הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מדידת הישרדות שעה

7.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54126

⸱

22 ביולי 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Aquatic Bioscience, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo, 2School of Marine Biosciences, Department of Marine Biosciences, Kitasato University, 3Josephine Bay Paul Center for Comparative Molecular Biology and Evolution, Marine Biological Laboratory, 4School of Arts and Sciences, University of Houston-Victoria

במאמר זה

סיכום

רוטיפרים הם זואופלנקטון מיקרוסקופיים המשמשים כמודלים במחקרים אקוטוקסיקולוגיים והזדקנות. כאן אנו מספקים פרוטוקול למדידה עוצמתית וניתנת לשחזור של זמן ההישרדות ברוטיפרים של ברכיונוס. סנכרון תנאי התרבות לאורך מספר דורות הוא בעל חשיבות מיוחדת מכיוון שמצב האם משפיע על היסטוריית החיים של הצאצאים.

תקציר

הרוטיפרים הם זואופלנקטון קוסמופוליטיים מיקרוסקופיים המשמשים כמודלים במחקרים אקוטוקסיקולוגיים והזדקנות בשל יתרונותיהם הרבים כגון תוחלת חיים קצרה, קלות תרבית ופרתנוגנזה המאפשרת תרבית משובטת. עם זאת, נדרשת זהירות בעת מדידת זמן ההישרדות שלהם מכיוון שהוא מושפע מגיל האם ומתנאי האכלה של האם. כאן אנו מספקים פרוטוקול למדידה רבת עוצמה וניתנת לשחזור של זמן ההישרדות ברוטיפרים של ברכיונוס לאחר סנכרון קפדני של תנאי התרבית לאורך מספר דורות. מבחינה אמפירית, סנכרון לקוי מביא לתמותה מוקדמת ולירידה הדרגתית בשיעור ההישרדות, וכתוצאה מכך כוח סטטיסטי חלש. ואכן, בתנאים כאלה, הגבלת קלוריות (CR) לא הצליחה להאריך משמעותית את תוחלת החיים של B. plicatilis, אם כי אריכות ימים הנגרמת על ידי CR הוכחה עם דגימות רוטיפר מסונכרנות היטב במחקרים בעבר ובהווה. פרוטוקול זה כנראה שימושי עבור מודלים אחרים של חסרי חוליות, כולל זבוב הפירות Drosophila melanogaster והנמטודה Caenorhabditis elegans, מכיוון שדווחו גם השפעות גיל אימהיות במינים אלה.

מבוא

Rotifers הוא זואופלנקטון מיקרוסקופי קוסמופוליטית (<1 מ"מ) המהווה את המערכה Rotifera 1. יש להם תוכנית פשוטה הגוף מורכב כ -1,000 תאים סומטיים כמו גם מנגנון ריסי גלגל דמוי מאפיין שנקרא קורונה, אשר משמש לתנועה והאכלה. רוב rotifers שייכים כיתות Monogononta או Bdelloidea, המכילים כ -1,600 ו -500 מינים, בהתאמה 2. Rotifers Monogonont יש בדרך כלל שני שלבי רבייה מיניים מינית (בשכפול הגנטי מחזורי), בעוד rotifers bdelloid לשכפל בשכפול גנטי 3 חובה. בסך הכול אפשר להשיג אנשי rotifer זהים גנטי, אשר מבטיח שחזור גבוה בניסויים. בנוסף, יש להם כמה יתרונות אחרים כמו אורגניזמים מודל, כגון תוחלת חיים קצרה, קלות תרבות, זמינות של נתוני רצף גנומי transcriptomic 4-7, ו עמדת פילוגנטי ייחודית רחוקה מנקודהrthropods נמטודות 8. Rotifers ולכן מבטיח מודלים חסרי חוליות ב אקולוגית, טוקסיקולוגית, והזדקנות מחקרים 9-12.

