הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הזרקת intracerebroventricular ו intravascular של חלקיקים נגיפיים ו פלורסנט microbeads לתוך המוח בילוד

24.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54164

⸱

24 ביולי 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Regenerative & Infectious Pathology, Hamamatsu University School of Medicine, 2First Department of Medicine, Hamamatsu University School of Medicine, 3Faculty of Health Science, Tokoha University

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה של הזרקה תוך חדרית ותוך וסקולרית של חלקיקים נגיפיים או מיקרו-חרוזים פלואורסצנטיים למוח העכבר היילוד. ניתן לזהות את דפוס הלוקליזציה של הנגיף והננו-חלקיקים על ידי הערכה מיקרוסקופית או על ידי הכלאה באתר.

תקציר

במחקר על בפתוגנזה של דלקת מוח ויראלית, שיטת ההדבקה היא קריטית. הראשון מבין שני מסלולי זיהומיות העיקריים למוח הוא הדרך hematogenous, הכוללת זיהום של תאי האנדותל pericytes של המוח. השני הוא intracerebroventricular המסלול (ICV). לאחר מכן, בתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS), וירוסים עלולים להתפשט בחלל תת-העכבישים, קרומי המוח, ואת המקלעת דמתה עין באמצעות נוזל השדרה. במודלים ניסיוניים, בשלבים המוקדמים של ההפצה ויראלית CNS אינם מתאפיינים גם, ולא ברור אם תאים מסוימים רק בתחילה נגועים. הנה, יש לנו ניתחו את חלוקת ציטומגלווירוס (CMV) חלקיקים בשלב החריף של זיהום, כינה viremia העיקרי, בעקבות ICV או intravascular (IV) הזרקה לתוך המוח עכבר בילוד. במודל הזרקת ICV, 5 μl של murine CMV (MCMV) או microbeads פלורסנט הוזרקו החדר לרוחב בבית midpoiNT בין העין לאוזן באמצעות מזרק 10 μl עם מחט 27 G. במודל הזרקה IV, מזרק 1 מ"ל עם מחט 35 G היה בשימוש. Transilluminator שמש כדי להמחיש את הווריד (פנים) הזמני השטחי של העכבר בילוד. אנו חדורים 50 μl של MCMV או microbeads פלורסנט לווריד הזמני השטחי. המוח נקצרו בנקודות זמן שונות לאחר ההזרקה. הגנום MCMV התגלו באמצעות שיטת הכלאה באתרו. microbeads פלורסנט או חלבון פלואורסצנטי ירוק להביע חלקיקי MCMV רקומביננטי נצפה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. טכניקות אלה ניתן ליישם פתוגנים רבים אחרים לחקור בפתוגנזה של דלקת קרום המוח.

מבוא

כאשר לומדים אנצפליטיס ויראלי, חלוקת הראשונית של חלקיקים נגיפיים מאוד חשוב להבין בהיווצרות המחלה ולזהות מטרות ויראלי במוח. רוב הווירוסים טווח בגודל מ 20 כדי 300 ננומטר, למרות Pandoravirus הוא יותר מ -700 ננומטר בגודל 1. התפלגות החלקיקים הנגיפיים בשלב החריף של זיהום עלולה תלוי בגודל של החלקיקים, החלוקה קולטנית תאים, או הזיקה של קולטני התאים לאיתור וירוסים. במודלים של בעלי חיים, intracerebroventricular (ICV), intraperitoneal, שליה ישיר, ו תוך ורידי (IV) זיהומים שימשו ללמוד בפתוגנזה של דלקת המוח ויראלית. חיסון עם וירוס ICV משמש לעתים קרובות כדי להקים מערכת העצבים המרכזית (CNS) זיהומים בעכברים. מחקרים שעשה שימוש בטכניקה זו לדווח זיהום נפוץ, במיוחד של תאי אזורי periventricular וב האזורים במוח בקשר ישיר עם הנוזל השדרתי (CSF), similar להשפעות של ventriculoencephalitis ויראלי. גודלו הקטן של וירוס adeno הקשורים (AAV) חלקיקים (20 - 25 ננומטר בקוטר) הופך לפשוט תפוצתם בכל חלקי המוח זיהומים ICV 2-4. Intraperitoneal 5, שלית 6 ישירה, וזריקות IV 7 לייצג ממשל מערכתי hematogenic. חדירת חלקיקים נגיפיים דרך מחסום הדם-מוח (BBB) ​​מאפשר להם להגיע parenchyma של המוח בילוד, המייצג גושים microglial מפוזר 8,9.

