Method Article

פיתוח תאיים תלת ממד Organotypic דגם של אדם המעיים הריריים Grown במיקרוגרבטיציה

DOI:

10.3791/54148

⸱

July 25th, 2016

 ,  , 
1Center for Vaccine Development, Department of Pediatrics, University of Maryland School of Medicine, 2Mucosal Immunology and Biology Research Center, Massachusetts General Hospital for Children

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאים הגדלים בסביבה תלת-ממדי (3-D) מייצגים שיפור ניכר לעומת טיפוח התא בסביבות 2-D (למשל, צלוחיות או מנות). כאן אנו מתארים את הפיתוח של מודל organotypic 3-D רב-תאיים של רירית המעי אדם מתורבת במיקרוגרבטיציה הניתנים על ידי החלפה-קיר-כלי (RWV) bioreactors.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מכיוון תאים הגדלים בסביבה תלת-ממדי (3-D) יש פוטנציאל לגשר על פערים רבים בטיפוח התא בסביבות 2-D (למשל., צלוחיות או מנות). למעשה, זה זוכה להכרה רחבה כי תאים שגודלו צלוחיות או מאכלים נוטים דה להבדיל ולאבד תכונות מיוחדות של הרקמות שמהם הופקו. נכון לעכשיו, יש בעיקר שני סוגים של מערכות תרבות 3-D שבו התאים הם זורעים לתוך פיגומים מחקו את תאי מטריקס הילידים (ECM): (א) מודלים סטטיים (ב) מודלים באמצעות מתקני גידול. פריצת הדרך הראשונה הייתה 3-D מודלים סטטיים. מודלי 3-D באמצעות מתקני גידול כגון קיר-סיר המסתובב (RWV) bioreactors הם התפתחות מאוחרת יותר. הרעיון המקורי של bioreactors RWV פותחה במרכז החלל ג'ונסון של נאס"א בתחילת 1990 והוא האמין להתגבר על המגבלות של מודלים סטטיים כגון פיתוח של חוסר חמצן, ליבות נמקי. Bioreactors RWV עלול לעקוף הבעיה על ידי מתן דינמיקה של נוזלים המאפשרות דיפוזיה של חומרים מזינים וחמצן היעיל. הגידול האלה מורכב בסיס מסובב המשמש לתמיכה ולסובב בשני פורמטים שונים של כלי תרבות שונות לפי סוג מקור האוורור שלהם: (1) איטי כלי Lateral מפנה (STLVs) עם oxygenator קואקס במרכז, או (2 כלי יחס ממדים גבוהים) (HARVs) עם חמצון באמצעות קרום העברת גז שטוח, גומי סיליקון. כלים אלה מאפשרים מעבר של גז יעיל תוך הימנעות היווצרות בועה והטורבולנטיות סוגרת. תנאים אלה לגרום זרימה למינרית וכוח גזירה מינימלי שמודלים מופחת הכבידה (כבידה) בתוך כלי התרבות. כאן אנו מתארים את הפיתוח של מודל organotypic 3-D רב-תאיים של רירית המעי האנושית המורכבת קו תא אפיתל מעי לימפוציטים אדם מן המעלה ראשון, תאי האנדותל פיברובלסטים מתורבתים במיקרוגרבטיציה שמספק bioreactor RWV. </ P>

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פריצת הדרך הראשונה בבניית מודל 3-D מדווח מוקדם של 1980, כאשר מדענים החלו לחקור סוגים שונים של הפיגום (למשל., Laminin, אני סוג קולגן, קולגן IV, ו פיברונקטין) וקוקטיילים של גורמי גדילה כדי לשפר תא אל תא אינטראקציות ECM של "סטטי" 3-D מודלי 1-7. מאז, הבעיה העיקרית עם המודלים האלה כבר מגבלות בהעברת חומרי מזון וחמצן בתוך מבנים בינוני ורקמות 8. בניגוד תאים בסביבה vivo שמקבלת זרימה קבועה של חומרי מזון וחמצן מן סובבי רשתות של כלי דם, האופי סטטי של מודלים אלה מעכב את ההפצה היעילה של אותם התאים. לדוגמה, אגרגטים התא שנוצר במודלים במבחנה סטטי החורגות כמה מילימטרים בגודל תמיד יפתחו היפוקסי, לי....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הצהרת אתיקה: כל דגימות הדם נאספו מתנדבים שהשתתפו מספר פרוטוקול HP-00,040,025-1. האוניברסיטה של ​​דירקטוריון סקירה המוסדית מרילנד פרוטוקול שאושר זה והסמיך את אוסף דגימות דם ממתנדבים בריאים עבור המחקרים כללו בכתב היד הזה. מטרת מחקר זה הוסבר מתנדבים, וכל המתנדבים נתן הודיע, חתמו הסכמה לפני לקיחת הדם.