זמן ההישרדות תחת חשיפה ללחץ או כימיקלים סביבתיים הוא פרמטר נמדד לעתים קרובות בתחומי מחקר אלה 13-19. עם זאת, זהירות נדרשת כאשר מודד את זמן ההישרדות של rotifers כי זה רגיש לתנאי סביבה של האמהות שלהם. כלומר, בתוך manjavacas monogonont rotifer Brachionus, צאצא נקבה מאמהות בגילאי יש תוחלת חיים קצרה יותר מאשר אלו של אמהות צעירות; עם זאת, הגבלת קלוריות אימהיות (CR) מקזזת בחלקה את ההשפעות המזיקות של גיל האם מתקדם 20. ב B. plicatilis, אימהית CR מספק לאריכות הצאצאים, זמן ההישרדות הארוך תחת רעב והתנגדות סטרס חמצוני הגבוהות הכרוכות עם ביטוי מוגבר של אנזימים נוגדי חמצון 21,22. השפעת גיל האםגם נצפה rotifers bdelloid 23. לכן, תנאי rotifers ניסיוני צריכים להיות מתואמים היטב במשך כמה דורות לפני המדידות של זמן הישרדות.

כאן אנו מספקים פרוטוקול מדידת זמן הישרדות rotifers Brachionus הבא סנכרון של תנאי תרבות במשך כמה דורות. צום לסירוגין (IF), וריאציה של CR איפה rotifers ניזונים מעת לעת, יושמה כדי לחשוף את השפעת הסנכרון בשל ההשפעות הידועות של IF על אריכות ימים 22,24.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת Media

הערה: השתמש חצי מדולל Brujewicz מי ים מלאכותי של ppt המליחה 16.5 (PSU). Seawaters המלאכותית אחרת גם משמשת לעתים קרובות כדי rotifers תרבות Brachionus 25,26.

  1. להוסיף 454 מ"מ NaCl, 26 מ"מ MgCl 2, 27 mM MgSO 4, 10 מ"מ KCl, ו -10 מ"מ CaCl 2 כדי 4.5 ליטר של מים מזוקקים (נפח סופי יהיה 5 L). לחלופין, להשתמש במי דילול יונים במקום מים מזוקקים. להוסיף CaCl 2 לאחר המסת כל המלחים האחר.
  2. הכן את פתרון 3 מניות 0.48 M NaHCO (ריכוז 200x). הוסף 25 מ"ל של אותו הפתרון לעיל. הריכוז הסופי של NaHCO 3 הוא 2.4 מ"מ.
  3. כן פתרון המניות 0.4 M NaBr (ריכוז 500x). הוסף 10 מ"ל של אותו הפתרון לעיל. הריכוז הסופי של NaBr הוא 0.8 מ"מ. הפוך עד 5 ליטר עם מים מזוקקים.
  4. סנן את הפתרון עם מסנן הממברנה 0.45 מיקרומטר.לדלל אותו פעמיים עם מים סטריליים לפני השימוש (V / V).
    הערה: אפשר להכין ריכוז 2x של מי ים מלאכותי Brujewicz כפתרון מניות.

