מאמר שיטה

משטר phenotyping עבור עכברים מהונדסים גנטית בשימוש ללמוד גנים מעורבים מחלות אנושיות של הזדקנות

DOI:

10.3791/54136

⸱

14 ביולי 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Environmental Health Sciences, Yale University School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, Yale University School of Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוצגת גישה של גנטיקה הפוכה להבנת משפחות גנים הקשורות למחלות אנושיות, תוך שימוש בעכבר כמערכת מודל, ומתוארת לוח הזמנים של הפנוטיפ של העכברים שלאחר מכן. מכיוון שעכברים פגומים בגן מעניין, HtrA2, הפגינו תסמינים פרקינסוניים, משטר הפנוטיפ מתמקד בזיהוי פגמים נוירולוגיים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלות הקשורות לגיל הופכות נפוצות יותר ויותר והנטל ממשיך לגדול ככל שהאוכלוסייה שלנו מזדקנת. טיפולים יעילים נחוצים כדי להפחית את ההשפעה של מצבים מתישים אך נשארים חמקמקים במקרים רבים. רק על ידי הבנת הגורמים והפתולוגיה של מחלות הקשורות להזדקנות, מדענים יכולים להתחיל לזהות מטרות טיפוליות פוטנציאליות ולפתח אסטרטגיות התערבות. המצבים השכיחים ביותר הקשורים לגיל הם הפרעות ניווניות כמו מחלת פרקינסון ועיוורון. ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD) הוא הגורם המוביל לעיוורון בקרב קשישים. מחקרי אסוציאציות רחבות גנום זיהו בעבר מיקומים הקשורים לרגישות מוגברת למחלה זו וזיהו שני אזורים מעניינים: גורם משלים H (CFH) ולוקוס 10q26, שבו נמצאים הגנים רגישות מקולופתיה 2 (ARMS2) וגורם דרישת טמפרטורה גבוהה A1 (HtrA1). CFH פועל כמווסת שלילי של המסלול החלופי (AP) של מערכת המשלים, בעוד ש-HtrA1 הוא סרין פרוטאז חוץ-תאי. ARMS2 ממוקם במעלה הזרם של HtrA1 בגנום הפרימטים, אם כי הגן נעדר בעכברים. כדי לחקור את ההשפעות של גנים אלה, נוצרו קווי עכבר אנושיים של Cfh ו-ARMS2, נוקאאוט של Cfh, HtrA1, HtrA2, HtrA3 ו-HtrA4 וכן מחיקה עצבית מותנית של HtrA2. מבין כל העכברים המהונדסים גנטית, רק עכברים חסרי HtrA2, בין אם מערכתית או ברקמות עצביות, הראו פנוטיפים ברורים. על מנת לבחון את העכברים הללו באופן יסודי ושיטתי, נקבע לוח זמנים ראשוני לפנוטיפ, המורכב מסדרת בדיקות הקשורות לשתי מחלות עיקריות מעניינות: AMD ופרקינסון. עכברים מהונדסים גנטית יכולים להיות נתונים לניסויים מתאימים כדי לזהות פנוטיפים שעשויים להיות קשורים למחלות הקשורות בבני אדם. משטר פנוטיפ עם מיקוד מיטוכונדריאלי מוצג כאן לצד תוצאות מייצגות מהבדיקות המעניינות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גיל הקשורים במחלות הופכות נפוצות יותר ויותר בחברה מודרנית. ככל שמדע הרפואה משפר שתוחלת החיים, האוכלוסייה ממשיכה גיל והנטל של מחלות אלה גדל. טיפולים יעילים נחוצים כדי להפחית את ההשפעה של תנאים מתישים אבל להישאר חמקמקים במקרים רבים. רק על ידי הבנת הגורמים ופתולוגיה של מחלות הקשורות להזדקנות מדענים יכולים להתחיל לזהות מטרות טיפוליות פוטנציאל ולפתח אסטרטגיות להתערבות. מצבים שכיחים כתוצאה מהזדקנות כוללים הפרעות ניווניות כגון מחלת פרקינסון (PD) וניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD). PD הוא הפרעת תנועה הנפוצה ביותר הנגרמת על ידי ניוון מוחיה בבני אדם. רוב חולי פרקינסון להראות תסמינים כגון נח רעד, bradykinesia ונוקשות אחרי 50 שנים של גיל. התחלה מוקדמת גם נצפתה כ -10% מהמקרים.

