מאמר שיטה

ויזואליזציה של מולקולות DNA גדולות קשור Surface עם DNA חלבון פלואורסצנטי כריכת פפטיד

DOI:

10.3791/54141

⸱

23 ביוני 2016

 , 
1Department of Chemistry and Interdisciplinary Program of Integrated Biotechnology, Sogang University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים גישה להמחשת מולקולות DNA גדולות מוכתמות בפפטיד קושר DNA של חלבון פלואורסצנטי (FP-DBP) הקשורות על הפוליאתילן גליקול (PEG) ומשטח הזכוכית המצופה אבידין ונמתחות בזרימות גזירה מיקרופלואידיות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מולקולות DNA גדולות הקשורות על משטח הזכוכית הפונקציונלית שימשו בפיזיקה של פולימרים ובביוכימיה, במיוחד לחקירת אינטראקציות בין DNA לחלבוני הקישור שלו. כאן, אנו מדווחים על שיטה המשתמשת במיקרוסקופיה פלואורסצנטית להדמיית מולקולות DNA גדולות הקשורות על פני השטח. ראשית, כיסויי זכוכית עוברים ביוטינילציה ופסיבציה על ידי ציפוי בפוליאתילן גליקול ביוטיניל, הקושר באופן ספציפי DNA ביוטיניל באמצעות מקשרים לחלבון אבידין ומפחית משמעותית קשירה לא רצויה מאינטראקציות לא ספציפיות של חלבונים או מולקולות DNA על פני השטח. שנית, מולקולות הדנ"א עוברות ביוטינילציה בשתי שיטות שונות בהתאם לטרמינלים שלהן. ה-DNA הקהה מתויג עם dUTP ביוטיניל בקצה ההידרוקסיל 3' שלו, על ידי טרנספראז טרמינלי, בעוד שה-DNA הדביק מוכלא עם אוליגונוקלאוטידים משלימים ביוטיניים על ידי DNA ליגאז. לבסוף, זרימת גזירה מיקרופלואידית גורמת למולקולות DNA בודדות להימתח לאורכי המתאר המלאים שלהן לאחר שנצבעו בפפטיד קושר חלבון-DNA פלואורסצנטי (FP-DBP).

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ויזואליזציה של מולקולות דנ"א גדולות קשורות ברצועה על משטחי זכוכית או חרוז נוצלה על חקירת אינטראקציות חלבון דנ"א, דינמיקת חלבון על מצע DNA, 1,2 ופיזיקת פולימר. 3,4 פלטפורמת מולקולות דנ"א גדולות יחידות קשורות יש כמה ברור יתרונות בהשוואה לשיטות וקיבוע DNA אחרים. 5 ראשית, מולקולת דנ"א גדולה הקשורה על פני השטח יש קונפורמציה טבעי אקראי סליל ללא אספקת גזירה, מהם החשיבות מכרעת עבור חלבון-DNA מחייבת להכיר אתר הקישור שלו. שנית, זה מאוד קל לשנות את הסביבה הכימית סביב מולקולות DNA לסדרת תגובות אנזימטיות בתא זרימה. שלישית, זרימת גזירת microfluidic גורמת DNA המולקולרית המתיח עד 100% של אורך המסלול המלא, וזה מאוד קשה להשיג באמצעות התארכות DNA גישות חלופית כגון משטח וקיבוע 6 וכליאת nanochannel. 7 מלא stretcheמולקולת הדנ"א ד גם מספקת מידע מיקומית כי יכול להיות שימושי עבור ניטור תנועות האנזימטית על המפה הגנומי.

אף על פי כן, גישת קשירת DNA יש חסרון קריטי כי לצבוע intercalating כגון YOYO-1 בדרך כלל גורם למולקולות DNA קשורות להישבר בקלות על ידי אור עירור קרינה. באופן כללי, מולקולות דנ"א גדולות צריכות להיות מוכתמות עם פלורסנט לצבוע להדמיה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לשם כך, YOYO-1 או צבעי סדרת הטוטו אחרים משמשים בעיקר בגלל צבעים אלה לזרוח רק כשהם intercalate פעמיים גדילי דנ"א. 8 עם זאת, ידוע כי bis-intercalating לצבוע גורם צילום מחשוף DNA האור הנגרמת בגלל של עיבור fluorophores. 9 יתר על כן, מולקולות DNA מוכתמות fluorescently הקשור על פני השטח הן יותר שבירות מאז תזרים גזירה יכול להפעיל שבירת כוחות על העברת מולקולות DNA באופן חופשי. לכן, פיתחנו FP-DBP כרומן DNA-מכתים חלבון לצבוע הדמית מולקולות דנ"א גדולות קשורות ברצועה על פני השטח. היתרון של שימוש FP-DBP הוא שזה לא לגרום צילום מחשוף של מולקולות DNA שאליו הוא נקשר. 10 בנוסף, FP-DBP אינה מגדילה את אורך קווי המתאר של ה- DNA, ואילו צבעים-intercalating bis להגדיל את אורך המסלול בכ -33%.