2. תנאי תרבות כלליות

  1. תרבות הגדלים במעבדה או rotifers בר-שנתפסו בכוס 100 מ"ל סטרילי בין ג '20 ו -30 מעלות. טמפרטורות גבוהות לגרום תוחלת חיים קצרות יותר ורבייה מואצת. השתמש 25 ° C לנוחיות ניסויים. צפיפות rotifer או הנפח של מי ים מלאכותי אינה בעיה גדולה כאן.
  2. מיני תרבות microalgae תזונתיים במי ים מלאכותיים 11. ראה ואח סנל. (2014) לפרטים 11. בדרך כלל, להשתמש Tetraselmis tetrathele (~ 2 x 10 5 תאים / מ"ל 27,28), צ ' suecica (~ 6 x 10 5 תאים / מ"ל 25,29), ו Nannochloropsis oculata (~ 7 x 10 6 תאים / מ"ל 30,31). מאז אצות דיאטה (מינים, קונדיט תרבותיונים, קומפוזיציות ביוכימי) משפיע זמן ההישרדות משמעותית של rotifers Brachionus, להשתמש באותו הרבה microalga בכל קבוצות הניסוי.
  3. שמור אוכלוסיית מניות של rotifers בתרבות תצווה על ידי האכלה והשינוי בתקשורת מדי פעם (למשל, להאכיל כל 2 ימים לחסן כל שבוע). רבים ילודים ומבוגרים נושאות 2-3 ביצים ניתן להבחין כאשר rotifers הם בתנאים אופטימליים.
    הערה: דרך חלופית להשיג rotifers ניסיוני היא לבקוע ביצים נחות. Rotifers בקע מן הביצים נחות נחשב להיות מסונכרנים היטב, ואת תוחלת החיים שלהם אינה שונה באופן מהותי מזו של rotifers בקע מן הביצים amictic 11. עם זאת, rotifers מביצים נח להתחיל רבייה מוקדם יותר מאלו מביצים amictic. לכן, זהירות נדרשת למדידות של תכונות הרבייה שלהם.

סנכרון 3. rotifers ידי תרבות קדם

  1. בחר rotifer אחת מן stאוכלוסייה ותרבות Ock כמתוארת 2.1-2.3 להקים אוכלוסיית משנה אשר תשמש עבור ניסויים. בדרך כלל התרבות במשך שבועיים.
  2. אסוף rotifers נושאות הביצית מן האוכלוסייה משנה (לאסוף מספר כפול של אנשים אשר ישמשו לצורך הניסוי). תרבות בם עוקבה יחידה (צפיפות: ~ 50 אנשים / מיליליטר) בצלחת תרבות 6 היטב כמתואר 2.1-2.3 בתוך תקשורת טריה תחת האכלה כרצונך. שליטת צפיפות אוכלוסייה חשובה כי המדיום המותנה משפיע פיזיולוגית רבייה של rotifers Brachionus 32,33.
  3. עבר בילודים בקעו מן הביצים הראשונות של המבוגרים למדיה ותרבות מוכנים חדש. חזור על הליך זה על פני 2-3 דורות.
  4. השתמש בילודים בקעו בתוך פרק זמן מסוים (למשל, <3 שעות) למדידת זמן ההישרדות. כדי למנוע הטיות אפשריות בבחירת האדם היחיד, אם כי מאוד לא סביר, לבדוק שחזור באמצעות מספר indeתת-אוכלוסיות משתלשלות.
    הערה: כפי rotifers בדרך כלל לשחזר רק asexually תחת תנאי זה, להבטיח ללא זכרים נוכחים לאורך כל הניסוי. הזכרים קטנים יותר בילודים ובדרך כלל לנוע מהר יותר מאשר נקבות. לנקבות יש Mictic: אורך חיים שונים נקבות amictic בתנאים מסוימים 29.

4. מדידות של הישרדות זמן

  1. בילודים מקום בצלחות פלסטיק (בדרך כלל 24 או צלחות 48-היטב, עם כל 1 מ"ל המכיל גם של מי ים מלאכותיים).
  2. בגיל 24 מרווחי hr, להעביר את rotifers למדיה ותרבות המוכנות חדש או ב 12 מרווחי hr אם בטמפרטורה גבוהה (30 ° C ומעלה). רשום את מספר הצאצאים והאם כל אדם חי או מת. רשום את rotifer כמת כאשר תנועת ריסים של העטרה הפסיקה לחלוטין.
    הערה: rotifers לעתים קרובות לצרף הקירות הצדדיים של בארות. pipetting העדין של המים מסייע למצוא אותם. אם rotifers לא נמצא או arדואר ניזוק באופן מקרי על ידי pipetting, להקליט אותם, כמו "צנזורה", לא כמו "מת".
  3. סור בילודים כאשר rotifers הניסיון להתרבות באופן פעיל. ילודים לצמוח במהירות וזה לפעמים קשה להבדיל ביניהם לבין rotifers הניסיון.

