בכתב יד זה מוצגות שיטות חמצון תקופתי וקישור צולב גלוטרלדהיד לקיבוע קוולנטי של נוגדנים על דיסקיות נייר. הוערכה פעילות הקישור של נוגדנים משותקים. בהתבסס על תוצאות אלה, נעשה שימוש בשיטת קישור צולב גלוטראלדהיד לפיתוח בדיקה חיסונית חדשה מבוססת נייר לזיהוי אימונוגלובולין G (IgG).
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
קשר הקוולנטי של נוגדני דיסקי נייר תאיים ואת היישומים שלהם ב Immunoassays מדד-צבע Naked-עין
במאמר זה
סיכום
תקציר
דוח זה מציג שני שיטות הקיבוע קוולנטי של נוגדנים לכידים על כיתת נייר תאי מסנן מס '1 (נייר סינון בינוני זרימה) דיסקים ו כיתת מס' 113 (נייר סינון מהיר זרימה) דיסקים. דיסקי נייר התאיים אלה היו מורכבים עם קבוצות פונקציונליות אמינות באמצעות טכניקת צימוד silane לפני הנוגדנים היו משותקים עליהם. חמצון glutaraldehyde periodate צולב מקשרי שיטות שמשו שתל נוגדנים לכידים על דיסקי נייר התאי. על מנת להבטיח את קיבולת מחייב המקסימלי של הנוגדנים הלכידים לייעדם לאחר קיבוע, את ההשפעות של ריכוזים שונים של נתרן periodate, glutaraldehyde, ונוגדנים ללכוד על פני השטח של דיסקי נייר נחקרו. הנוגדנים שהיו מצופים על דיסקי נייר תאי פונקציונלי האמינים באמצעות סוכן glutaraldehyde cross-linking הראו משופרת פעילות מחייבת את היעד כשמשווה את שיטת חמצון periodate. IgG (בסרום עכבר הפניה) שמש כיעד התייחסות במחקר זה לבחון את היישום של נוגדנים משותקים קוולנטית דרך glutaraldehyde. Assay immunosorbent חדש המבוסס על נייר, enzyme-linked (ELISA) פותח בהצלחה ומאומת לצורך זיהוי של IgG. שיטה זו אינה דורשת ציוד, והוא יכול לזהות 100 ng / ml של IgG. העיתון מסנן במהירות הזרימה היה יותר רגיש מאשר נייר הסינון הבינוני-זרימה. תקופת הדגירה של assay זה היה קצר נדרש כרכים מדגם קטן. בעין בלתי מזוינת זה, ניתן להאריך immunoassay colorimetric לזהות מטרות אחרות המזוהות עם קונבנציונאלי ELISA.
מבוא
הבדיקות בנקודת הטיפול (POCT) מחקר אבחון חשוב לפיתוח אסטרטגיות חדשות עבור תרופות, רפואה אישית, ואת הטיפול הביתי 1. ניירות תאיות נמצאות בשימוש נרחב כמו פלטפורמות ב immunoassays, כפי שהם זולים, נגישים, ומוכר למשתמשים 2. בנוסף, המבנה הנקבובי של נייר תאי בעל הכח לנהוג זרימת נוזל ללא השפעת אנרגיה נוספת. רשום של bioanalysis מבוסס נייר ניתן למצוא מוקדם ככל המאה ה -20, כאשר כרומטוגרפיה נייר הומצא ראשון בשנת 1952. הדוגמא הנפוצה ביותר היא בדיקות immunochromatographic 3, כגון רצועות בדיקת הריון וסוכרת. בדיקות אלה מספקים פעמי assay מהירות יחסית וניתוח זול 4. בשל הפשטות שלהם, בדיקות רצוע....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. קבוצות הארכת אמינים פונקציונליות על דיסקי נייר תאיים
- הכן פיסת נייר מרובע עם מימד של 1 ס"מ × 1 ס"מ, 100 דיסקים נייר עשויים מנייר תאית כיתה מס '1 בקוטר של 6.0 מ"מ (נייר סינון בינוני זרימה) באמצעות אגרוף חור.
- לגזור -NH 2 קבוצות על דיסקים נייר, לערבב 1 APS מ"ל ו -10 מ"ל אצטון בתוך בקבוק זכוכית 50 מ"ל ב למכסה המנוע קטר. להוסיף דיסקים נייר לתערובת מגיב מוכן טרי APS, דגירה במשך 5 שעות עם ערבוב מסלולית (200 סל"ד) בטמפרטורת החדר 32.