שיטת וידאו זה מציגה את הגישה ניסיון אולי לקשירת מולקולות דנ"א גדולות משטח PEG-ביוטין. איור 1 מדגים גישות שונות של קשירת DNA עם קצוות בוטים קצוות דביקים. לכן, שיטה מכתימה זה יכול להיות מיושמת על כל סוג של מולקולת הדנ"א. איור 2 מתאר ייצוג סכמטי של הרכבת תא הזרימה שיכולה להיות נשלטה על ידי משאבת מזרק כדי ליצור תזרים גזירה למתוח מולקולות דנ"א וכן לטעון כימיים אנזים פתרונות. איור 3 מדגים micrographs של מולקולות DNA נמתח מלא קשורה על PEGylatמשטח ed 11 ומוכתם FP-DBP.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. DNA biotinylation

  1. Biotinylation של DNA חוד מעוגל באמצעות מסוף transferase (TDT)
    הערה: השתמש T4 DNA (166 KBP), שהינה DNA חוד מעוגל.
    1. הוסף 5 μl של 2.5 מ"מ 2 CoCl, 5 μl של 10 × חיץ התגובה, 0.5 μl של 10 מ"מ ביוטין-11-dUTP, 0.5 μl של transferase הטרמינל (10 יחידות), ו -0.5 μl של ה- DNA T4 (0.5 מיקרוגרם / μl) לתערובת התגובה. הפוך לנפח סופי של 50 μl ידי הוספת 38.5 μl של מים.
    2. דגירת תערובת התגובה על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה.
      הערה: זמן תגובה מורחבת עשוי להניב הדנ"א הדו-קשור, כלומר, יתכן כי biotins מתויג בשני קצותיו.
    3. עצור את התגובה על ידי הוספת 5 μl של 0.5 מ 'EDTA, pH 8.
    4. שמור את הצינור על 4 מעלות צלזיוס.
  2. Biotinylation של DNA הסתיימה דביק שימוש DNA האנזים
    הערה: DNA λ השתמש (48.5 KBP), שהינה DNA דביק-סוף.
    1. הוסף 1 μl של ה- DNA האנזים T4, 5 μl של חיץ קשירת 10 ×, 1 μl של 25 ng / μl DNA הפאג λ, ולהוסיף 43 μl של מים כדי ליצור נפח סופי של 50 μl.
    2. שמור את הצינור על 4 מעלות צלזיוס.

2. derivatization Surface הפונקציונלי

הערה:. על מנת לקשור קץ של מולקולת דנ"א על משטח זכוכית, קבוצה אמינית העיקרי הוא silanized על coverslip ואחריו ציפוי ביוטין-PEG כפי שמוצג באיור 1 תהליך PEGylation זה חשוב הדמיה DNA מולקולה בודדת כי זה יכול להקטין אקראי רעש נוצר על ידי התקשרות של רצויי מולקולות משמעותיים על פני השטח.