AMD הוא הגורם המוביל לעיוורוןקולטני האור קשישים, נזק בהדרגה אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) בעיניים. הראייה המרכזית נפגעת אבל חזון הפריפריה היא בדרך כלל לא מעושה. ישנן שתי צורות של AMD. בטופס "יבש", פיקדונות חלבון תאי המכונה טופס דרוזן בין הרשתית ואת הממברנה של ברוך (BM), מה שמוביל אטרופיה גיאוגרפית וטשטוש ראייה מרכזית. החמור יותר "רטוב" תוצאות טופס מ נאווסקולריזציה מן דמית פני BM לתוך שכבות הרשתית ואת קולטי האור ויכול להוביל hamorrhaging מתחת הרשתית הגורמת נזק בלתי הפיך רקמת הרשתית. הגנום במחקרי קשר רחב זיהו בעבר לוקוסים המשויכים רגישות מוגברת למחלות הזה, והתייחס לשני אזורים של עניין: H גורם המשלים (CFH) על כרומוזום 1 ואת מוקד 10q26, שבו הרגישות Maculopathy הקשורות לגיל 2 (ARMS2) ו A1 גורם הדרישה בטמפרטורה גבוהה (HtrA1) הגנים ממוקמים 1-5 . שילובים של אללים אלה מעלים את סבירות AMD באופן מינון תלוי SNPs הספציפי ניתן לשייך מעדיף עם או הצורות הרטובות או יבשות של AMD 3-6.

CFH פועלת כרגולטור שלילי של הנתיב החלופי (AP) של המערכה המשלים על ידי עיכוב ההפעלה של C3. פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד (SNP) נקשר לסיכון מוגבר AMD, גרימת חילופי טירוזין 402 אקסון 9 עם היסטידין עקב T ל- C החלפה 1. ב AMD הוא האמין כי AP הוא misregulated בגלל אובדן התפקוד של CFH אבל אם SNP ממלא תפקיד סיבתי ברור. אחת ההשערות היא כי היסטידין בעלי מטען חשמלי חיובי הוא חשב לשלול את היכולת של CFH להיקשר אינטראקציה חלבונים C-reactive 1,7 חלבון הפרין סולפט. במחקרים במבחנה של CFH Y402H לספק תוצאות סותרות על ההבדלים הפונקציונליים בין גרסאות, וב vivo עבודה CFH - / - בעכברים המבטאים CFH אנושי הוא 8 מתמשך. ARMS2 ממוקם במעלה הזרם של HtrA1 בגנום הפרימטים, למרות הגן התאור בעכברים. HtrA1 הוא פרוטאז סרין אבל ARMS2 מאופיין גרוע. לחוסר-היציבות ההצמדה בין SNPs שעבר על המקורות הקשורים AMD עשו את זה קשה לקבוע את התרומה לסיכון של מוטציות בודדות של הגנים באזור זה, אולם מחקר חדש הציע שזה ביטוי יתר של HtrA1 ולא ARMS2 שמוביל נאווסקולריזציה ו פיקדונות חלבון subretinal 9-11. עם זאת, קרבתה של גני מוקד זה עשויה לאפשר אינטראקציות כי לא ניתן ללמוד באמצעות transgenes מוכנס באופן אקראי.

בנוסף AMD, משפחת HtrA של סרין פרוטאז נקשרה עם מחלות אנושיות רבות. כל חלבוני HtrA להכיל דומיין פרוטאז סרין ואחריו לפחות תחום אחד PDZ C- מסוף. HtrA1, HtrA3 ו HtrA4 חולקים את גרהומולוגיה eatest, המורכב פפטיד האות, גורם גדילה דמוי אינסולין תחום מחייב, תחום מעכב פרוטאז Kazal, התחום פרוטאז סרין ואת תחום PDZ. יש HtrA2 חנקן הסופית- שונה, מורכב תחום רצף לוקליזציה המיטוכונדריה, הטרנסממברני מעכב של תחום מחייב אפופטוזיס ואחריו תחומי פרוטאז ו PDZ 12-16. HtrA1 היונק מוסדר על ידי שיפוץ הנגרמת מצע האתר הפעיל של תחום פרוטאז שלה 17-20, ו HtrA2 יכול גם להיות מווסת על ידי אינטראקציה בין פרוטאז סרין ותחומי PDZ מדכא פעילות הפרוטאז 21. מעניין לציין, כי תחום PDZ אינו מופיע להעניק רגולציה דומה HtrA3 16. פרוטאזות HtrA ניתן לווסת גם על ידי גורמים חיצוניים: זה הודגם לאחרונה כי קיימת אינטראקציה בין הרגולציה HtrA1 ו protoporphyrins 22 ו HtrA2 יכול להיות מוסדר על ידי זרחון באקטיבציה של קינאז MAP p38מסלול באופן PINK1 תלוי 23. המחיקות של חברים בודדים של משפחת HtrA בעכברים תועד, אולם תופעות מכניסטית בעיקר אינם ברורים בין היתר בשל חוסר פנוטיפים גלוי.

HtrA1 ממלא תפקיד חשוב בבקרת איכות חלבון ויסות לא תקין או מוטציה שלו נמצא קשור למחלות רבות אנושיים שונים כולל דלקת פרקים, סרטן וסיכון מוגבר של AMD 3,4,24-32. אובדן תפקוד HtrA2 ברקמות עצביות נקשר עם פנוטיפים PD בבני אדם ועכברים, בעוד ההפסד שלה מתוצאות רקמות שאינן עצביות ההזדקנות מואצת 33-37. Dysregulation HtrA3 נקשרה עם מחלות כולל רעלת הריון וסוגים מסוימים של סרטן 38,39. Up-רגולציה של HtrA4 נצפתה השליות של חולי רעלת הריון אבל עכברי בנוקאאוט אינו מציגה פנוטיפ גלוי 40,41. חוסר פנוטיפים שנצפה כמה עכברים בנוקאאוט כברהניחו להיות תוצאה של פיצוי בין בן משפחה HtrA: הוא חשב כי הן HtrA4 ו HtrA1 אינטראקציה עם משפחת TGF-B של חלבונים, המאפשר פיצוי ידי HtrA1 על מחיקת HtrA4 41. בדומה לכך, הוא חשב כי מאז HtrA1 ו HtrA3 יש רמה גבוהה של homologies תחום שיצטרכו פונקציות משלימות 42. עם זאת, הוצע כי חלבוני HtrA ייתכן תפקידים אנטגוניסטית חלקית, מתחרים להסדיר מטרות משותפות 43.