זהירות: טפל APS ואצטון למכסת מ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פורה איור 3. להפוך ספקטרום אינפרא אדום (FTIR) נייר מרובע מסנן בינוני זרימת מטופל APS שטופל (א) ונייר כיכר במהירות זרימת המסנן (B). א. הספקטרום עבור נייר מרובע מסנן בינוני זרימת מטופל היה דומה לזה של נייר מרובע מסנן מטופלי APS הבינוני-זרימה. הגידול בעוצמות ב להקות של 902-1,170 ס"מ -1 ו 1,210-1,500 .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ציפוי ישיר של נוגדן ללכוד IgG-Fc אנטי העכבר עז מטוהרת זיקה על דיסקי נייר תאיים ללא שינוי בוצע כדי לזהות ריכוזי IgG. התוצאות הצביעו על כך, קיבעון נוסף של הנוגדנים הלכידים נדרש עבור שחזור. טכניקת silane שמשה בהצלחה להציג קבוצות פונקציונליות אמינות אל הדיסקים התאיים נייר 34. ריכוז APS משפיע על חוסר התנועה של נוגדנים. לפיכך, הסכום של APS אצטון היה מותאם גם. 1 מ"ל של APS 10 מ"ל של אצטון היה ריכוז אופטימלי עבור השתלת קבוצה אמינית עבור קיבוע של נוגדנים באמצעות סוכן c.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה כספית על ידי משרד החינוך בסינגפור באמצעות מענק התרגום והחדשנות (MOE2012-TIF-2-G-009).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| נייר סינון תאית, דרגה 1 (נייר סינון בזרימה בינונית) | GE Healthcare Pte Ltd סינגפור | 1001 110 | |
| נייר סינון תאית, דרגה 113 (נייר סינון זרימה מהירה) | סיגמא-אולדריץ', סינגפור | 1113-320 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, סינגפור | G6257 | דרגה II, 25% ב-H2O |
| פעילי שטח | Tween-20, Sigma-Aldrich, סינגפור | P2287 | |
| אלבום סרום בקר | סיגמא-אולדריץ', סינגפור | A2153 | |
| אבקת חלב דל שומן | לואי פרנץ'דיל; OIS | ארוז על ידי Kitchen Capers, סינגפור | |
| Tris base | Promega | H5135 | |
| נתרן פריודאט | Merck | 106597 | |
| Na2HPO4 | Merck | 106585 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | |
| NaCl | CALBIOCHEM | ||
| NaOH | Merck | 106462 | |
| HCl | Merck | 100317 | |
| תמיסת מלח פוספט בופר (PBS) | N/A | N/A | PBS, מכיל 137 mmol/L NaCl, 2.7 מול/ליטר KCl, 8.0 mmol/ L Na2HPO4 ו-1.5 mmol/L KH2PO4, מוכן עם מים ומותאם ל-pH 7.4 עם 0.1 mol/L NaOH או 0.1 mol/L HCl |
| אצטון טי האי Chem Pte בע"מ סינגפור | 9005-68 | ||
| תערובת של TMB ותמיסת מי חמצן | פתרון אולטרה TMB-ELISA 1 שלב, Thermo Scientific Pierce | 34029 | 1 ליטר |
| ארנב אנטי אנושי IgG-FITC | TWC/BIO Pte Ltd סינגפור | sc-2278 | |
| פרוקסידאז מצומד עז אנטי-ארנב IgG | TWC/Bio Pte Ltd סינגפור | sc-2030 | |
| זיקה מטוהרת עז נגד עכבר IgG-Fc ציפוי נוגדן | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131A | |
| התייחסות לעכבר סרום | Bethyl Laboratories, Inc | RS10-101-5 | 9.5 מ"ג/מ"ל |
| HRP מצומד עז נגד עכבר IgG-Fc זיהוי נוגדן | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131P | |
| <חזק>ציוד | |||
| פורייה טרנספורמציה ספקטרופוטומטר אינפרא אדום | Shimadzu IR Prestige-21 | N/A | |
| צילום מולקולרי פלואורסצנטי | Pharos FXTM בתוספת הדמיה מולקולרית, Bio-Rad, סינגפור | N/A | |
| תנור | NUVE FN500 | N/A | |
| מיקסר טורבו VM-2000 | MYC LTD | N/A | |
| ImageJ | RGB, להורדה חינם | N/A |
מקורות
- Curtis, K. A., Rudolph, D. L., Owen, S. M. Rapid detection of HIV-1 by reverse-transcription, loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). J. Virol. Methods. 151 (2), 264-270 (2008).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Carrilho, E., Thomas, S. W., Sindi, H., Whitesides, G. M.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