ציטומגלווירוס (CMV) הוא וירוס נפוץ שייך למשפחת וירוס ההרפס. בארצות הברית, 50% - 80% מהאנשים היו זיהום CMV לפי גיל 40. זיהומי CMV הם לעתים רחוקות מזיקים אבל יכולים לגרום למחלות בחולים ועוברים מדוכאי חיסון. מכלל הלידות, 0.2% - 2% נולדים עם CMV 10, וכתוצאה מכך תופעות חמורות כגון מיקרוצפליה, הסתיידות periventricular, hypoplasia המוח הקטן, micrדלקת העין, ואת עצב הראייה ניוון 11,12. יתר על כן, פיגור שכלי, איבוד שמיעה עצבי, פגמים חזותיים, התקף, אפילפסיה להתרחש כ -10% של אי-אנושות תינוקות CMV נגוע 13,14. תפקוד לקוי של מערכת העצבים המרכזית היא סימפטום אופייני הנפוצים ביותר של האנומליה המולדת CMV. עוד ילדים הם נכים לכל החיים בכל שנה על ידי CMV מולד מאשר תסמונת דאון, תסמונת אלכוהול עוברית, או ספינה ביפידה 15. אין חיסון נגד CMV זמין על ההווה, קוראת צורך של חיסון בטוח ויעיל. לימוד האינטראקציה של חלקיקי CMV עם קולטנים שלהם בשלב המוקדם של זיהום חשוב להבין את ההשפעה של החיסון.

Ventriculoencephalitis גושים microglial מפוזר הם שני מאפיינים פתולוגיים הראשי של CMV דלקת המוח 16. זה כבר לא ברור כיצד חלקיקי CMV (150 - 300 ננומטר) להפיץ דרך המוח בשלב החריף של זיהוםnd איך חלוקת קולטנים הסלולר זיקתם וירוסים תורמים להתפשטות ויראלית. קוואסאקי et al. הערך ICV ו- IV זיהומים מנקודת המבט של ההפצה של חלקיקים הקולטנים שלהם (integrin β1) בשלב המוקדם של זיהום. מצאנו כי הפצת חלקיקי CMV ואת הביטוי של integrin β1 מתואמת היטב בשלב המוקדם של זיהום בשני ICV ו- IV זיהומי 8. זיהום ICV הוא מודל של ventriculoencephalitis וזיהום IV הוא מודל של גושי microglial מפוזרים. לימוד הדינמיקה של חלקיקים נגיפיים או פלורסנט ייתן מידע שימושי על השפעת גודל החלקיקים, אינטראקציות ויראלי עם קולטני התאים, ואת מנגנון החדירה BBB במוח. הפרוטוקול הבא יכול לשמש כדי לחקור כל זיהום ויראלי וקטור ויראלי של מערכת העצבים המרכזי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל פרוטוקולי הניסוי אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים של Hamamatsu אוניברסיטת בית הספר לרפואה.

1. הכנת MCMV (זן סמית) ו רקומביננטי M32 משופרת חלבון פלואורסצנטי ירוק (EGFP) -MCMV

