מאמר שיטה

זיהוי Cortex שבר במהלך בקטריאלי Spore נביטה

DOI:

10.3791/54146

⸱

25 ביוני 2016

 , 
1Department of Biology, Texas A&M University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים בדיקה קולורימטרית לאיתור נוכחות של סוכרים מפחיתים במהלך נביטת נבגי חיידקים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תהליך נביטת האנדוספורים ב-Clostridium difficile, ובקלוסטרידיות אחרות, נמצא יותר ויותר שונה מהחיידק היוצר נבגים, Bacillus subtilis. הנביטה מופעלת על ידי נביטות מולקולות קטנות ומתרחשת ללא צורך בסינתזה מקרומולקולרית. למרות שקיימים הבדלים בין מנגנוני נביטת הנבגים במינים של Bacillus ו-Clostridium, דרישה נפוצה היא הידרוליזה של קליפת המוח דמוית הפפטידוגליקן המאפשרת לליבת הנבגים להתנפח ולהתייבש מחדש. לאחר החזרת נוזלים, חילוף החומרים יכול להתחיל וזה, בסופו של דבר, מוביל לצמיחה של תא וגטטיבי. איתור שברי קליפת המוח שעברו הידרוליזה במהלך נביטת נבגים יכול להיות קשה והשינויים במבחנים שתוארו קודם לכן יכולים להיות מבלבלים או קשים לשחזור. לפיכך, בהתבסס על הדוח האחרון שלנו המשתמש בבדיקה זו, אנו מפרטים פרוטוקול שלב אחר שלב לזיהוי קולורימטרי של שברי קליפת המוח במהלך נביטת נבגי חיידקים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endospores הם מטבולית צורות רדומות של חיידקים המאפשרים חיידקים להתמיד בסביבות שליליות. אצל חיידקים רבים יוצרי נבגים, יצירת נבגים היא מושרה על ידי מחסור באבות מזון אך תהליך זה יכול להיות נשלט על ידי שינויי pH, חשיפה לחמצן או מדגיש אחרים 1. בעוד בצורה מטבולית הרדומה הנבג שלהם, חיידקים להתנגד קרינת UV, התייבשות, בטמפרטורות גבוהות, והקפאת 2. רוב הידע על תהליך נביגה מגיעה ממחקרים באורגניזם מודל, subtilis Bacillus. תהליך נביגה מתחיל עם שכפול הדנ"א ואת ההיווצרות של 3,4 נימה צירית. מחץ סימטרית אז מחלק התא לשני תאים בגודל שווה. התא הגדול יותר, התא האם, בולע את התא הקטן יותר, forespore. שניהם תא אמא forespore לתאם ביטוי גנים להבשיל לנבגים ואת התא האם בסופו של דבר lyses, שחרור דורמןt נבג לתוך הסביבה 1.

מבנה הנבג וההרכב נשמרים על פני מינים רבים של חיידקים. ליבת הנבג יש תכולת מים נמוכה יותר מאשר בתא וגטטיבי והוא עשיר בחומצת dipicolinic (DPA) 1,2. במהלך יצירת נבגים, DPA נשאב לתוך ליבת נבג תמורת מים. המקיף את הליבה הוא קרום נבג פנימי שבו, רוב החיידקים ויוצרים נבג, הקולטנים אשר מזהים את המולקולות הקטנות המעודדות נביטה (germinants) ממוקמים 2. ממוקם ממש מחוץ הקרום הפנימי של הנבג היא שכבה של פפטידוגליקן דופן תא. שכבת פפטידוגליקן מיוחדת (קורטקס) המקיפה את פפטידוגליקן דופן תא והוא מורכב רב של אותם הרכיבים כמו פפטידוגליקן דופן תא [לסירוגין N-acetylglucosamine (נאג) וחומצת N-acetylmuramic (NAM)]. עם זאת, כ -50% של שאריות NAM בקליפה הומרו muramic-δ-לקטם 5,6 . במהלך נביטת נבג, שאריות muramic-δ-לקטם אלה מוכרות על ידי האנזימים הממסים קליפת נבג (SCLEs), ובכך מאפשרות את הקליפה להיות מושפלת (תהליך חיוני כדי להשלים נביטה) אבל לא את דופן התא. המקיף את הקליפה הוא קרום חיצוני וכמה שכבות של מעייל חלבונים 2.