ניתוח 5. נתונים

  1. צור את עקומת ההישרדות קפלן-מאייר (איורים 1 ו -2) על ידי התוויית שיעור ההישרדות המצטברת על ציר Y וזמן על ציר X. זהו הייצוג הנפוץ ביותר של נתוני הישרדות. השתמש בבדיקת הלא פרמטרית log-rank (נקרא גם מבחן מנטל-קוקס) עבור השוואה סטטיסטית של זמן ההישרדות 34. מבחן log-rank כלול גם חבילות סטטיסטיות מקובלות אחרות כגון JMP ור '
    הערה: אל תשתמש מבחן t או הניתוח של סטודנטים שונים (ANOVA) ואחריו השוואה מרובה פרמטרית כי התפלגות נורמלית בדרך כלל לא פגשה נתוני הישרדות 35. כמו כן, אלה methods לא לוקח אנשים מצונזרים בחשבון. מאן-ויטני U הבדיקה יכולה לשמש אם אין נתונים מצונזרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות


איור 1 מציג עקומות הישרדות נציג של אוכלוסיות מסונכרנות היטב (מתוך שני משכפל). בניסוי זה, rotifers היו או היומיום הפד [כרצונך (AL) הקבוצה] או בכל יום אחר (IF קבוצה). חציון ההישרדות עמד על 13 ו -18 ימים באזור אל ואם קבוצות, בהתאמה. למרות זאת ידוע היטב שאם מרחיב את תוחלת החיים של rotifer, הניסוי הזה נכשל לזהות הבדל מובהק סטטיסטית בין תוחלת החיים של AL ואם קבוצות. מבחינה אמפירית, תוצאות סנכרון מספיק תמותה מוקדמת וירידות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה למדידת זמן ההישרדות rotifers Brachionus. השלב הקריטי הוא סנכרון תנאי rotifer במשך כמה דורות. כאשר rotifers ניסיוני מסונכרנים היטב, עקומת ההישרדות לי סוג טיפוסי הוא ציין עם תמותה מוקדמת מעט מאוד כפי שדווח בכמה מחקרים קודמים 18,24,37,38. סטיות התקן של זמן ההישרדות שלהם ולכן נעשים קטנות יותר לעומת rotifers המסונכרן היטב, וכתוצאה מכך הכח סטטיסטי גבוה. סנכרון צפוי גם להגדיל שחזור של מדידות זמן הישרדות - כי אמהות מתורבתות בתנאים אופטימליים,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים ג'ורג ג'רוויס, מרתה בוק, ובט היקוקס-לאה, במעבדה לביולוגיה ימית, על עזרתם הצילומים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נתרן כלוריWako190-13921
מגנזיום כלורידWako136-03995
מגנזיום גופרתיWako131-00427
אשלגן כלוריWako168-22111
סידן כלוריWako035-00455
נתרן ביקרבונטWako199-05985
נתרן ברומידWako190-01515
מסנן ממברנה (0.45 ומיקרו; m גודל נקבוביות)HAWP04700Millipore
, 6 בארות, לא מטופלתתומס סיינטיפיק6902D01תחתונה
שטוחה, 48 בארות, לא מטופלתתומאס סיינטיפיק6902D07תחתית שטוחה
Tetraselmis, חברתאספקה ביולוגית של קרוליינה152610
PRISM 6תוכנת GraphPadגרסה 6.0d
צלחת תרבית צלחת תרבית חיה