  1. צור רקומביננטי M32-EGFP-MCMV לפי השיטה כדלקמן (1.2 - 1.9) ו כפי שתואר לעיל 8.
  2. השתמש וירוסים רקומביננטי נגזרו הזן סמית של wild-type MCMV (מספר הצטרפות: U68299). הכנס EGFP (4361 זוגות בסיסים; נ"ב) בין 37,089 ו 41,450 נ"ב (M32 - מוקד M31) בגנום MCMV ידי רקומבינציה הומולוגיים.
  3. להגביר ידי תגובת שרשרת פולימראז M32 MCMV (41,450 - 39,286 נ"ב, עזב איגוף רצף M31 (37,089 - 39,246 נ"ב, נכון איגוף לוקוסים הגן רצף באמצעות פריימרים הבאים: M32, 5'-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 '(קדימה פריימר), 5 '-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 "(לאחור תחל); M31, 5'-CTAAATTAACTTAAGTCGTCCTCTTCGTCTCACAA-3 '(קדימה פריימר), 5'-AACTAGTCTAGATCGCTCCTGGTTGGTTTTTA-3' (פריימר הפוכה).
  4. הכנס את הלוקוס M32 לתוך וקטור להביע EGFP באמצעות אתרי הגבלה NheI ו BamHI. הכנס את הלוקוס M31 לתוך-EGFP M32 -recombinant פלסמיד בשימוש באתרי AflII ו XbaI. קליב M32 - EGFP - רצף M31 עם NheI ו AflII מן M32 - EGFP - פלסמיד רקומבינציה M31 ו להתמוסס H 2 O.
  5. Transfect לבנות ביקע לתוך הגרעינים של MCMV (זן סמית) -infected תאי NIH3T3 24 שעות לאחר ההדבקה (HPI) באמצעות מערכת electroporation לגרום הומולוגיים.
  6. בשעה 3 ימים לאחר הפגיעה, שיתוף התרבות התאים עם פיברובלסטים עובריים בעכבר נגוע (MEFs) ביחס של 1 / 1,000 בשישה-גם צלחות ומסך עבור מוקדים להביע EGFP של תאים נגועים.
  7. הארווירח supernatants המכיל וירוס המבארות המכילות מוקדים פלואורסצנטי ירוקים לדלל פי עשרה. עבור טיהור, לבחור בארות המציגים מוקדים פלואורסצנטי ירוק בודד.
  8. כאשר כל מוקדי נובעי ביטוי EGFP תצוגת זיהום הגבלת הדילול, הכנת הווירוס היא טהורה, המציין כי לא וירוס wild-type נשאר. לכמת את הנגיף בשיטת פלאק-assay כפי שתואר לעיל 17.
  9. פנק MCMV בארונות בטיחות ביולוגיים מוסמכים ב biosafety ברמה 2 לובשים כפפות ומסכה.
  10. מעבר MCMV (זן סמית) ו MCMV רקומביננטי MEFs שהוכן 12 יום בן עוברי עכברים ICR כפי שתואר לעיל 17.
  11. הסרת תאים מן supernatants של תרבויות MEF נגוע על ידי צנטריפוגה ב g 3,000 × במשך 20 דקות ב 16 מעלות צלזיוס.
  12. Ultracentrifuge את supernatants במשך 40 דקות ב 70,000 × גרם. Resuspend את הכדורים המכילים virions ב 1 מיליליטר של תמיסת מלח טריס שנאגר ולהעביר על גבי ים לינארי preformedשיפוע orbitol (25% - 70%). Ultracentrifuge שוב 70,000 x גרם במשך 60 דקות 18.
  13. קציר את הלהקה המכיל virion עם מזרק. גלולת virions שנקטף על ידי צעד ultracentrifugation נוסף g 70,000 × במשך 40 דקות.
  14. Resuspend גלולה ב 1 מ"ל של תמיסת מלח פוספט שנאגרו (PBS) ולאחסן ב -80 ° C עד הניסויים זיהום.
  15. לכמת את כייל הנגיף בשיטת פלאק-assay כפי שתואר לעיל 19.
  16. דמיינו את הביטוי EGFP של חלקיקים MCMV רקומביננטי (עירור ב 489 ננומטר, פליטה ב 508 ננומטר) על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 1 א) ואת מבנה החלקיקים ידי מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים (TEM) 8 (איור 1 ב).

2. הכנת microbeads פלורסנט האדום הנילוס

  1. microbeads פלורסנט carboxyl רכישה הנילוס אדום ומקום 500 μl של microbeads לתוך צינורות פי קוטר (0.04- 0.06 מיקרומטר, כ 3.63 × 10 12 חלקיקים; 0.1 - 0.3 מיקרומטר, כ -5.75 × 10 10 חלקיקים; 1.7 - 2.2 מיקרומטר, כ 6.85 × 10 7 חלקיקים).
  2. פנקו חרוזים עם 500 μl של 0.1 M NaOH עבור כ 1 יום כדי להסיר כל אנדוטוקסינים ו resuspend את החרוזים מים סטריליים ב RT.
  3. לספוג את החרוזים O / N עם 10% העכבר בסרום שהתקבלו בעכברים C57BL / 6 ב RT לפני השימוש.
  4. כדי להפריד אגרגטים, מערבולת חרוזי sonicate ביסודיות לפני השימוש.