כדי להמשיך לחקור סיכון אלו שלושה גורמי קווי עכבר נוק-ב מואנשים נוצרו. בשנת CFH TM1 (CFH * 9) jhoh ו CFH TM2 (CFH * 9) jhoh, אקסון 9 של הגן CFH מוחלף אקסון 9 של homologue האדם. CFH TM1 (CFH * 9) jhoh המקודד את טירוזין הקשורים שאינם המחלה שאריות במיקום 402, ואילו CFH TM2 (CFH * 9) jhoh נושא את Y402H, SNP הקשורים בסיכון. בARMS2 tm1jhoh רצף ARMS2 אדם היה ממוקד לאזור במעלה הזרם של HtrA1. רצף STOP-ולצדו loxP להציב במעלה זרם של רצף הגן אבל במורד הזרם של אמרגן UbiC הכלול היה נכרת על ידי חצייה לעכברי OzCre, מבטאי Cre recombinase תחת השליטה של אמרגן Rosa26, כפי שתוארו לעיל 34. נוסף על אלה עקום בתורים, אללים בנוקאאוט מותנה עבור CFH ו HtrA1 (CFH tm1jhoh ו tm1jhoh HtrA1), כמו גם את בני המשפחה HtrA ידועים אחרים נוצרו: HtrA2 (HtrA2 tm1jhoh), HtrA3 (tm1jhoh HtrA3) ו HtrA4 ( HtrA4 tm1jhoh). Knockouts ניבט אונליין נוצר על ידי חציית עכברי OzCre לבעלי החיים המהונדסים כדי לאגף אקסונים ספציפית עם אתרי loxP, כך מחיקה גורמת לשינוי מסגרת ו / או מחיקה של התחום הפעיל (CFH; אקסון 3, HtrA1; אקסונים 2-3, HtrA2: אקסונים 2-4, HtrA3; אקסון 3, HtrA4; אקסונים 4-6) 34,41. מחיקה עצבית של HtrA2, שנמחקה באמצעות Cre recombinase תחת השליטה של אמרגן Nestin (HtrA2 flox; Tg (נוס-cre) 1Kln / J), אף תואר 34. עכברים רק חסרי HtrA2, או מערכתי או ברקמות עצביות, מוצגים פנוטיפים ברורים, עם הצגת פנוטיפים פרקינסון.

מכיוון שחלק מהגנים הללו אינטרסים הניחו להיות מקומי כדי המיטוכונדריה 11,44-47, ומחיקה של HtrA2 שנוצר פנוטיפים פרקינסון, משטר phenotyping עם דגש המיטוכונדריה ונוירולוגיות מתואר כאן לתוצאות נציג בדיקות עניין מסופקים . על מנת לבחון עכברים מהונדסים גנטי מיוצרים לחקור אדם, מחלות הקשורות לגיל ביסודיות ואת לוח זמני phenotyping ראשוני שיטתי הוקם, מורכב מסדרה של בדיקות קשורות השני הראשימחלות של עניין: AMD ופרקינסון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אתיקה הצהרה: מחקרים שכללו חיות נערכו בהתאם המכונים הלאומיים המלצות הבריאות מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) באוניברסיטת ייל.

בדיקות התנהגותיות 1. של עכברים מהונדסים גנטית

הערה: כל העכברים צריכים להיות כפופים לאותה משטר הבדיקות להגביל הבדלי התרגלות טיפול. בדיקות יש לבצע בו זמנית של יום בכל פעם.