שליטה על תהליך הנביטה היא חשובה ביותר עבור חיידקים יוצרי נבגים. נביטה מופעלת כאשר קולטנים germinant אינטראקציה עם germinants שלהם 2. אצל חיידקים רבים יוצרי נבגים, germinants אלה הם חומצות אמינו, סוכרים, נוקלאוטידים, יונים או צירופם של אלה 2. ג נביטת נבג difficile היא שיזמה שילובים של חומצות מרות מסוימות, [למשל, חומצת taurocholic (ת"א)] וחומצות אמינו (למשל, גליצין) 7-10. אמנם יש הבדלים בין ג מסלול נביטת difficile ואת המסלולים למדו אחרים נבג יוצריםחיידקים, כגון B. subtilis, משותף לכל הוא הדרישה ההכרחית כדי לבזות את קליפת הנבג לאפשר תא צמח לצמוח מן הנבג ניבט 2,8. השפלה Cortex ניתן להשיג על ידי SCLEs CwlJ / SleB (כפי שנמצאו ב subtilis) או SleC (כפי שנמצאו רבים וקלוסטרידיאה.את). הידרוליזה Cortex מפחיתה את המגבלה על קיר התא לבין הנבג. זה מאפשר התייבשות ליבה מלאה, צעד הכרחי בהפעלה מחדש של רבים מן החלבונים דרושים חילוף חומרים תאיים 2.

כאשר נבגים לנבוט, שינויי הנבג הרדומים ממצב שלב בהיר למצב שלב כהה ותהליך זה יכול להימדד על ידי שינוי הצפיפות אופטית (OD) ב 600 ננומטר 11. דו"ח קודם מצביע על כך הרבה מהשינוי הזה ב OD הוא עקב השחרור של DPA מן הנבג 12. במהלך מחקר שנערך לאחרונה שלנו, ביקשנו להשוות עיתוי ג נביטת נבג difficile וליוותה אתשחרורו של שברי DPA ואת קליפת 9. במחקר זה היה חיוני כדי לפקח על שחרורו של שברי קליפה כשהחלו להתפרסם על ידי נובטי נבגים.

את assay colorimetric משמש כאן התבסס על שיטה לאיתור סוכרים עם קצות צמצום שפותח Ghuysen et al. 13. מכיוון אחרים תיארו פרוטוקולים לצורך זיהוי של סוכרים הפחתת 14 או שינית אותם פרוטוקולים 15, בספרות העוסקת בנושא זה יכול להיות מבלבל. כאן, אנו בפירוט צעד-אחר-צעד שיטה לאיתור colorimetric הפחתת סוכרים ששוחרר נובטת ג נבגי difficile. למרות מחקר זה משתמש ג נבגי difficile, סוכרי הצמצום שפורסמו במהלך הנביטה של נבגים מחיידקים אחרים להרכיב נבג מסוגלים להתגלות עם פרוטוקול זה 9,16,17.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. דוגמאות יצירה