3. הזרקת ICV של microbeads MCMV ו פלורסנט לעכברים בילוד

  1. לשמור נורמלי בהריון עכברים ICR במתקן בקרת טמפרטורה תחת מחזור אור 12 שעות / חושך. הילודים מיועדים P 0.5 ביום הלידה.
  2. לעקר מזרק 10 μl ומחט 27 G עם אלכוהול 70%.
  3. טען הפתרון זריקה (5 μl) המכיל MCMV או מיקרו ניאוןחרוזים לתוך המחט על ידי משיכת הבוכנה בקפידה של המזרק.
  4. לרסן עכבר בילוד (P 0.5) על ידי הצבת העכבר על קרח למשך 3 - 4 דקות. לאחר שהחיה היא בהרדמה, השתמש בשיטת תגובת בוהן קמצוץ כדי לקבוע את עומק ההרדמה.
  5. סמן את הזריקה עם עט מעבדה רעיל בבאתר כ 0.7 - 1.0 מ"מ לרוחב תפר sagittal ו -0.7 - הזנב 1.0 מ"מ מן (איור 2 א) בילוד גבחת.
  6. הכנס את המחט 2 מ"מ עמוק, בניצב לפני השטח בגולגולת במקום הזרקה הניכר. לקבלת הפניה, לסמן 2 מ"מ מהקצה של מחט במכונית רעילה.
  7. לאט לאט להזריק 5 μl של MCMV (כ 5 × 10 5 PFU) לתוך החדר לרוחב מבלי לפתוח את הקרקפת (איור 2 ב).
  8. בקבוצה אחרת של עכברים, להזריק פתרון 5 μl המכיל microbeads פלורסנט (0.1 - 0.3 מיקרומטר, כ -5.75 × 10 8 חלקיקים) על ידיהשיטה זהה.
  9. לאט להוציא את המחט 10 - 20 שניות לאחר הפסקת תנועת הבוכנה כדי למנוע backflow.
  10. כדי לשחזר, לשמור על העכברים עבור 5 - 10 דקות במכל חם עד תנועה ואת ההיענות כללית משוחזרות.
  11. קציר את המוח כמפורט בסעיף 5 בטווח של נקודות זמן (3, 12, 24, 48, ו -72 שעות) לאחר הזרקה.

4. IV הזרקה של microbeads MCMV או פלורסנט לעכברים בילוד

  1. לרסן עכבר בילוד (P 0.5) על ידי הצבת העכבר על קרח למשך 3 - 4 דקות.
  2. השתמש מזרק 1 מ"ל עם מחט 35 G לבצע הזרקה תוך ורידית של MCMV ב P 0.5 בילודים.
  3. השתמש transilluminator (Finder וריד) כדי להמחיש את הווריד (פנים) הזמני השטחי. לפני ההזרקה, לאבטח את הילוד אל transilluminator באמצעות פלסטר (איור 2 ג).
  4. בזמן חבישת משקפי מגדלת (1.5x), להחדיר לאט 50 μl של MCMV (כ 5.45 ×; 10 9 חלקיקים) או microbeads פלורסנט (0.04 - 0.06 מיקרומטר, כ 3.63 × 10 11 חלקיקים; 0.1 - 0.3 מיקרומטר, כ -5.75 × 10 9 חלקיקים; ו -1.7 - 2.2 מיקרומטר, כ 6.85 × 10 6 חלקיקים) לווריד הזמני השטחי (איור 2 ד).
  5. לאחר הסרת המחט, השתמש גזה המכילה 70% אלכוהול כדי להפעיל לחץ על הזריקה עד שהדימום מפסיק.
  6. תן הילוד כ 5 דקות במיכל חם להתאושש לפני החזרתו לכלוב.
  7. קציר את המוח כמפורט בסעיף 5 בטווח של נקודות זמן (3, 12, 24, ו -72 שעות) לאחר ההזרקה.

