מאמר שיטה

Assay חינם-נייד באמצעות

7.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54173

⸱

8 באוגוסט 2016

 , 
1Department of Molecular Biology, University of Wyoming

במאמר זה

סיכום

מנגנונים של קנה מידה תאי ותוך-תאי נותרו חמקמקים. השימוש בתמציות עוברי קסנופוס הפך נפוץ יותר ויותר כדי להבהיר מנגנונים של ויסות גודל האברונים. שיטה זו מתארת הכנת תמצית עובר ובדיקת קנה מידה גרעינית חדשה שבאמצעותה ניתן לזהות מנגנונים של ויסות גודל גרעיני.

תקציר

שאלת יסוד בביולוגיה של התא הוא כיצד גדלים התא אברון מוסדרים. זה כבר זמן רב מוכר שגודל הגרעין מאזניים בדרך כלל עם הגודל של התא, בעיקר במהלך embryogenesis כאשר ירידות דרמטיות בשני התאים וגדלים גרעיניים להתרחש. מנגנוני ויסות גודל גרעין הם ידועים ברובם עשויים להיות רלוונטיים לסרטן שבו גודל גרעין שינה הוא פרמטר דיאגנוסטיים ופרוגנוסטיים מפתח. בשנת vivo גישות לזיהוי רגולטורי גודל גרעין מסובכות על ידי המהות והמורכבת של פונקציה גרעינית. הגישה חוץ הגופייה המתוארת כאן כדי ללמוד שליטת גודל גרעין מנצלת את הירידות הרגילות בגודל גרעיני המתרחשות במהלך התפתחות laevis Xenopus. ראשית, גרעינים הם התאספו X. laevis לחלץ ביצה. לאחר מכן, גרעינים אלה מבודדים resuspended בציטופלסמה מעובר בשלב מאוחר. אחרי 30 - תקופת דגירה 90 דקות, שטח פנים גרעינייםפוחת ב -20 - 60%, מתן assay שימושי לזהות רכיבים ציטופלסמית נוכחיים בעוברים מאוחר שתורמים לכיול גודל גרעין התפתחותית. יתרון עיקרי של גישה זו הוא המתקן היחסי שבה תמציות ביצת עובר ניתן להשפיע מבחינה ביוכימית, המאפשרות זיהוי של חלבונים ופעילויות רומן מווסתים גודל גרעין. כמו בכל בגישה חוץ גופית, אימות של תוצאות מערכת in vivo זה דבר חשוב, microinjection של X. עוברת laevis מתאים במיוחד ללימודים אלה.

מבוא

הגדלים של אברונים הסלולר בדרך כלל בקנה מידה עם הגודל של התא, ואת זה כבר אולי מתועד ביותר עבור קנה המידה של גודל גרעין עם תא בגודל 1-10. זה נכון במיוחד במהלך embryogenesis ו התמיינות תאים, כאשר ירידות דרמטיות בשני תא וגודל גרעיני לעתים קרובות הם נצפו 11,12. יתר על כן, גודל גרעין שינה הוא פרמטר מרכזי באבחון הסרטן ופרוגנוזה 13-17. מנגנונים שתורמים רגולצית גודל גרעין אינם ידועים בעיקר, בין שאר בשל מורכבות מהותה של מבנה גרעין ותפקוד. השיטה המתוארת כאן פותחה בתור assay במבחנה עבור קנה מידת גודל גרעיני אך למניפולציה ביוכימיות מבהירה מנגנוני ויסות גודל גרעין.

תמצית laevis ביצה Xenopus היא מערכת מבוססת היטב לשחזר וללמוד תהליכים תאיים מורכבים במבחנה הקשר. תמציות אלה חשפו מידע בסיסי חדש על תהליכים תאיים מספר כולל הרכבה ותפקוד של ציר mitotic, reticulum endoplasmic, והגרעין 18-22. אחד מיתרונות המפתח למערכת לחלץ הוא X. תמציות ביצה laevis מייצגים הציטופלסמה חי כמעט שהרכבו ניתן לשנות בקלות, למשל באמצעות תוספת של חלבונים רקומביננטיים או immunodepletion. יתר על כן, אחד הוא מסוגל לתפעל תהליכים חיוניים ידי העסקת טיפולים שעלולים להיות קטלניים בהקשר vivo. שינוי של התהליכים לחלץ ביצה לאפשר בידוד של תמציות מן X. עוברים laevis ולא ביצים, ותמציות העובר אלה ניתנים באופן שווה על מניפולציה ביוכימית 23. במהלך X. laevis פיתוח, העובר המופרה התא הבודד (~ 1 מ"מ קוטר) עובר סדרה של שנתי עשר חלוקות תא מהירות (שלבים 1 - 8) כדי לייצר כמה אלף 50 μמ 'קוטר ותאים קטנים, להגיע לשלב ההתפתחותי כינה המעבר midblastula (MBT) או שלב 8 24-26. MBT מאופיין תחילת שעתוק zygotic, נדידת תאים, חלוקות תא אסינכרוני, רכישת שלבי פער, והקמה בגדלים יציבים גרעיניים ולא הרחבה גרעינית מתמשכת כמו לעובר שטרם MBT. משלב 4 עד gastrulation (טיולי 10.5 - 12), היקף גרעינים בודדים פוחת ביותר מ פי 10 11.