הערה: ראה טבלה 1 להכנת תוספת בינונית. ראה טבלה 2 לעריכת התקשורת והתרבות 3-D.

1. הכנת כלי תרבות

  1. פתח....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש לנו בעבר מהונדס מודל רב-תאי 3-D organotypic של רירית המעי האנושית המורכבת של שורת תאי אפיתל מעי לימפוציטים אדם מן המעלה ראשון, תאי האנדותל פיברובלסטים בתרבית בתנאים כבידה 24 (איור 1). פיברובלסטים ותאי אנדותל היו מוטבעים קולגן אני מטריקס מועשר חלבונים בממברנה במרתף במעיים נוסף 45 (כלומר., Laminin, קולגן IV, פיברונקטין סולפט הפרין proteoglycan) והוסיפו RWV bioreactors. אחרי 10 - 15 ימים, ניתוח מכתים .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בכתב היד הזה, אנו מתארים את הפיתוח של מודל bioengineered של רירית המעי האנושי מורכב של סוגי תאים בכפולות כולל לימפוציטים אדם מן המעלה הראשונה, פיברובלסטים, ותאי אנדותל, וכן 24 שורות תאים אפיתל במעי. ב 3-D מודל זה, הם תאים בתרבית בתוך תאי מטריקס עשיר קולגן בתנאים כבידה 24.

כפי שתואר קודם לכן, את המאפיינים העיקריים של מודל זה הם: (i) את היכולת לחקות ארגון בשכבת רקמות אפיתל,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי הוגשה בקשת פטנט לא זמנית בארה"ב במשרד הפטנטים וסימני המסחר של ארה"ב (מספר: 13/360,539).

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה, בחלקה, על ידי מענקי המחקר הפדרליים של NIAID, NIH, DHHS R01 AI036525 ו-U19 AI082655 (CCHI) ל-MBS ועל ידי DK048373 מענקים של NIH ל-AF. התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות או המכונים הלאומיים לבריאות.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ביו-ריאקטור מרובע מסובב / כלי קיר מסתובב עצמאי (RWV) SyntheconRCCs-4DQעבור עד 4 כלי שיט. ניתן להשיג גם דגמים עם כלי שיט פחות או יותר.
SyntheconD-405חד פעמית בכלי 50 מ"לעם 4 כלים
HCT-8 תאי אפיתל ATCCCCL-244
CCD-18Co פיברובלסטים ATCCCRL-1459
תאי אנדותל וריד טבורי אנושיATCCCRL-1730HUVEC
גורם גדילה פיברובלסטים-בסיסי סיגמאF0291bFGF
גורם תאי גזע סיגמאS7901SCF
מקדם גדילת הפטוציטים SigmaH1404HGF
Endothelin 3SigmaE9137
LamininSigmaL2020מבודד מעכבר Engelbreth-Holm-Swarm גידול
גדילה אנדותל כלי דם סיגמאV7259VEGF
גורם מעכב לוקמיה סנטה קרוזsc-4377(LIF
אדניןסיגמאA2786
אינסוליןסיגמא6634
3,3',5-טריודו-L-תירונין SigmaT-6397T3
Cholera ToxinSigmaC-8052
FibronectinBD354008מבודד מפלזמה אנושית
apo-transferrinSigmaT-1147
HeparinSigmaH3149
Heparan sulfate  proteoglycanSigmaH4777מבודד מקרום הבסיס של העכבר  גידול Engelbreth-Holm-Swarm
קולגן IVSigmaC5533מבודד משליה אנושית
סרום בקר עוברי מומת בחום Invitrogen10437-028
D-MEM, אבקהInvitrogen12800-017
10% פורמלין– PBS פישר סיינטיפיקSF100-4
קולגן בקר מסוג I InvitrogenA1064401
Trypsin-EDTA פישר סיינטיפיקMT25-052-CI
נתרן פירובטInvitrogen11360-070
גנטמיצין Invitrogen15750-060
פניצילין/סטרפטומינצין Invitrogen15140-122
L-GlutamineInvitrogen25030-081
HepesInvitrogen15630-080
Ham's F-12Invitrogen11765-054
Basal MediumEagle Invitrogen21010-046BME
RPMI-1640Invitrogen11875-093
אנדותל בסיסי בינוניLonzaCC-3156EBM-2
תוסף צמיחת תאי אנדותלMillipore02-102ECGS
קופסת גורם

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aumailley, M., Timpl, R. Attachment of cells to basement membrane collagen type IV. J Cell Biol. 103, 1569-1575 (1986).
  2. Buset, M., Winawer, S., Friedman, E. Defining conditions to promote the attachment of adult human colonic epithelial cells. In Vitro Cell ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Intestinal MucosaMicrogravity CultureRotating Wall Vessel3D Organotypic ModelMulticellular CultureCollagen Gel PreparationCell Isolation TechniqueDual Syringe MethodHistological EmbeddingVillus like Features

Related Articles