  1. מחממים להפעיל ג difficile נבגים על 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולאחסן על הקרח.
    הערה: ג נבגי difficile ניתן לייצר וטהר כפי שתוארו לעיל 7,9,10.
  2. הכן את הפתרון הנביטה ב X + 1 מ"ל כאשר X הוא מספר דגימות להילקח במהלך assay.
    הערה: פתרון הנביטה הוא ספציפית המינים של חיידקי Spore נלמדים. עבור assaying ג הנביטה נבג difficile, השתמשנו פתרון של 10 מ"מ טריס (pH 7.5), 150 מ"מ NaCl, 100 גליצין מ"מ ו -10 מ"מ חומצה taurocholic במים deionized.
  3. לפני תחילת assay, לצייר מדגם 1.0 מיליליטר של פתרון הנביטה ללא נבגים לשמש ריק לגילוי שבר בקליפת המוח.
  4. להוסיף נבגים ל OD 600 של ~ 3.0 לפתרון נביטת המערבולת במהירות.
    הערה: מחקרי הנביטה שלנו ב subtilis, השתמשנו באותן OD 600 נבגים ובאשר ג difficile.
    הערה: סכום זה של נבגים עבד טוב לשחרור שבר בקליפת ניטור במהלך C. נביטת נבג difficile. כמות הנבגים המשמשת assay זה צריכה להיקבע באופן ניסיוני עבור כל חיידק או זן.
  5. הסר מדגם 1.2 מ"ל מיד לאחר הוספת הנבגים צנטריפוגות בטמפרטורת החדר למשך דקות 1 ב 14,000 × גרם. זוהי נקודת אפס הזמן.
  6. העבר 1.0 מיליליטר של supernatant מן המדגם centrifuged לצינור טרי לניתוח שבר בקליפה שלאחר מכן.
    הערה: האם DPA צריך להיות פיקוח, להסיר מדגם נפרד 100 μl לצורך זיהוי של DPA בתמיסה באמצעות assay המבוסס על הקרינה terbium 9,18,19.
  7. להקפיא את המדגם נאספו ב -80 מעלות צלזיוס.
  8. חזור על שלבי 1.4 ו -1.5 במרווחים קבועים עד בכל נקודות הזמן הושלמו.
    הערה: בגלל הזמן הדרוש צנטריפוגה ודגימה, מועדים לפי שעון ה פחות2 דקות זה מזה לא היו אפשריות במהלך ההליך שלנו, כך מרווחי הדגימה שלנו היו פעם כל 2 דקות במשך 14 דקות.
  9. כביקורת חיובית להפחתת סוכר איתור וכימות, כוללים את הסכומים הבאים של N -acetylglucosamine (nmol): 0, 12.5, 25, 50, 100, 250, 500, ו -5,000. הכן דגימות אלה בעת ובעונה אחת כמו דגימות קליפה ולהפעיל יחד עם דגימות הקליפה כך עקום הסטנדרט רלוונטי הנתונים שעלו נבט נבגים.
  10. אחרי הכל דגימות נקודת הזמן נאספים, Lyophilize הדגימות.
    הערה: אנו lyophilized דגימות שלנו צינורות 2 מ"ל בורג מכסה.

2. מדידת Cortex שברי

  1. Resuspend דגימות lyophilized ב 120 μl של 3 N HCl השלימו עם פנול 1% ו -0.5% β-mercaptoethanol.
  2. העברת דגימות resuspended לצינורות בורג מכסה 2 מ"ל.
    הערה: שחזור, להבטיח שכל המדגם lyophilized הוא resuspended והועבר.
  3. דגירת הדגימות באמבט מים הסירקולציה המחודשת על 95 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.
  4. לאחר דגירה, מניח את הדגימות על קרח עד שהם מגניבים.
  5. לנטרל את הדגימות עם 120 μl של 3 M NaOH.
  6. הוסף 80 μl של פתרון סודיום ביקרבונט רווי 80 μl של פתרון אנהידריד אצטית 5% לטעום כל מערבולת.
  7. דגירה דגימות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
  8. העברת הדגימות חזרה באמבט מי C ° 95 בדיוק 3 דקות.
    הערה: שלב זה הוא זמן פעמים רגישות יותר יכולות להשפיע על התפתחות אות במורד זרם.
  9. הסר דגימות מן האמבטיה במים מגניב על קרח.
  10. להוסיף 400 μl של 6.54% K 2 B 4 O 7 · 4H 2 O כדי צינור כל מערבולת.
  11. דגירת הדגימות באמבט מים הסירקולציה המחודשת ב 95 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות בדיוק.
    הערה: שלב זה הוא זמן פעמים רגישות יותר יכולות להשפיע על התפתחות אות במורד זרם.
  12. לְהַסִירהדגימות ומניחות על קרח למשך 5 דקות.

3. צבע מגיב

  1. בעוד דגימות הן על קרח (שלב 2.12), להכין את מגיב הצבע. ממיסים 0.320 גרם של p -dimethylaminobenzaldehyde (DMAB; מגיב של ארליך) ב 1.9 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית.
    הערה: מגיב זמן, טמפרטורה רגישה לאור ולא צריך להיעשות מראש.
  2. לאחר DMAB מתמוסס לחלוטין, להוסיף 100 μl של 10 N HCl ו מערבולת.
  3. הוסף 5 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית מערבולת.

