.5 ו resuspend התאים 1 מ"ל של חיץ FACS. שמור על השעיית התא על קרח.
  9. לנתח ביטוי PRP C באמצעות cytometer זרימה כפי שתואר לעיל 10. שער לחיות על תאים מפני אוכלוסיית תא כוללת. שער PRP C + תאי אוכלוסיית תא חי לקבוע MFI (עוצמת פלורסנט החציוני).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להגביר את היעילות של אנקפסולציה siRNA בתוך PALETS anionic, את siRNA נמהלה protamine. כדי לקבוע את הריכוז protamine הטוב ביותר עבור siRNA, את siRNA עורבב עם ריכוזים שונים של protamine, מ -1: 1 עד 2: 1 (איור 3 א). היתה יעילות אנקפסולציה 60-65% siRNA ב ליפוזומים anionic ללא שימוש protamine. דוגמאות עם protamine: יחסי טוחנת siRNA מ 1: 1 עד 1.5: 1 (133-266 ננומטר) היה אנקפסולציה siRNA 80-90%. יחסי טוחנת מעל 1.5: 1 הביא ממטרים של מתח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דו"ח זה מתאר פרוטוקול ליצור שתי מערכות אספקת ממוקדות שמעבירה siRNA ביעילות אל מערכת העצבים המרכזית. שיטות קודמות של אספקת siRNA אל מערכת העצבים המרכזיים כללו הזרקת וקטורי siRNA / shRNA ישירות לתוך המוח, הזרקה תוך ורידית של siRNA הממוקד, או הזרקה תוך ורידית של מתחמים ליפוזום-siRNA הלא ממוקדים. הזרקה של וקטורים siRNA / shRNA לתוך מערכת העצבים המרכזית אין לגרום לירידה ברמות ביטוי חלבון המטרה. עם זאת, siRNA / shRNA אינו מפוזר באופן חופשי דרך מערכת העצבים המרכזית. יתר על כן, זריקו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להכיר במקורות המימון הבאים: תוכנית ההכשרה למחקר תרגומי למחלות זיהומיות של CSU (ID:TRTP) ותוכנית מענקי המחקר של ה-NIH (R01 NS075214-01A1). ברצוננו להודות למעבדת Telling על השימוש בנוגדנים החד-שבטיים שלהם PRC5. ברצוננו גם להודות למעבדת דאו על ליפוזומי DOTAP, ועל שיתוף המומחיות שלהם ביצירת ליפוזומים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
DOTAP ליפידיםאוונטי890890
כולסטרולאוונטי ליפידים700000
DSPEאוונטי ליפידים850715
DSPE-PEGאוונטי ליפידים880125
כלורופורםפישר סיינטיפיקAC268320010
מתנולEMD Millipore113351
N2 גזאיירגז
סוכרוזפישר מדעיS5-500
מכבשאוונטי ליפידים610023
1.0, 0.4 ו-0.2 μ m מסנניםAvanti Lipids610010, 610007, 610006
PBSLife Technologies70011-044
פרוטמין סולפטפישר סיינטיפיקICN10275205
EDCThermo Scientific22980מצוטט לשימוש חד פעמי
Sulfo-NHSThermo Scientific24510מצוטט לשימוש חד פעמי
40 & #956; m מסננת תאיםפישר סיינטיפיק08-771-1
חולדה נגד עכבר CD16/CD32 Fc בלוקBD Pharmigen553141
נוגדן נגד PrP (PRC5)קנייני - PRC