  1. Neonatal הינד לימב מבחן
    הערה: מבחן הגפיים האחורי מתנהל יומי מיום הלידה (P) 4 עד P10 להעריך את כוח שרירי גפיים האחוריים הפרוקסימלי, חולשה ועייפות.
    1. עכברי תחבורה לאזור בדיקות ולאפשר לנוח למשך 30 דקות לפני הבדיקה.
    2. הכן מנגנון בדיקה על ידי ניקוי צינור חרוטי 50 מ"ל עם 70% אתנול, דוחפת שני (P4-P8) או אחד (P10-P9) כדורי צמר גפן לתחתית של tUbe ואבטחת במצב אנכי.
    3. הסר גור אחד מן המשקל כלוב ולהקליט. שמור גור להחזיק מגש על משטח חום בכל פעם לא בודק.
    4. בעדינות להשעות את הגפיים האחוריים של הילוד מעל השולי של צינור החרוטים, כך הוא פונה כלפי מטה לעבר כדורי צמר גפן. ספירת ניסיונות למשוך עשה חביון מידה ליפול באמצעות סטופר.
    5. חזור פעם נוספת עליו מדבקה את הגור בטוש. לאחר מכן, לזהות גורים P6 ידי גזיר הבוהן. לשפשף בעדינות את גורים עם מצעים מכלוב הביתה לפני ההחלפה.
    6. נגב צינור חרוטים עם 70% אתנול.
    7. חזור על בדיקות על הגור הבא עד ההמלטה כולו נבדקה.
    8. השלך כדור צמר גפן צינור חרוטים. ציוד כל נקי עם אתנול 70%.
  2. יַנוּקָא תצפית מבחן
    הערה: מבחן תצפית יַנוּקָא מנוהל מדי יום בין P19 ל P21 להבקיע רמות תנועה ופעילות כללית.
    1. עכברי תחבורה לאזור בדיקותnd מניח לנוח למשך 30 דקות לפני הבדיקה.
    2. כן תיבת בדיקות פרספקס המסומנות רשת 6x6 של 2 ריבועי אינץ על הבסיס ידי ניקוי עם אתנול 70%. הגדרת ציוד וידאו לצד כאלה שהתיבה כולו בתחום הצפייה. שמור את להגדיר הסביבה אותו כל יום כדי למנוע החדרת חידוש.
    3. הסר יַנוּקָא אחד מהכלוב ומכניס כוס החזקה נקיה. משקל שיא.
    4. בגין הקלטת וידאו על ידי לצלם את תעודת זהות הבדיקה, עם מספר זיהוי עכבר, גיל ותאריך הבדיקה. עבר עכבר מהחזקת כוס לכיכר במרכז. זמן במשך שלוש דקות, סופר את מספר השורות נחצות על ידי שני כפותיה הקדמיות של העכבר במהלך הבדיקה.
    5. חזור עכבר כדי הקלטת וידאו כלוב קצה נקיה.
    6. נקה את מנגנון הבדיקה עם אתנול 70%.
    7. חזור על הפעולה עד כל המלטה נבחנת, ואז להחזיר את כל הגורים לכלוב בבית.
    8. הציוד יש לנקות את כל הבדיקות עם אתנול 70%.
    9. שימוש בסרטונים, לכמת את מספר גידול אירועים על ידי ספירה לאחר תצפית ויזואלית, שם עכבר עומד בשתי רגליו הקדמיות הברורות של תמיכה, טיפוח אירועים, בם שני רגליו הקדמיות עוסקות בניקוי.
  3. בדיקה של עוצמת גריפ קווים
    הערה: מבחן כוח האחיזה מתנהל לסירוגין בין P22 ו- P26, להעריך כוח התוקפת.
    1. עכברי תחבורה לאזור בדיקות ולאפשר לנוח בכלוב בבית למשך 30 דקות לפני הבדיקה.
    2. כן מנגנון על ידי ניקוי רשת קופסא רשת פרספקס עם 70% אתנול. מניח באריזת בועות בתחתית התיבה ומכסים בנייר.
    3. עכברים נפרדים לקבוצות של שלוש, צבת בכוסות החזקת פרט.
    4. יש לשים את הסמן ראשון במרכז של רשת התיל ולאט לאט להפוך 10-20 סנטימטר מעל המשטח הרך בחלקו התחתון של תיבת פרספקס. מדוד את חביון ליפול באמצעות סטופר. סיימתי בדיקה לאחר 60 שניות חלפו אם העכבר לאנפילה, ליפול.
    5. חזור עכבר כדי כוס מחזיקה, לנגב רשת עם אתנול 70% ולהחליף נייר על נייר הבועות. לבצע את הבדיקה על שני עכברים הנותרים בקבוצה לפני החזרה הראשונה. חזור על הפעולה עד כל עכבר נבדק בסך הכל שלוש פעמים.
    6. מחזיר את הקבוצה לכלוב נקי ולהמשיך עם שאר קבוצות. אם יש פחות משלושה עכברים בכל קבוצה, להבטיח כי מרווח התאוששות 5 דקות בין משפט מותר.
    7. להחזיר את כל העכברים לכלוב בבית, להשליך נייר וציוד בדיקה נקי עם אתנול 70%.