  1. פיראנה ניקוי
    הערה: פתרונות פיראנה להגיב נמרצות עם חומרים אורגניים, ולכן זה צריך להיות מטופל בזהירות, עמידה בהנחיות בטיחות נאותה.
    1. מקום coverslips על מדף polytetrafluoroethylene (PTFE), ולהחזיק אותם בy PTFE חותם חוט קלטת לאורכו, חצי על קצה משטחים וחצי על המדף. לאחר גלישה, להשאיר חתיכה ארוכה (~ 5 סנטימטרים) של סרט לטיפול המתל במהלך הליך הניקוי.
    2. ממלאים כוס זכוכית 1 ליטר עם 350 מ"ל של H 2 SO 4 ו -150 מ"ל של H 2 O 2 כדי להפוך פתרון פיראניה במנדף. מניחים את מתלה בתמיסה פיראניה במשך שעה 2..
    3. פתרון פיראניה ריק מן הקנקן, ולשטוף coverslips ביסודיות עם מים ללא יונים עד pH של המים בכוס מגיע נייטרלי. השתמש רצועות נייר pH.
    4. Sonicate המדפים של תלושים לכסות במים המכילים המבחנה, למשך 30 דקות. מים ריקים מהקנקן רק לפני silanization אמינו. השתמש 75 ואט sonication לנקות derivatize מצעי הזכוכית.
  2. Aminosilanization על משטח זכוכית
    1. הוסף 2 מ"ל של N - [3- (trimethoxysilyl) propyl] ethylenediamine ו -10 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית 200 מ"לשל מתיל אלכוהול במיכל פוליפרופילן נקי להכנת הפתרון aminosilanization.
    2. מניחים coverslips לנקות בתוך המיכל פוליפרופילן. לנער אותם ב 100 הטמפרטורה סל"ד ו החדר למשך 30 דקות.
    3. Sonicate כוס עם מכסה מחליק derivatized במשך 15 דקות ב 75 W. לנער אותם ב 100 הטמפרטורה סל"ד ו מקום לפחות 30 דקות.
    4. רוקן את הפתרון מן הקנקן, ולשטוף coverslips בזהירות, פעם עם אלכוהול מתיל, ופעמיים עם כוהל אתילי. coverslips אחסן כוהל אתילי ולהשתמש בהם תוך שבועיים.
  3. PEGylation של coverslip
    1. הפוך 10 מ"ל של 0.1 מ 'סודיום ביקרבונט (NaHCO 3). סנן את הפתרון באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר.
    2. ממיסים 2 מ"ג של קרבונט ביוטין-PEG-succinimidyl (ביוטין-PEG-SC) ו -80 מ"ג של valerate PEG-succinimidyl (MPEG-SVG) ב 350 μl של NaHCO 3. השתמש צינור הגנת אור.
    3. וורטקס צינור נמרצות במשך 10 שניות, צנטריפוגות אותו ב 10,000 g × דקות 1 כדי להסיר בועות.
    4. יש לשטוף שקופית זכוכית עם אצטון, ואחריו שטיפה עם כוהל אתילי. אפשר את השקופית אוויר יבש לחלוטין.
    5. מניח ירידה (50 μl) של פתרון PEG בשקופית הזכוכית הנקיה. מכסים את אגל בעדינות עם תלוש כיסוי silanized אמינו, מבלי ליצור בועות.
    6. מקום שקופית עבור 3 שעות עד לילה חשוך, גם מפולס בתא לח בטמפרטורת חדר. השתמש בעל קצה פיפטה וריק כמו התא, עם מים בתחתית. חותם פתרון PEG שיורית בצינור ולשמור אותו על 4 מעלות צלזיוס.
    7. שוטפים את coverslip PEGylated ביסודיות עם מים ללא יונים. אחסן אותו במקום חשוך ויבש עד השימוש.

3. הרכבת תא זרימה

  1. לפברק בעל אקריליק אגרוף, כמו באיור 2. ודא בקוטר של להכניס צינורות הוא 0.762 מ"מ, וציין חור אחד הוא מפרץ קטן והשני הואלשקע (איור 2).
  2. מניח רצועות סרט דביקות דו-צדדיות (רוחב 5-6 מ"מ) על בעל אקריליק (איור 2), יישור בניצב חור כניסה ויציאה, לא מביך כל חורי ערוץ. השתמש רצועות קלטת אלה קירות רב ערוצית לעשות תאים. שפשפו את הקלטת באמצעות קצה pipet.
  3. מניחים coverslip PEGylated על העליונה כדי ליצור תאי זרימה, כשהצד PEGylated עם הפנים כלפי מטה.
  4. כדי למנוע כל פתרון דליפה, לחץ על החלק העליון של coverslip על האזור שבו קלטות דו צדדית ממוקמות. להוסיף דבק אפוקסי מהיר יבש כדי לסגור את הקצוות של החדר בראש בתחתית (צבע צהוב באיור 2).
  5. חבר קטע קצר (2.5 ס"מ) של צינורות (קוטר חיצוני, OD, 0.042 ") כדי מזרק חזק גז ולאטום המפרק עם דבק אפוקסי.
  6. חבר צינורות (OD: 0.03 ") ארוכים וגמישים אל הצינורות צמודים המזרק ולאטום מפרק עם דבק אפוקסי.
  7. מלא את הטוביםng צמוד מזרק עם מים די. ודא שאין בועות אוויר.
  8. הכנס את הצינור לתוך החור של תא הזרימה חתום עם דבק אפוקסי.
  9. מניחים טיפ צהוב (200 קצה μl) על החור אחרים כמאגר.