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bolton, D. C., Mckinley, M. P., Prusiner, S. B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science. 218 (4579), 1309-1311 (1982).
  2. McKinley, M. P., Bolton, D. C., Pruisner, S. B. A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion. Cell. 35 (1), 57-62 (1983).
  3. Pruisner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
  4. Jeffrey, M., McGovern, G., Sisò, S., González, L. Cellular and sub-cellular pathology of prion diseases: relationship between morphological changes, accumulation of abnormal prion protein and clinical disease. Acta Neuropathologica. 121 (1), 113-134 (2011).
  5. Büeler, H., et al. Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. Cell. 73 (7), 1339-1347 (1993).
  6. Pfeifer, A., et al. Lentivector-mediated RNAi efficiently suppresses prion protein and prolongs survival of scrapie-infected mice. J Clin Invest. 116 (12), 3204-3210 (2006).
  7. White, M., Farmer, M., Mirabile, I., Brandner, S., Collinge, J., Mallucci, G. Single treatment with RNAi against prion protein rescues early neuronal dysfunction and prolongs survival in mice. Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10238-10243 (2008).
  8. Gallozzi, M., et al. Prnp knockdown in transgenic mice using RNA interference. Transgenic Research. 17 (5), 783-791 (2008).
  9. Mallucci, G., et al. Targeting cellular prion protein reverses early cognitive deficits and neurophysiological dysfunction in prion-infected mice. Neuron. 53 (3), 325-335 (2007).
  10. Pulford, B., et al. Liposome-siRNA-peptide complexes cross the blood-brain barrier and significantly decrease PrPC on neuronal cells PrPRes in infected cultures. PLoS One. 5 (6), (2010).
  11. Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M. Cationic liposome-mediated RNA transfection. Proc Natl Acad Sci. 86, 6077-6081 (1989).
  12. Liu, Y., et al. Factors influencing the efficiency of cationic liposome-mediated intravenous gene delivery. Nat Biotechnol. 15, 167-173 (1997).
  13. Freimark, B. D., et al. Cationic lipids enhance cytokine and cell influx levels in the lung following administration of plasmid: cationic lipid complexes. J Immunol. 160 (9), 4580-4586 (1998).
  14. Balzas, D. A., Godbey, W. T. Liposomes for use in gene delivery. J Drug Deliv. , (2011).
  15. Srinivasan, C., Burgess, D. J. Optimization and characterization of anionic lipoplexes for gene delivery. J Control Release. 136 (1), 62-70 (2009).
  16. Lakkaruju, A., Dubinsky, J. M., Low, W. C., Rahman, Y. Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes. J Biol Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).
  17. Tao, Y., Han, J., Dou, H. Brain-targeting gene delivery using a rabies virus glycoprotein peptide modulated hollow liposomes: bio-behavioral study. J Mater Chem. 22, 11808-11815 (2012).
  18. Li, S., Huang, L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes. Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).
  19. Li, S., Rizzo, M. A., Bhattacharya, S., Huang, L. Characterization of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes for intravenous gene delivery. Gene Ther. 5 (7), 930-937 (1998).
  20. Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39-43 (2007).
  21. Voinea, M., Simionescu, M. Designing of 'intelligent' liposomes for efficient delivery of drugs. J Cell Mol Med. 6 (4), 465-474 (2002).
  22. Lakkaraju, A., et al. Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes. J. Biol. Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).
  23. Li, S., Huang, L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes. Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).
  24. Büeler, H., et al. Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein. Nature. 356 (6370), 577-582 (1992).
  25. Dykxhoorn, D., Novina, C., Sharp, P. Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (6), 457-467 (2003).
  26. Graham, A., Ray, M., Perry, E., Jaros, E. Differential nicotinic acetylcholine receptor subunit expression in the human hippocampus. J Chem Neuroanat. 25 (2), 97-113 (2003).
  27. Kretzschmar, H. A., Prusiner, S. B., Stowring, L. E. Scrapie prion proteins are synthesized in neurons. Am J Pathol. 122 (1), 1-5 (1986).
  28. Moser, M., Colello, R., Pott, U., Oesch, B. Developmental expression of the prion protein gene in glial cells. Neuron. 14 (3), 509-517 (1995).
  29. Cronier, S., Laude, H., Peyrin, J. M. Prions can infect primary cultured neurons and astrocytes and promote neuronal cell death. Proc Natl Acad Sci. 101 (33), 12271-12276 (2004).
  30. Diedrich, J., Bendheim, P., Kim, Y. Scrapie-associated prion protein accumulates in astrocytes during scrapie infection. Proc Natl Acad Sci. 88 (2), 375-379 (1991).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

siRNARVG 9rPrP siRNAargeting

מאמרים קשורים