בחינת 2. מבנה רשתית

  1. לטשטש בעלי חיים שנמצאים P30-35 בזריקה intraperitoneal של קטמין (100 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג / ק"ג). הערכת עומק ההרדמה על ידי צובט את שודד הדרכים והמשך רק בהעדר תגובה, עולים בקנה אחד עם הנחיות IACUC. Perfuse עם 4% PFA / PBS 48.
  2. כדי להסיר את העיניים, לנקות את העור סי החתךte עם 70% אתנול, לפני שהם חותכים דרך העור בבסיס הגולגולת. לקלף בחזרה את העור כדי לחשוף את הגולגולת ונקיה עם 70% אתנול. שימוש בכלים לנקות, לחתוך בזהירות דרך הגולגולת להגיע ארובות עיניים ולחשוף את העיניים. לנתק את עצב הראייה, מסיר את העין בעדינות מהשקע ולשטוף ב PBS.
  3. תקן שעיניו 4% PFA / PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. הניח עיניים בצלחת פטרי קטנה המכילה PBS. לעשות חתך קטן במרכז הקרני באמצעות מספרי הסרת תפר. הסר את הקרנית על ידי חיתוך הקצה בין הקרנית בלובן העין. שימוש במלקחיים כדי להסיר את איריס. לבסוף, לקלף את שכבות הרשתית, עוזב את שלמי רשתית העדשה במקום.
    הערה: קיבוע 4% PFA / PBS יגרום ניתוק רשתית המאפשר הרשתית עליו לקלף בקלות מהחלק החיצוני של הרשתית.
  5. Re-fix ב 4% PFA / 30% סוכרוז / PBS במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר לפני החזרת עין אל צלחת פטרי המכילה PBS. משוך את lens באמצעות מלקחיים, להביא את הגוף הזגוגי יחד עם זה.
  6. Cryoprotect ב סוכרוז 30% בין לילה ב 4 ° C..
  7. עיניים מעיילות במתחם טמפרטורת חיתוך אופטימום (OCT) והעברת עובש הטבעה המכיל אוקטובר הטרי. אוריינט העין כך במישור sagittal מקביל עם הפנים חיתוך, באמצעות תנועות מעטות ככל האפשר והימנעות כניסתה של בועות אוויר. פלאש להקפיא ידי טבילת העובש באמבט קרח / אתנול יבש. בלוקי חנות ב -80 מעלות צלזיוס.
  8. באמצעות cryostat, לחתוך 20 מיקרומטר חלקים sagittal ולאסוף בשקופיות precleaned.
  9. הכתם בסעיפים עם hematoxylin ו eosin פי פרוטוקולים סטנדרטיים 49. תמונה באמצעות מיקרוסקופ אור מצויד מיקרוסקופ שדה בהיר.