4. טוענים דוגמא אל לשכת התזרים

הערה: Neutravidin ניתן להחליף חלבונים avidin אחרים כגון streptavidin. כל התגובות יכול להתבצע בטמפרטורת החדר, אלא אם כן היא מוזכרת. קח פתרון מדגם טיפ צהוב, ולהתקין את הקצה עם הפתרון לתוך החור של בעל אקריליק (איור 2b).

  1. הגדר את קצב הזרימה של המשאבה מזרק ב 50 μl / min. טען 20 μl של חלבון avidin (25 מיקרוגרם / מ"ל ​​בתמיסה T50, טריס 10 מ"מ, 50 מ"מ NaCl, pH 8), ולשמור אותו במשך 10 דקות.
  2. טען 20 μl של oligodeoxynucleotides biotinylated (100 מיקרומטר 1 × TE), ולשמור אותו במשך 10 דקות. אם transferase הטרמינל משמש, לדלג על הטעינהשל oligodeoxynucleotides.
  3. טען 20 μl של פתרון ה- DNA משלב 1 לתוך תא זרימה בקצב זרימה של 10 μl / min, ולשמור אותו במשך 30 דקות.
  4. שטפו את תא הזרימה עם 1 × TE, ולטעון 40 μl של 10 FP-DBP (~ 80 ננומטר).
  5. שים DNA תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם זרימה רציפה של מולקולות מכתימות ב 1 × TE על עדשה אובייקטיבית 60X. השתמש 488 לייזר מצב מוצק ננומטר עירור של FP (eGFP) -DBP. עבור מתיחה מלאה של מולקולות DNA, להחיל ספיקות שונות לפי אורכי DNA בשימוש. לדוגמה, להחיל 50 μl / min 48.5 KBP של DNA λ, ו 100 μl / min 166 KBP של דנ"א T4.
    1. עבור מחזור של בעל אקריליק, להשרות תאי זרימה התאספו בתמיסת דטרגנט בית 12. הסר קלטות אפוקסי עם סכין גילוח ולשפשף עם ידות כדי לקחת אותם לגמרי. סתימה חורה עם מחטי מזרק. שמור על הבעלים במי deionized עד לשימוש נוסף.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 מציג שתי שיטות קשירת DNA שונות בהתאם מבני מסוף של מולקולת הדנ"א. האיור 1 א ממחיש כיצד מולקולות DNA הסתיימו הדביקות הם הכלאה עם oligonucleotides biotinylated משלים, אשר משותק על פני שטח PEG מצופה avidin. 1B איור מראה תוספת של biotinylated ddNTP או dNTP לקבוצת הידרוקסיל '3 של ה- DNA חוד מעוגל ידי transferase הטרמינל. הוספנו linkers גמישה בין מולקולות דנ"א ביוטין. עובדה זו הגבירה את היעילות מחי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים פלטפורמה המאפשר הדמיה מולקולות דנ"א ארוכות biotinylated לעיגון על משטחים. דיווחנו גישה עבור מולקולות DNA קשור על משטח מצופה חלבון avidin עם אלבומין בסרום שור biotinylated. 6 לפי הגישה קודם לכן, מצאנו נושא מכריע של מחשוף צילום DNA הנגרם על ידי צבעי bis-העיבור כי להכתים מולקולות DNA קשור על משטח. כמו fluorophores נרגש הרף אלה יש סבירות גבוהה לתקיפה עמוד שדרה פוספט DNA, 9 הכוח אור עירור היה צריך להיות ממוזער כדי למנוע מחשוף התמונה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענק המחקר של אוניברסיטת סוגאנג לשנת 201410036.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>1. DNA Biotinylation
1.1) ביוטינילציה של DNA קהה באמצעות Terminal Transferase (TdT)
Terminal TransferaseNew England BiolabsM0315Sמסופק עם מאגר תגובה פי 10, 2.5 מ"מ קובלט כלוריד
ביוטין-11-dUTPInvitrogenR0081ביוטין-ddNTP זמין גם
T4GT7 Phage DNANippon Gene318-03971
חומצה אתילנדיאמינטטראצטיתסיגמא-אולדריץ'E6758EDTA
<חזק>1.2) ביוטינילציה של DNA קצה דביק באמצעות DNA Ligase
T4 DNA LigaseNew England BiolabsM0202Sמסופק עם מאגר תגובה פי 10
Lambda Phage DNABioneerD-2510זמין גם ב-New England Biolabs
<חזק>2. פונקציונליזציה משטח נגזרת
<חזק>2.1) פיראנה ניקוי
CoverslipMarienfeld-Superior010105022 מ"מ x 22 מ"מ, מס' 1 עובי
מתלהייצור מותאם אישית
PTFE חוט חותם קלטתהאן יאנג כימיקלים בע"מ3032292טפלון ומסחר; קלטת
חומצה גופרתיתJin Chemical Co. Ltd.S280823H2SO4, 95% טוהר
מי חמצןJin Chemical Co. Ltd.H290423H2O2, 35% במים
SonicatorDaihan Scientific Co. Ltd.WUC-A02Hמנקה אולטרסאונד שולחני
<חזק>2.2) אמינוסילניזציה על משטח זכוכיתN-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]
ethylenediamine Sigma-Aldrich 104884 חומצה אצטית קרחונית Duksan Chemicals 414 99% טוהר מתיל אלכוהול Jin Chemical Co. Ltd.
M30031899.9% טוהר
QorpakPLC-04907
אתיל אלכוהולJin Chemical Co. Ltd.A30020299.9% טוהר
<חזק>2.3) PEGylation של הכיסוי
נתרן ביקרבונטסיגמא-אולדריץ'S5761
מסנן מזרקSartorius16534----------K
ביוטין-PEG-SCLaysan ביוביוטין-PEG-SC-5000
mPEG-SVGLaysan BioMPEG-SVA-5000
אצטוןג'ין כימיקלים בע"מA300129טוהר 99%
Marienfeld-Superior1000612~ 76 מ"מ x 26 מ"מ x 1  mm
<חזק>3. הרכבת תא זרימה
אקריליק תמיכהבייצור מותאם אישית
סרט דו צדדי3Mסוג שקוף
אפוקסי ייבוש מהיר3M
צינורות פוליאתילןCole-Parmer06417-11, 06417-21
גז אטום 250 ומיקרו; l מזרקהמילטון81165
משאבת מזרקNew Era Pump Systems Inc.NE-1000
<חזק>4. טעינת דגימה לתוך תא זרימה
NeutravidinThermo Scientific31000
Tris baseSigma-AldrichT1503-5KGמיקרוסקופ בסיס Trizma
OlympusIX70
EMCCD CameraQ ImagingRolera EM-C2
לייזר מצב מוצק (488  nm)OxxiusLBX488
AlconoxAlconox Inc.
טפלון מיכל פוליפרופילן שקופיות מיקרוסקופ