5. הכנת דוגמאות מוח רקמות עבור סעיפי פרפין

  1. מניח את בילודים המוזרקים בצלחת פלסטיק קטנה על קרח כתוש.
  2. לאחר שהחיה היא בהרדמה, השתמש בשיטת תגובת בוהן קמצוץ כדי לקבוע את עומק anesthesIA.
  3. הפוך אחד קיצוצים בסוף מרכזיים או שניים בסוף אופקי דרך בית החזה כדי לפתוח את חלל בית החזה.
  4. ביצוע חתך באטריום במספריים חדים. להשרות 4% paraformaldehyde פתרון (PFA) אל המבואה. עצור זלוף כאשר תנועה ספונטנית (ריקוד PFA) ו-צבע התבהר של הכבד הם נצפו. אל ולגרום לדימום מחודש.
  5. לנתח הילוד (כפי שתואר לעיל 20) על ידי הסרת הראשון הראש בעזרת זוג מספריים.
  6. ביצוע חתך קו האמצע לאורך integument מהצוואר אל האף כדי לחשוף את הגולגולת.
  7. מניחים את הקצה החד של זוג מספריים איריס לתוך מגנום foramen בצד אחד, הזזה בזהירות לאורך המשטח הפנימי של הגולגולת.
  8. ביצוע חתך הארכה לקצה הדיסטלי של פני הגולגולת האחורית, ולעשות חתך זהה בצד הנגדי. לסלק את הגולגולת סביב המוח הקטן.
  9. בזהירות לקלף בחזרה את הגולגולת בצד אחד כדי למנוע נזק למוח. חזור על פעולה זוהליך בצד השני של המוח.
  10. בעזרת מרית, לנתק את נורות חוש הריח וקשרים עצבים על פני שטח הגחון של המוח.
  11. בעדינות להפריד בין המוח מהראש, זמירה כל דורה שעדיין לחבר את המוח לגולגולת באמצעות מספריים, ולהסיר את המוח.
  12. מניחים את המוח בבקבוקון של מקבע המכיל 4 PFA% לפחות 10 פעמים את נפח המוח למשך 24 שעות על 4 מעלות צלזיוס.
  13. מייבשים את רקמת דרך סדרה של אמבטיות אתנול מדורגים לעקור את המים, ולאחר מכן לחדור עם שעוות פרפין, ויצרו גוש. חותכים את גוש פרפין עם microtome לפרוסות 4 מיקרומטר 21 עבה.
  14. Deparaffinize ו רעננותם השקופיות של המוח הנגוע 22. המשך ב הכלאה באתרו עבור חלקים מוטבע פרפין.

6. הכנת דוגמאות מוח רקמות עבור חלקים קפואים

  1. הסר את המוח בעקבות הצעדים המפורטים ב 5.1 - 5.11.
  2. כדי לבחון את microbeads פלורסנט M32-EGFP-MCMV, למקם את המוח כריתה על cryomolds תחתית שטוחה. להוסיף הטבעה בינונית כדי לכסות את מדגם המוח לגמרי. הצמד להקפיא את cryomolds ב -hexane n precooled (-80 ºC), באמצעות מלקחיים להחזיק את שפת cryomolds לפני הצמדתו צ'אק.
  3. עבור חתך, לצרף את גוש הרקמה הקפואה על צ'אק cryostat precooled. מעבירים את הרקמה הקפואה עם צ'אק לתוך תא cryostat ולהפחית את הטמפרטורה ל -10 בין לבין -20 ° C, לחתוך את פרוסות כ 8 - 10 מיקרומטר 23 עבה.
  4. תקן את החלקים עם cytofixative (תערובת של אלכוהול איזופרופיל פוליאתילן גליקול) על ידי ריסוס. האוויר יבש החלק למשך 30 דקות ב RT מייד לאחר הריסוס, ולאחסן אותם ב - 80 ºC עד לשימוש נוסף.
  5. לאזן את החלקים בחזרה RT ולשטוף שלוש פעמים עם PBS.
  6. כתם בסעיפים עם isothiocyanate והעמסה (FITC) מצומדות Gsimplicifolia riffonia isolectin B4 בריכוז של 1: 100 עבור 10 דקות ב PBS ב RT (איור 5) או עם נוגדנים CD31 PE מצומדות בריכוז של 1: 100 במשך 30 דקות ב PBS ב RT (איור 6).
  7. שטפו את החלקים עם שלוש פעמים PBS.
  8. לאחר הכביסה, להכתים את החלקים עם 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) לדמיין גרעיני תאים. הר את הסעיפים מגיב אנטי לדעוך ותמונה DAPI (עירור ב 345 ננומטר, פליטה ב 455 ננומטר), EGFP (עירור ב 489 ננומטר, פליטה ב 508 ננומטר), ואדום הנילוס (עירור ב 553 ננומטר, פליטה ב 637 ננומטר) באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איורים 3, 5, 6).