3. histochemical מכתים

  1. לדוגמא הכנה
    1. להרדים בעלי חיים שנמצאים P30-35 באמצעות מנת יתר isoflurane (30% ב פרופילן גליקול) באמצעות שאיפת טיפה פתוחה. להעריך המתת חסד על ידי ההפסקהשל נשימה, דופק חוסר בתגובה צובט את שודד הדרכים. אשר למוות על ידי נקע בצוואר הרחם כריתת איברים, עולה בקנה אחד עם הנחיות IACUC.
    2. כדי להסיר את המוח, לנקות את העור במקום החתך עם 70% אתנול, לפני שהם חותכים דרך העור בבסיס הגולגולת. לקלף בחזרה את העור כדי לחשוף את הגולגולת ונקיה עם 70% אתנול. שימוש בכלים לנקות, לחתוך בזהירות דרך הגולגולת ולהסיר כדי לחשוף את המוח. הסר את הקרומים, בעדינות להסיר את המוח מחלל הגולגולת. יש לשטוף ב- PBS.
    3. מעיל המוח ב אוקטובר ולהעביר עובש הטבעה המכיל אוקטובר טריים. אוריינט המוח כך במישור sagittal מקביל עם הפנים חיתוך, באמצעות תנועות מעטות ככל האפשר והימנעות כניסתה של בועות אוויר. פלאש להקפיא ידי טבילת העובש באמבט ולאחסן יבש קרח / אתנול ב -80 מעלות צלזיוס.
    4. באמצעות cryostat, לקצץ 10 מיקרומטר חלקים sagittal ולאסוף בשקופיות precleaned.
  2. NADH Diaphorase מכתים
    1. הכן 0.05 חיץ M טריס, pH 7.6 ידי המסת 5.72 גרם טריס-HCl ובסיס 1.66 גרם טריס במים 1L-יונים. חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שישה שבועות.
    2. כן פתרון NADH (2.25 NADH מ"מ 0.05 חיץ M טריס). Aliquot ולאחסן ב -20 ° C.
    3. הכן פתרון NBT (2.5 מ"מ ניטרו-כחול tetrazolium 0.05 חיץ M טריס). חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שישה שבועות בבקבוק זכוכית.
    4. מערבבים כמויות שוות של הפתרון NADH פתרון NBT לעשות פתרון מכתים ולהוסיף 1 מ"ל לכל שקופית. לדגור על 37 מעלות צלזיוס בתא humidified למשך 30 דקות.
    5. פתרון מכתים לשאוב ולשטוף שלוש פעמים עם DH 2 O.
    6. לשטוף שלוש פעמים כל אחד עולה וריכוזי יורד של אצטון / DH 2 0 (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
    7. לשטוף שלוש פעמים ב DH 2 O ו הר קטעים עם בתווך מימי. תמונה באמצעות מיקרוסקופ אור מצוידת f הבהירמיקרוסקופיה ield. מכתים הכחולים מתאים הפעילות האנזימטית.
  3. Succinate dehydrogenase histochemical מכתים
    1. הכן 0.2 M פוספט monobasic נתרן / DH 2 O ו 0.2 M פוספט dibasic נתרן / DH 2 O.
    2. הפוך 0.2 M חיץ פוספט, pH 7.6 ידי שילוב 3 חלקים פוספט monobasic עם 20 פוספט dibasic חלקים נתרן.
    3. הכן פתרון מכתים (0.1 M succinate נתרן, 1.25 M NBT ב 0.2 M חיץ פוספט) ולהוסיף 1 מ"ל לכל שקופית. לדגור על 37 מעלות צלזיוס בתא humidified למשך 60 דקות.
    4. פתרון מכתים לשאוב ולשטוף שלוש פעמים ב DH 2 O.
    5. לשטוף שלוש פעמים כל אחד עולים ויורדים ריכוזים של אצטון / DH 2 O (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
    6. לשטוף שלוש פעמים ב DH 2 O ו הר קטעים עם בתווך מימי. תמונה באמצעות מיקרוסקופ אור מצויד מיקרוסקופ שדה בהיר. מכתים הכחולים מתאים enפעילות zymatic.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סעיף זה מתאר דוגמאות של תוצאות השגה באמצעות שיטות אלה. במבחן-הגפיים האחוריות, מספר ניסיונות למשוך עשה ואת חביון ליפול מסוכמים על שתי בדיקות רצופות עבור כל יום. בדיקה זו יכולה לשמש כדי להשוות קבוצות שונות גנטית להבחין עכברים עם כוח התוקפת מופחת tm1jhoh HtrA2 (KO HTRA2) עכברים באיור 1 א -. B להפגין לא חל שינוי במספר משיכות חביון לרדת מ P4-6 ואחריו ירידה בחוזק התוקפת ב P7-10, לעומת להמלטה (WT HTRA2...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיפולים חזקים נדרשים להגביל את שפעת תנאים מתישים הקשורות להזדקנות אדם, אבל הם נשארים חמקמקים עבור מחלות אלו. כדי לזהות מטרות טיפוליות פוטנציאל ולפתח אסטרטגיות להתערבות, הגורמים ופתולוגיה של מחלות הקשורות להזדקנות יש להבין תחילה. לא כל העכברים המהונדסים גנטי מייד נוכחיים עם פנוטיפים ברורים שאינם קשורים למחלה של עניין, גם אם הגנים האלה קושרו בעבר למצב במחקרים בבני אדם. לכן יותר חקירות שיטתיות נדרשות מהונדסים גנטי עכברים צריכים להיות נתון ניסויים המתאימים לזהות פנוטיפים שעשויים להיות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין אינטרסים מתחרים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מימון למחקר זה בא קרן רפואי Rosebay ואת קרן מחקר של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ייל דין (JH). אנו מודים לד"ר קלייר קניג לעזרה עם ניסויים התנהגותיים. גנטית קווי עכבר Engineered נוצרו ב Ozgene (פרת ', אוסטרליה).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אתנולדקון (פישר סיינטיפיק)435541
50 מ"ל צינור חרוטיפישר סיינטיפיק1443222
כדורי כותנהוולמארט
Sunbeam0000756-500-000
מגש החזקה (מגש קוביות קרח)שעון
GOGOPC396
קופסת פרספקסבנויה בבית מלאכה12 אינץ' על 12 אינץ' 
Vixia HF R400 מצלמת וידיאוCanon8155B004
9 אונקיות כוסות שקופותWalmart
1/4 אינץ' רשת תילהום דיפו204331884 (מקוון) / 554219 (בחנות)12 אינץ' על 12 אינץ' 
ניילון בועותVWR470092-416
מלקחיים ישרים לדגימהVWR82027-438
מלקחיים לחיתוך קצה עדיןVWR82027-408
מספריים עדיניםVWR82027-578
פרפורמלדהיד 16% תמיסהאלקטרונים מדעי מיקרוסקופיה15710
10x פוספט חוצץ מי מלח pH 7.4אמריקן ביואנליטיAB11072-04000
סוכרוזJT בייקר4072-01
שקופיות סופרפרוסטפישר סיינטיפיק12-550-15
תמיסת כתמים המטוקסיליןפישר סיינטיפיק (ריקה)353016
אאוזין y תמיסת כתמיםפישר סיינטיפיק (ריקה)2845-32
טריס הידרוכלורידסיגמאT3253
Tris American BioanalyticalAB02000-01000
ניקוטינמיד אדנין דינוקלאוטיד, הידרט מלח דיסודיום מופחתSigmaN8129
ניטרוטרזוליום כלוריד כחולסיגמאN6876
אצטוןJT Baker9006-05
נתרן פוספט מונוהידראט מונוהידראטסיגמאS9638
נתרן פוספט דו-בסיסי heptahydrateSigmaS9390
נתרן סוקסינט דו-בסיסי הקסהידרטSigmaS2378
Vectaהר הרכבה מימית בינוניתVector LabsH-5501-60
כיסוי זכוכיתפישר סיינטיפיק12-545-M60 מ"מ x 24 מ"מ
מיקרוסקופ AxioImager A1Zeiss
חצובה של מצלמת וידאואמזון
טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT)Fischer Scientific23730571
חתך קריוסטט  מכונהLeica CM1900הופסק אך הוחלף מאז על ידי CM1950
מחצלת חום עצר אלקטרוני Walmart