מקורות

  1. Wallace, R. L., Snell, T. W., Ricci, C., Nogrady, T. Rotifera Vol.1: Biology, ecology and systematics. , 2nd edn, SPB Academic Publishing. (2006).
  2. Segers, H. Annotated checklist of the rotifers (Phylum Rotifera), with notes on nomenclature, taxonomy and distribution. , Magnolia Press. Auckland. (2007).
  3. Mark Welch, D. B., Meselson, M. Evidence for the evolution of bdelloid rotifers without sexual reproduction or genetic exchange. Science. 288 (5469), 1211-1215 (2000).
  4. Suga, K., Mark Welch, D., Tanaka, Y., Sakakura, Y., Hagiwara, A. Analysis of expressed sequence tags of the cyclically parthenogenetic rotifer Brachionus plicatilis. PLoS ONE. 2, e671(2007).
  5. Denekamp, N. Y., et al. Discovering genes associated with dormancy in the monogonont rotifer Brachionus plicatilis. BMC Genomics. 10, 108(2009).
  6. Lee, J. -S., et al. Sequence analysis of genomic DNA (680 Mb) by GS-FLX-Titanium sequencer in the monogonont rotifer, Brachionus ibericus. Hydrobiologia. 662 (1), 65-75 (2010).
  7. Flot, J. -F., et al. Genomic evidence for ameiotic evolution in the bdelloid rotifer Adineta vaga. Nature. 500 (7463), 453-457 (2013).
  8. Dunn, C. W., et al. Broad phylogenomic sampling improves resolution of the animal tree of life. Nature. 452 (7188), 745-749 (2008).
  9. Yoshinaga, T., Kaneko, G., Kinoshita, S., Tsukamoto, K., Watabe, S. The molecular mechanisms of life history alterations in a rotifer: a novel approach in population dynamics. Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol. 136 (4), 715-722 (2003).
  10. Dahms, H. -U., Hagiwara, A., Lee, J. -S. Ecotoxicology, ecophysiology, and mechanistic studies with rotifers. Aquat. Toxicol. 101 (1), 1-12 (2011).
  11. Snell, T. W. Rotifers as models for the biology of aging. Int. Rev. Hydrobiol. 99 (1-2), 84-95 (2014).
  12. Snell, T. W., Johnston, R. K., Gribble, K. E., Mark Welch, D. B. Rotifers as experimental tools for investigating aging. Invertebr. Reprod. Dev. 59, Suppl 1. 5-10 (2015).
  13. Kaneko, G., et al. Molecular characterization of Mn-superoxide dismutase and gene expression studies in dietary restricted Brachionus plicatilis rotifers. Hydrobiologia. 546, 117-123 (2005).
  14. Yoshinaga, T., et al. Insulin-like growth factor signaling pathway involved in regulating longevity of rotifers. Hydrobiologia. 546, 347-352 (2005).
  15. Ozaki, Y., Kaneko, G., Yanagawa, Y., Watabe, S. Calorie restriction in the rotifer Brachionus plicatilis enhances hypoxia tolerance in association with the increased mRNA levels of glycolytic enzymes. Hydrobiologia. 649 (1), 267-277 (2010).
  16. Kailasam, M., et al. Effects of calorie restriction on the expression of manganese superoxide dismutase and catalase under oxidative stress conditions in the rotifer Brachionus plicatilis. Fish. Sci. 77 (3), 403-409 (2011).
  17. Garcìa-Garcìa, G., Sarma, S., Núñez-Orti, A. R., Nandini, S. Effects of the mixture of two endocrine disruptors (ethinylestradiol and levonorgestrel) on selected ecological endpoints of Anuraeopsis fissa and Brachionus calyciflorus (Rotifera). Int. Rev. Hydrobiol. 99 (1-2), 166-172 (2014).
  18. Yang, J., Mu, Y., Dong, S., Jiang, Q., Yang, J. Changes in the expression of four heat shock proteins during the aging process in Brachionus calyciflorus (rotifera). Cell Stress Chaperones. 19 (1), 33-52 (2014).
  19. Han, J., et al. Sublethal gamma irradiation affects reproductive impairment and elevates antioxidant enzyme and DNA repair activities in the monogonont rotifer Brachionus koreanus. Aquat. Toxicol. 155, 101-109 (2014).
  20. Gribble, K. E., Jarvis, G., Bock, M., Mark Welch, D. B. Maternal caloric restriction partially rescues the deleterious effects of advanced maternal age on offspring. Aging Cell. 13 (4), 623-630 (2014).