7. פלורסנט באתרו הכלאה (FISH) עבור סעיפים פרפין Embedded

  1. הכן את החללית FISH שכותרתו ישירות עם fluorophore עבור DNA הכלאה באתרו על ידי תרגום ניק באמצעות כרומוזום בקטריאלי מלאכותי המכיל את gen DNA MCMV כולושת (pSM3fr) 19. הריכוז של חללית FISH הוא 0.1 מיקרוגרם / μl.
  2. Deparaffinize ו רעננותם השקופיות של המוח הנגוע 22.
  3. פנקו את הסעיפים רקמות עם RNase (100 מיקרוגרם / מ"ל ​​PBS) כדי לזהות DNA הנגיפי.
  4. בצע אחזור אנטיגן עם NP40 0.05%, 0.01 M חיץ ציטראט (pH 6.0) ב 95 - 98 ° C במשך 20 דקות. מצננים את השקופיות עד RT במשך 20 דקות.
  5. בצנצנת מכתים זכוכית Coplin, לשטוף את השקופיות במים טהורים שלוש פעמים במשך 2 דקות בכל פעם. בצע צעד יחזור אנטיגן נוסף עם פפסין 0.06%, 0.01 פתרון N HCl למשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
  6. לשטוף מחליק שלוש פעמים במים טהורים למשך 2 דקות בכל פעם בצנצנת מכתים זכוכית Coplin.
  7. מייבשים את הסעיפים רקמות שוב על ידי העברת שקופיות אתנול 70%, אתנול 85%, ולאחר מכן אתנול 100%.
  8. להכנת 10 מ"ל של חיץ הכלאה, לערבב 1.25 מ"ל במלחים הכלאה באתרו (3 M NaCl, 100 מ"מ טריס-HCl PH 8.0, 100 מ"מ נתרן פוספט pH 6.8, 50 mM EDTA) עם 5 מ"ל לפוראמיד deionized, 2.5 מ"ל 50% סולפט dextran, 250 μl 50x פתרון של Denhardt, 125 μl 100 מ"ג / מ"ל tRNA, ו 875 μl H 2 O.
  9. לדלל את חללית DNA שכותרתו ישירות עם fluorophores שמזהה הגנום MCMV השלם אקראית למאגר ההכלאה. ההיקף הסופי צריך להיות 10 μl (חיץ הכלאה 7 μl, 1 בדיקת μl (0.1 מיקרוגרם / μl), ו -2 μl מים מזוקקים).
  10. מוסיפים את תערובת בדיקה (10 μl) לכל שקופית ומכסים coverslip (15 × 15 מ"מ). חותם את coverslip במלט גומי. לפגל תמהיל הבדיקה במשך 5 דקות ב 85 מעלות צלזיוס, ולהשלים את O צעד הכלאה / N ב 42 מעלות צלזיוס.
  11. שטפו את השקופיות עם SSC 0.3% NP40, 0.4x ב 73 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; עם 0.1% NP40, SSC 0.4x ב 73 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות; ועם 2x SSC פעמיים.
  12. Counterstain הגרעינים עם DAPI (10 ng / ml) ומכסים את השקופית עם coverslip.
  13. הרהסעיפים מגיב אנטי לדעוך ו DAPI תמונה (עירור ב 345 ננומטר, פליטה ב 455 ננומטר) EGFP (עירור ב 489 ננומטר, פליטה ב 508 ננומטר) באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 4).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