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klein, R. J., et al. Complement factor H polymorphism in age-related macular degeneration. Science. 308, 385-389 (2005).
  2. Zareparsi, S., et al. Strong association of the Y402H variant in complement factor H at 1q32 with susceptibility to age-related macular degeneration. Am J Hum Genet. 77, 149-153 (2005).
  3. Yang, Z., et al. A variant of the HTRA1 gene increases susceptibility to age-related macular degeneration. Science. 314, 992-993 (2006).
  4. Dewan, A., et al. HTRA1 promoter polymorphism in wet age-related macular degeneration. Science. 314, 989-992 (2006).
  5. Francis, P. J., Zhang, H., Dewan, A., Hoh, J., Klein, M. L. Joint effects of polymorphisms in the HTRA1, LOC387715/ARMS2, and CFH genes on AMD in a Caucasian population. Mol Vis. 14, 1395-1400 (2008).
  6. Cameron, D. J., et al. HTRA1 variant confers similar risks to geographic atrophy and neovascular age-related macular degeneration. Cell Cycle. 6, 1122-1125 (2007).
  7. Herbert, A. P., et al. Structure shows that a glycosaminoglycan and protein recognition site in factor H is perturbed by age-related macular degeneration-linked single nucleotide polymorphism. J Biol Chem. 282, 18960-18968 (2007).
  8. Ding, J. D., et al. Expression of human complement factor h prevents age-related macular degeneration-like retina damage and kidney abnormalities in aged cfh knockout mice. Am J Pathol. 185, 29-42 (2015).
  9. Nakayama, M., et al. Overexpression of HtrA1 and exposure to mainstream cigarette smoke leads to choroidal neovascularization and subretinal deposits in aged mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 6514-6523 (2014).
  10. Liu, J., Hoh, J. Postnatal overexpression of the human ARMS2 gene does not induce abnormalities in retina and choroid in transgenic mouse models. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56, 1387-1388 (2015).
  11. Kanda, A., et al. A variant of mitochondrial protein LOC387715/ARMS2, not HTRA1, is strongly associated with age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16227-16232 (2007).
  12. Zumbrunn, J., Trueb, B. Primary structure of a putative serine protease specific for IGF-binding proteins. FEBS Lett. 398, 187-192 (1996).
  13. Clausen, T., Southan, C., Ehrmann, M. The HtrA family of proteases: implications for protein composition and cell fate. Mol Cell. 10, 443-455 (2002).
  14. Nie, G. Y., Hampton, A., Li, Y., Findlay, J. K., Salamonsen, L. A. Identification and cloning of two isoforms of human high-temperature requirement factor A3 (HtrA3), characterization of its genomic structure and comparison of its tissue distribution with HtrA1 and HtrA2. Biochem J. 371, 39-48 (2003).
  15. Runyon, S. T., et al. Structural and functional analysis of the PDZ domains of human HtrA1 and HtrA3. Protein Sci. 16, 2454-2471 (2007).
  16. Glaza, P., et al. Structural and Functional Analysis of Human HtrA3 Protease and Its Subdomains. PLoS One. 10, e0131142. 10, e0131142(2015).
  17. Dolmans, D. E., Fukumura, D., Jain, R. K. Photodynamic therapy for cancer. Nat Rev Cancer. 3, 380-387 (2003).
  18. Grau, S., et al. Implications of the serine protease HtrA1 in amyloid precursor protein processing. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6021-6026 (2005).
  19. Lecha, M., Puy, H., Deybach, J. C. Erythropoietic protoporphyria. Orphanet J Rare Dis. 4, 19(2009).
  20. Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy. Chem Soc Rev. 40, 340-362 (2011).
  21. Li, W., et al. Structural insights into the pro-apoptotic function of mitochondrial serine protease HtrA2/Omi. Nat Struct Biol. 9, 436-441 (2002).
  22. Jo, H., Patterson, V., Stoessel, S., Kuan, C. Y., Hoh, J. Protoporphyrins enhance oligomerization and enzymatic activity of HtrA1 serine protease. PLoS One. 9, 115362(2014).
  23. Bogaerts, V., et al. Genetic variability in the mitochondrial serine protease HTRA2 contributes to risk for Parkinson disease. Hum Mutat. 29, 832-840 (2008).
  24. Baldi, A., et al. The HtrA1 serine protease is down-regulated during human melanoma progression and represses growth of metastatic melanoma cells. Oncogene. 21, 6684-6688 (2002).
  25. Oka, C., et al. HtrA1 serine protease inhibits signaling mediated by Tgfbeta family proteins. Development. 131, 1041-1053 (2004).
  26. Chien, J., et al. A candidate tumor suppressor HtrA1 is downregulated in ovarian cancer. Oncogene. 23, 1636-1644 (2004).
  27. Grau, S., et al. The role of human HtrA1 in arthritic disease. J Biol Chem. 281, 6124-6129 (2006).
  28. Chien, J., et al. Serine protease HtrA1 modulates chemotherapy-induced cytotoxicity. J Clin Invest. 116, 1994-2004 (2006).