  21. Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. Effect of periodical starvation on the survival of offspring in the rotifer Brachionus plicatilis. Fish. Sci. 67 (2), 373-374 (2001).
  22. Kaneko, G., et al. Calorie restriction-induced maternal longevity is transmitted to their daughters in a rotifer. Funct. Ecol. 25 (1), 209-216 (2011).
  23. Lansing, A. I. A transmissible, cumulative, and reversible factor in aging. J. Gerontol. 2 (3), 228-239 (1947).
  24. Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. Effect of periodical starvation on the life history of Brachionus plicatilis O. F. Müller (Rotifera): a possible strategy for population stability. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 253 (2), 253-260 (2000).
  25. Gribble, K. E., Kaido, O., Jarvis, G., Mark Welch, D. B. Patterns of intraspecific variability in the response to caloric restriction. Exp. Gerontol. 51, 28-37 (2014).
  26. Snell, T. W., Johnston, R. K. Glycerol extends lifespan of Brachionus manjavacas (Rotifera) and protects against stressors. Exp. Gerontol. 57, 47-56 (2014).
  27. Kim, H. -J., Hagiwara, A. Effect of female aging on the morphology and hatchability of resting eggs in the rotifer Brachionus plicatilis Müller. Hydrobiologia. 662 (1), 107-111 (2011).
  28. Kim, H. -J., et al. Light-dependent transcriptional events during resting egg hatching of the rotifer Brachionus manjavacas. Mar. Genomics. 20, 25-31 (2015).
  29. Gribble, K. E., Welch, D. B. M. Life-span extension by caloric restriction is determined by type and level of food reduction and by reproductive mode in Brachionus manjavacas (Rotifera). J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 68 (4), 349-358 (2013).
  30. Kaneko, G., Kinoshita, S., Yoshinaga, T., Tsukamoto, K., Watabe, S. Changes in expression patterns of stress protein genes during population growth of the rotifer Brachionus plicatilis. Fish. Sci. 68 (6), 1317-1323 (2002).
  31. Kim, H. J., Sawada, C., Hagiwara, A. Behavior and reproduction of the rotifer Brachionus plicatilis species complex under different light wavelengths and intensities. Int. Rev. Hydrobiol. 99 (1-2), 151-156 (2014).
  32. Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. Effect of conditioned media on the asexual reproduction of the monogonont rotifer Brachionus plicatilis O. F. Müller. Hydrobiologia. 412, 103-110 (1999).
  33. Ohmori, F., Kaneko, G., Saito, T., Watabe, S. A novel growth-promoting protein in the conditioned media from the rotifer Brachionus plicatilis at an early exponential growth phase. Hydrobiologia. 667 (1), 101-117 (2011).
  34. GraphPad Statistics Guide. , Available from: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/statistics/ (2015).
  35. Collet, D. Modelling Survival Data in Medical Research. , 2nd edn, Chapman & Hall/CRC. 151-193 (1993).
  36. Bouliotis, G., Billingham, L. Crossing survival curves: alternatives to the log-rank test. Trials. 12, Suppl 1. A137(2011).
  37. Yang, J., et al. Changes in expression of manganese superoxide dismutase, copper and zinc superoxide dismutase and catalase in Brachionus calyciflorus during the aging process. PloS ONE. 8 (2), e57186(2013).
  38. Snell, T. W., Johnston, R. K., Rabeneck, B., Zipperer, C., Teat, S. Joint inhibition of TOR and JNK pathways interacts to extend the lifespan of Brachionus manjavacas (Rotifera). Exp. Gerontol. 52, 55-69 (2014).
  39. Klass, M. R. Aging in nematode Caenorhabditis-elegans - major biological and environmental-factors influencing life-span. Mech. Ageing Dev. 6 (6), 413-429 (1977).
  40. Priest, N. K., Mackowiak, B., Promislow, D. E. L. The role of parental age effects on the evolution of aging. Evolution. 56 (5), 927-935 (2002).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Brachionus plicatilis
מדידת הישרדות שעה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.