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct Mechanical Measurements of the Elasticity of Single DNA-Molecules by Using Magnetic Beads. Science. 258 (5085), 1122-1126 (1992).
  2. Finkelstein, I. J., Visnapuu, M. -L., Greene, E. C. Single-molecule imaging reveals mechanisms of protein disruption by a DNA translocase. Nature. 468 (7326), 983-987 (2010).
  3. Doyle, P. S., Ladoux, B., Viovy, J. L. Dynamics of a tethered polymer in shear flow. Phys. Rev. Lett. 84 (20), 4769-4772 (2000).
  4. Perkins, T. T., Quake, S. R., Smith, D. E., Chu, S. Relaxation of a Single DNA Molecule Observed by Optical Microscopy. Science. 264 (5160), 822-826 (1994).
  5. Cai, W., et al. Ordered restriction endonuclease maps of yeast artificial chromosomes created by optical mapping on surfaces. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (11), 5164-5168 (1995).
  6. Kim, Y., Jo, K. Neutravidin coated surfaces for single DNA molecule analysis. Chem. Comm. 47 (22), 6248-6250 (2011).
  7. Kim, Y., et al. Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length. Lab on a Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).
  8. Glazer, A. N., Rye, H. S. Stable dye-DNA intercalation complexes as reagents for high-sensitivity fluorescence detection. Nature. 359 (6398), 859-861 (1992).
  9. Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers. Langmuir. 22 (1), 292-299 (2006).
  10. Lee, S., et al. DNA binding fluorescent proteins for the direct visualization of large DNA molecules. Nucleic Acids Res. , (2015).
  11. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  12. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. J. Vis. Exp. (86), e50549(2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Fluorescent Protein DNA Binding PeptideDNA VisualizationSurface tethered DNA MoleculesBiotinylated DNAAvidin Protein LinkersPolyethylene Glycol CoatingMicrofluidic Shear FlowFluorescent MicroscopyDNA StretchingFlow Chamber Assembly

מאמרים קשורים