  29. Chien, J., Campioni, M., Shridhar, V., Baldi, A. HtrA serine proteases as potential therapeutic targets in cancer. Curr Cancer Drug Targets. 9, 451-468 (2009).
  30. Hara, K., et al. Association of HTRA1 mutations and familial ischemic cerebral small-vessel disease. N Engl J Med. 360, 1729-1739 (2009).
  31. Jones, A., et al. Increased expression of multifunctional serine protease, HTRA1, in retinal pigment epithelium induces polypoidal choroidal vasculopathy in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14578-14583 (2011).
  32. Vierkotten, S., Muether, P. S., Fauser, S. Overexpression of HTRA1 leads to ultrastructural changes in the elastic layer of Bruch's membrane via cleavage of extracellular matrix components. PLoS One. 6, e22959(2011).
  33. Strauss, K. M., et al. Loss of function mutations in the gene encoding Omi/HtrA2 in Parkinson's disease. Hum Mol Genet. 14, 2099-2111 (2005).
  34. Patterson, V. L., et al. Neural-specific deletion of Htra2 causes cerebellar neurodegeneration and defective processing of mitochondrial OPA1. PLoS One. 9, 115789(2014).
  35. Jones, J. M., et al. Loss of Omi mitochondrial protease activity causes the neuromuscular disorder of mnd2 mutant mice. Nature. 425, 721-727 (2003).
  36. Martins, L. M., et al. Neuroprotective role of the Reaper-related serine protease HtrA2/Omi revealed by targeted deletion in mice. Mol Cell Biol. 24, 9848-9862 (2004).
  37. Kang, S., et al. Loss of HtrA2/Omi activity in non-neuronal tissues of adult mice causes premature aging. Cell Death Differ. 20, 259-269 (2013).
  38. Dynon, K., et al. HtrA3 as an early marker for preeclampsia: specific monoclonal antibodies and sensitive high-throughput assays for serum screening. PLoS One. 7, e45956(2012).
  39. Singh, H., et al. HtrA3 Is Downregulated in Cancer Cell Lines and Significantly Reduced in Primary Serous and Granulosa Cell Ovarian Tumors. J Cancer. 4, 152-164 (2013).
  40. Inagaki, A., et al. Upregulation of HtrA4 in the placentas of patients with severe pre-eclampsia. Placenta. 33, 919-926 (2012).
  41. Liu, J., Li, Y., Hoh, J. Generation and characterization of mice with a conditional null allele of the HtrA4 gene. Mol Med Rep. , (2015).
  42. Bowden, M. A., Di Nezza-Cossens, L. A., Jobling, T., Salamonsen, L. A., Nie, G. Serine proteases HTRA1 and HTRA3 are down-regulated with increasing grades of human endometrial cancer. Gynecol Oncol. 103, 253-260 (2006).
  43. Chen, Y. Y., et al. Functional antagonism between high temperature requirement protein A (HtrA) family members regulates trophoblast invasion. J Biol Chem. 289, 22958-22968 (2014).
  44. Fritsche, L. G., et al. Age-related macular degeneration is associated with an unstable ARMS2 (LOC387715) mRNA. Nat Genet. 40, 892-896 (2008).
  45. Beleford, D., Rattan, R., Chien, J., Shridhar, V. High temperature requirement A3 (HtrA3) promotes etoposide- and cisplatin-induced cytotoxicity in lung cancer cell lines. J Biol Chem. 285, 12011-12027 (2010).
  46. Hegde, R., et al. Identification of Omi/HtrA2 as a mitochondrial apoptotic serine protease that disrupts inhibitor of apoptosis protein-caspase interaction. J Biol Chem. 277, 432-438 (2002).
  47. Martins, L. M., et al. The serine protease Omi/HtrA2 regulates apoptosis by binding XIAP through a reaper-like motif. J Biol Chem. 277, 439-444 (2002).
  48. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , (2012).
  49. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008. 2008, pdb prot4986 (2008).
  50. Wahlsten, D. A developmental time scale for postnatal changes in brain and behavior of B6D2F2 mice. Brain Res. 72, 251-264 (1974).
  51. El-Khodor, B. F., et al. Identification of a battery of tests for drug candidate evaluation in the SMNDelta7 neonate model of spinal muscular atrophy. Exp Neurol. 212, 29-43 (2008).
  52. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, 297-312 (2011).
  53. Chance, B., Williams, G. R., Holmes, W. F., Higgins, J. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. V. A mechanism for oxidative phosphorylation. J Biol Chem. 217, 439-451 (1955).
  54. Kamo, N., Muratsugu, M., Hongoh, R., Kobatake, Y. Membrane potential of mitochondria measured with an electrode sensitive to tetraphenyl phosphonium and relationship between proton electrochemical potential and phosphorylation potential in steady state. J Membr Biol. 49, 105-121 (1979).
  55. Brown, G. C., Brand, M. D. Proton/electron stoichiometry of mitochondrial complex I estimated from the equilibrium thermodynamic force ratio. Biochem J. 252, 473-479 (1988).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

NADHHtrA2

מאמרים קשורים