4. תגובת מדד-צבע

  1. העברת 100 μl של כל מקורר מדגם קליפת לצינור 1.5 מ"ל microcentrifuge חדש.
  2. הוסף 700 μl של פתרון צבע טרי מוכן מדגם זה.
  3. מיד להעביר את דגימות באמבט מים 37 ° C ו דגירה של בדיוק 20 דקות.
  4. העבר 200 μl של כל דגימה לצלחת 96-גם ברורה.
  5. לכמת את הדגימות ב 585 ננומטר על צלחתקוֹרֵא. דוגמאות צריכות להתחיל בכל צבע צהוב תגובה חיובית תעבור לסגול. ככל נוכחי הקליפה, הצבע הסגול העמוקה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טבלת 1 מראה תוצאות אופייניות באמצעות סטנדרטים נאג. נתונים משמשים ליצירת עקומה סטנדרטית. טבלה 2 מראה תוצאות אופייניות מתוך assay נביטה במאגר נביטה בתוספת 100 גליצין מ"מ ו -10 המ"מ ת"א (תנאים לקידום נביטה) או 100 גליצין מ"מ בלבד (תנאים שאינם נובטים). בהעדר ת"א, ג נבגי difficile לא לנבוט ויש שינוי קטן בנוכחות שברת קליפה בתמיסה. עם זאת, בנוכחות שני ת"א גליצין, ג נבגי difficile לנבוט ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

על הגירוי, נבגים עוברים תהליך הנביטה לאבד התכונות העמידות שלהם ללא צורך סינתזת macromolecular. כאשר נביטת נבג מופעלת, ליבת הנבג משחררת DPA תמורת מים 2. בשל תכולת DPA הגבוהה של הנבג הרדום, ליבת הנבג היא בלחץ האוסמוטי אינטנסיבי ואת פפטידוגליקן המיוחד, קליפה, עוזר למנוע את הליבה של נפיחות המבצע במשחק, ככל הנראה, כמחסום רחב 2.

השיטה המתוארת לעיל משתמשת מגיבה של ארליך (פתרון צהוב) כדי לזהות את נו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרויקט המתואר נתמך על ידי מספר הפרס 5R01AI116895 מהמכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות או מכוני בריאות הלאומיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2.0 מ"ל צינור כובע בורגארה"ב מדעי1420-3700
p1000 צינור אפנדורףאפנדורף
p200 צינור אפנדורףאפנדורף
p20 פיפט אפנדורףאפנדורף
100 - 1,250 & #956; l טיפים לפיפטVWR89079-486
1 - 200 & #956; ll pipt tipsVWR89079-458
N-acetyl-D-glucosamineSigmaA3286-25G
חומצה הידרוכלורית - 10 NBDH-AristarBDH3032-3.8LP
אצטי אנהידרידאלפא AesarL04295
נתרן ביקרבונטBDHBDH0280-500G
אשלגן טטרבוראט טטרהידרטאלפא אסאר39435
נתרן הידרוקסידBDHBDH8019-500G
4-(דימתיל-אמינו) בנזלדהידסיגמא156477-100 גרם
פנול רוויפישרBP1750-400
2-מרקפטואתנולאולדריץ'M6250-100ML
SpectraMax M3מכשירים
חומצה אצטית, קרחוןBDHBDH3098-3.8LP
אמבט מים מחומם, במחזורVWR דגם מדעי1136
מיקרו-טסט 96פלקון35307296 צלחות תרבית רקמות שקופות היטב
צינורות תרביתVWR89000-506
מכונת
מולקולריים מערבולת בלוקי חום ליופילייזר