במחקרים על בפתוגנזה של דלקת מוח ויראלית, שיטת ההדבקה חשובה. מסלול hematogenous מייצג זיהום חריף של תאי האנדותל pericytes של המוח, בעוד מסלול ICV מייצג זיהום חריף מתפשט דרך CSF בחלל תת-העכבישים, מגיע עד קרומי המוח ואת המקלעת דמתה. כדי לנתח את ההתפלגות הראשונה של חלקיקי דלקת המוח חריף, כלאה באתרו גילוי הגנום MCMV והתבוננות ישירה של חלקיקי M32-EGFP-MCMV או microbeads פלורסנט שמשו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במודלים של בעלי חיים, ICV, intraperitoneal, שליה ישירה, וזיהומי IV שמש ללמוד בפתוגנזה של דלקת מוח ויראלית. התמקדנו דגמי ICV ו- IV הזרקה של עכברים בילוד עבור הפשטות של הנהלים לטובת הזרקה ישירה של חלקיקים לתוך אזור היעד. למרות זיהום intraperitoneal הוא שיטה קלה, חלקיקים נגיפיים להפיץ מערכתי באמצעות 5,24 תהליך עקיף. זיהום שליה ישיר הוא שיטה טובה ללמוד זיהום מערכתי עוברי. עם זאת, שיטה זו דורשת הכשרה מיוחדת כדי להניב תוצאות יציבות ויש לו שיעור הצלחה נמוך. שיטת הזיהום היא גם ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים מודים למר Masaaki Kaneta, לגב' Hiromi Suzuki ולגב' Mitsue Kawashima (המחלקה לפתולוגיה רגנרטיבית וזיהומית, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת Hamamatsu) על הסיוע הטכני המצוין שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי האגודה היפנית לקידום המדע, מענק KAKENHI מספר 23590445.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
טריס; טריס (הידרוקסימתיל)- אמינומתאןסיגמא-אולדריץ'T-6791
HClסיגמא-אולדריץ'H-1758
pEGFP-N1 וקטור Clontech# 6085-1
D-סורביטולסיגמא-אולדריץ'S-1876
SPHERO TM פוליסטירן פלואורסצנטי נילוס אדום 0.04 - 0.06Spherotech, Inc.FP-00556-2
SPHERO TM פוליסטירן פלואורסצנטי אדום נילוס 0.1 - 0.3Spherotech, Inc.FP-0256-2
SPHERO TM פוליסטירן ניאון אדום נילוס 1.7 - 2.2Spherotech, inc. FP-2056-2
10% סרום עכברDAKO X0910
C57BL/6 עכברSLC, בע"מ
עכבר ICRSLC, Inc.
מזרקי מיקרוליטר שונה (סדרת 7000)חברת
מחט 35 מדSaito Medical
A Wee Sight TransilluminatorPhillips Healthcare1017920
O.C.T.CompoundSakura Finetek4583
RNase ASigma-AldrichR4642
Nonidet(R) P-40Nacalai25223-04
מאגר ציטראט (pH 6) x 10סיגמא-אולדריץ'C9999-100 מ"ל
פפסיןסיגמא-אולדריץ'P6887
EDTAdojindoN001
פורממידTCIF0045
מלח נתרן דקסטרן סולפטסיגמא-אולדריץ'42867-5G
דנהרדט תמיסה (50x)ThermoFishcer sceintific750018
שמרים tRNA (10 מ"ג/מ"ל)ThermoFishcer sceintificAM7119
SSC 20xSigma-AldrichS6639
DAPIThermoFishcer sceintificD1306
n-HexaneSigma-Aldrich296090
superfrost plus glassThermoFishcer sceintific12-55-18
Cytokeep IINippon Shoji Co.
Griffonia simplicifolia isolectin B4 Vector laboratories, Inc. מצומד ל-FITCL1104
נגד עכבר CD31 (PECAM-1) PEebioscience12-0311
ProLong  זהבThermoFishcer sceintificP36934
BIOREVOKEYENCEBZ-9000E
המילטון

מקורות

  1. Philippe, N., et al. Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
  2. Passini, M. A., et al. Intraventricular brain injection of adeno-associated virus type 1 (AAV1) in neonatal mice results in complementary patterns of neuronal transduction to AAV2 and total long-term correction of storage lesions in the brains of beta-glucuronidase-deficient mice. J Virol. 77 (12), 7034-7040 (2003).
  3. Kim, J. Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur J Neurosci. 37 (8), 1203-1220 (2013).
  4. McLean, J. R., et al. Widespread neuron-specific transgene expression in brain and spinal cord following synapsin promoter-driven AAV9 neonatal intracerebroventricular injection. Neurosci Lett. 576, 73-78 (2014).
  5. Hsu, K. M., Pratt, J. R., Akers, W. J., Achilefu, S. I., Yokoyama, W. M. Murine cytomegalovirus displays selective infection of cells within hours after systemic administration. J Gen Virol. 90. 90 (Pt 1), 33-43 (2009).
  6. Sakao-Suzuki, M., et al. Aberrant fetal macrophage/microglial reactions to cytomegalovirus infection. Annals of Clinical and Translational Neruology. 1 (8), 570-588 (2014).
  7. Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous injections in neonatal mice. J Vis Exp. (93), e52037(2014).
  8. Kawasaki, H., et al. Cytomegalovirus initiates infection selectively from high-level beta1 integrin-expressing cells in the brain. Am J Pathol. 185 (5), 1304-1323 (2015).
  9. Rahim, A. A., et al. Intravenous administration of AAV2/9 to the fetal and neonatal mouse leads to differential targeting of CNS cell types and extensive transduction of the nervous system. FASEB J. 25 (10), 3505-3518 (2011).
  10. Cannon, M. J., Davis, K. F. Washing our hands of the congenital cytomegalovirus disease epidemic. Bmc Public Health. 5, (2005).
  11. Frenkel, L. D., Keys, M. P., Hefferen, S. J., Rola-Pleszczynski, M., Bellanti, J. A. Unusual eye abnormalities associated with congenital cytomegalovirus infection. Pediatrics. 66 (5), 763-766 (1980).
  12. Becroft, D. M. Prenatal cytomegalovirus infection: epidemiology, pathology and pathogenesis. Perspect Pediatr Pathol. 6, 203-241 (1981).
  13. Conboy, T. J., et al. Intellectual development in school-aged children with asymptomatic congenital cytomegalovirus infection. Pediatrics. 77 (6), 801-806 (1986).
  14. Fowler, K. B., et al. The outcome of congenital cytomegalovirus infection in relation to maternal antibody status. N Engl J Med. 326 (10), 663-667 (1992).
  15. Cannon, M. J. Congenital cytomegalovirus (CMV) epidemiology and awareness. J Clin Virol. 46 Suppl 4, S6-S10 (2009).
  16. Grassi, M. P., et al. Microglial nodular encephalitis and ventriculoencephalitis due to cytomegalovirus infection in patients with AIDS: two distinct clinical patterns. Clin Infect Dis. 27 (3), 504-508 (1998).
  17. Kawasaki, H., Mocarski, E. S., Kosugi, I., Tsutsui, Y. Cyclosporine inhibits mouse cytomegalovirus infection via a cyclophilin-dependent pathway specifically in neural stem/progenitor cells. J Virol. 81 (17), 9013-9023 (2007).
  18. Britt, W. J. Human cytomegalovirus: propagation, quantification, and storage. Curr Protoc Microbiol. Chapter 14, Unit 14E 13(2010).
  19. Kawasaki, H., Kosugi, I., Arai, Y., Iwashita, T., Tsutsui, Y. Mouse embryonic stem cells inhibit murine cytomegalovirus infection through a multi-step process. PLoS One. 6 (3), e17492(2011).
  20. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
  21. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cutting sections of paraffin-embedded tissues. CSH Protoc. , (2008).
  22. Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. J Vis Exp. (8), e308(2007).
  23. Wilsbacher, L. D., Coughlin, S. R. Analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart. J Vis Exp. (97), (2015).
  24. Ohshima, M., et al. Intraperitoneal and intravenous deliveries are not comparable in terms of drug efficacy and cell distribution in neonatal mice with hypoxia-ischemia. Brain Dev. 37 (4), 376-386 (2015).
  25. Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. J Vis Exp. (91), e51863(2014).
  26. Glascock, J. J., et al. Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice. J Vis Exp. (56), (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

In Situ Hybridization
הזרקת intracerebroventricular ו intravascular של חלקיקים נגיפיים ו פלורסנט microbeads לתוך המוח בילוד
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.