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Al-Hinai, M. A., Jones, S. W., Papoutsakis, E. T. The Clostridium sporulation programs: diversity and preservation of endospore differentiation. Microbiol Mol Biol Rev. 79, 19-37 (2015).
  2. Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. J Bacteriol. 196, 1297-1305 (2014).
  3. Tan, I. S., Ramamurthi, K. S. Spore formation in Bacillus subtilis. Environ Microbiol Rep. 6, 212-225 (2014).
  4. Fimlaid, K. A., Shen, A. Diverse mechanisms regulate sporulation sigma factor activity in the Firmicutes. Curr Opin Microbiol. 24, 88-95 (2015).
  5. Popham, D. L., Helin, J., Costello, C. E., Setlow, P. Analysis of the peptidoglycan structure of Bacillus subtilis endospores. J Bacteriol. 178, 6451-6458 (1996).
  6. Atrih, A., Zollner, P., Allmaier, G., Foster, S. J. Structural analysis of Bacillus subtilis 168 endospore peptidoglycan and its role during differentiation. J Bacteriol. 178, 6173-6183 (1996).
  7. Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. Bile salts and glycine as cogerminants for Clostridium difficile spores. J. Bacteriol. 190, 2505-2512 (2008).
  8. Paredes-Sabja, D., Shen, A., Sorg, J. A. Clostridium difficile spore biology: sporulation, germination, and spore structural proteins. Trends Microbiol. 22 (7), (2014).
  9. Francis, M. B., Allen, C. A., Sorg, J. A. Spore cortex hydrolysis precedes DPA release during Clostridium difficile spore germination. J Bacteriol. 197 (14), (2015).
  10. Francis, M. B., Allen, C. A., Shrestha, R., Sorg, J. A. Bile acid recognition by the Clostridium difficile Germinant Receptor, CspC, is important for establishing infection. PLoS Pathog. 9, e1003356(2013).
  11. Moir, A., Smith, D. A. The Genetics of bacterial spore germination. Annu. Rev. Microbiol. 44, 531-553 (1990).
  12. Zhang, P., Kong, L., Wang, G., Setlow, P., Li, Y. Q. Combination of Raman tweezers and quantitative differential interference contrast microscopy for measurement of dynamics and heterogeneity during the germination of individual bacterial spores. Journal of biomedical optics. 15, 056010(2010).
  13. Ghuysen, J. -M., Tipper, D. J., Strominger, J. L. Enzymes that degrade bacterial cell walls. Methods Enzymol. 8, 685-699 (1966).
  14. Park, J. T., Johnson, M. J. A submicrodetermination of glucose. J Biol Chem. 181, 149-151 (1949).
  15. Thompson, J. S., Shockman, G. D. A modification of the Park and Johnson reducing sugar determination suitable for the assay of insoluble materials: its application to bacterial cell walls. Anal Biochem. 22, 260-268 (1968).
  16. Paredes-Sabja, D., Setlow, P., Sarker, M. R. SleC is essential for cortex peptidoglycan hydrolysis during germination of spores of the pathogenic bacterium Clostridium perfringens. J Bacteriol. 191, 2711-2720 (2009).
  17. Paredes-Sabja, D., Sarker, M. R. Effect of the cortex-lytic enzyme SleC from non-food-borne Clostridium perfringens on the germination properties of SleC-lacking spores of a food poisoning isolate. Can J Microbiol. 56, 952-958 (2010).
  18. Hindle, A. A., Hall, E. A. Dipicolinic acid (DPA) assay revisited and appraised for spore detection. The Analyst. 124, 1599-1604 (1999).
  19. Kort, R., et al. Assessment of heat resistance of bacterial spores from food product isolates by fluorescence monitoring of dipicolinic acid release. Appl Environ Microbiol. 71, 3556-3564 (2005).
  20. Elson, L. A., Morgan, W. T. A colorimetric method for the determination of glucosamine and chondrosamine. The Biochemical journal. 27, 1824-1828 (1933).
  21. Ramirez, N., Abel-Santos, E. Requirements for germination of Clostridium sordellii spores in vitro. J. Bacteriol. 192, 418-425 (2010).
  22. Akoachere, M., et al. Indentification of an in vivo inhibitor of Bacillus anthracis spore germination. J. Biol. Chem. 282, 12112-12118 (2007).
  23. Duncan, C. L., Strong, D. H. Improved medium for sporulation of Clostridium perfringens. Appl Microbiol. 16, 82-89 (1968).
  24. Heffron, J. D., Lambert, E. A., Sherry, N., Popham, D. L. Contributions of four cortex lytic enzymes to germination of Bacillus anthracis spores. J Bacteriol. 192, 763-770 (2010).
  25. Meador-Parton, J., Popham, D. L. Structural analysis of Bacillus subtilis spore peptidoglycan during sporulation. J Bacteriol. 182, 4491-4499 (2000).
  26. Lambert, E. A., Popham, D. L. The Bacillus anthracis SleL (YaaH) protein is an N-acetylglucosaminidase involved in spore cortex depolymerization. J Bacteriol. 190, 7601-7607 (2008).
  27. Wang, S., Shen, A., Setlow, P., Li, Y. Q. Characterization of the Dynamic Germination of Individual Clostridium difficile Spores Using Raman Spectroscopy and Differential Interference Contrast Microscopy. J Bacteriol. 197, 2361-2373 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Clostridium difficileN acetylglucosamine

מאמרים קשורים