כאן, המטרה היא לזהות מנגנונים אחראים ההפחתות אלה בגודל גרעיני במהלך התקדמות התפתחותית. הגישה היא להרכיב גרעינים ראשונים X. laevis הביצה ואת תמצית לבודד אותם גרעינים מן הציטופלסמה ביצה / תמצית. גרעינים אלו מכן resuspended בציטופלסמה מעוברים בשלב gastrula מאוחר. לאחר תקופת דגירה, הגרעינים מתמצית ביצה נעשים קטנים יותר בתמצית העובר בשלב מאוחר. סברנו כי woul זהד להיות assay שימושי לזיהוי רכיבים ציטופלסמית הנוכחי בעוברים מאוחר שתורמים לכיול גודל הגרעין התפתחותית. שימוש assay זה, בשילוב עם אימות in vivo, הראינו כי חלבון קינאז C (PKC) תורמת להפחתה התפתחותית בגודל גרעיני X. laevis 23.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הנהלים Xenopus ומחקרים שנערכו מילוי הדרישות של המדריך NRC עבור לטיפול ושימוש מהדורה 8 בחיות מעבדה. הפרוטוקולים שאושרו על ידי האוניברסיטה של ​​טיפול בבעלי חיים מוסדיים ויומינג ועדת שימוש (# אבטחת A-3216-01).

1. הכנת X. חלץ ביצה laevis (מותאם מ 27,28)

  1. X. נקבה הממשלה laevis צפרדעים מינימום של שלושה ימים לכל היותר שבועיים לפני אוסף ביצה עם הזרקת 100 IU אחת של גונדוטרופין בסרום סוסה הרה (PMSG).
  2. יום אחד לפני הניסוי, להזריק צפרדעים דרוכות עם 800 IU של גונדוטרופין כוריוני האנושי (HCG) ומניח על 16 מעלות צלזיוס ב 1 ליטר לכל צפרדע 1 / 3x האצבעות השונות של מארק (MMR). ראה טבלה מס '1 עבור כל יצירות חיץ.
    הערה: יש צפרדעים לא להטיל ביצים או יטילו את הביצים באיכות ירודה. בדרך כלל 2 - 3 צפרדעים מוזרקות כדי להבטיח לפחות צפרדע אחת תטיל sufficienמספרי t של ביצים באיכות טובות. הצפרדע הממוצעת תטיל מספיק ביצים כדי לייצר לפחות 1 מיליליטר של תמצית ביצה.
  3. הכן 1 L 1 / 3x MMR עם מים ללא יונים מזוקקים קרים (DDH 2 O), 500 מ"ל חיץ B, 1 C חיץ L, 500 מ"ל חיץ D, ו -100 מ"ל חיץ E.
  4. העברה הטילה ביצים לצלחת המתגבשת זכוכית (150 x 75 מ"מ). שימוש pipet פלסטיק פסטר עם הקצה מנותק, לעבד את ביצים לבנות נפוח מופעל או ביצי lysed. רק לשמור על ביצים עם מוטות חיה כהה ברורות ושווות ותרנים צמחיים לבנים.
  5. הכן 13 x 51 מ"מ צינורות צנטריפוגות עם 1 מ"ל של הצפת E בתוספת 355 מיקרומטר cytochalasin D הוסיף רק לפני השימוש בשלב 1.7.
  6. Dejelly ולשטוף את הביצים.
    1. לשטוף ביצים בקצרה עם 1 / 3x MMR הקר בתוך כוס בגודל מתאים, שינוי החיץ 3 - 4 פעמים.
    2. הסר את המעילים ג'לי מן הביצים על ידי הדגירה עם הצפת B. זה יהיה לקחת בין 3 - 10 דקות. כמו מעילים ג'לי מעונן משתחררים מן הביצהים, לשנות את החיץ.
      הערה: Dejellying יושלם כאשר הביצים מופיעות צפופה בפינה של המנה כאשר מוטה ותרן צמחי מכוונים כלפי מטה. ביצים הן הרבה יותר שברירים לאחר dejellying, ועל כן אין דגירת ביצים עם ההצפה B למשך זמן ארוך יותר מאשר שוטף דרושים ולאחר צריכות להתבצע בזהירות רבה.
    3. בקצרה ביצים לשטוף עם 3 - 4 שינויים של הצפת ג
    4. בקצרה ביצים לשטוף עם 2 שינויים של הצפת ד
    5. בקצרה ביצים לשטוף עם 2 שינויים של הצפת E.
  7. מלאו צינורות צנטריפוגה עם ביצים באמצעות פיפטה מזכוכית הנישאת רחבה או טפטף פלסטיק. לשאוב את עודפי חיץ. כדי לארוז את הביצים ולהסיר חיץ ככל האפשר, צנטריפוגות ב הרוטור דלי מתנדנד ב 212 XG במשך 60 שניות ולאחר מכן ב 478 XG במשך 30 שניות. לשאוב את עודפי חיץ.
    הערה: חשוב להסיר כמה שיותר עודפי חיץ ככל האפשר בשלב זה על מנת להבטיח את מיצוי הביצה הוא מדולל מינימאלי.
  8. בעוד מתנדנד הרוטור דלי, ultracentrifuge תחת ואקום במשך 15 דקות ב XG 12,000 ו -4 ° C לרסק ביצים פתוח להפריד לתוך שכבות שונות, עם הציטופלסמה להיות השכבה בצבע הענבר באמצע. הסר צינורות צנטריפוגות ומניחים מיד על הקרח.
  9. אסוף את התמצית.
    1. באמצעות מחט 18 מד מזרק, לנקב את צינור צנטריפוגות בדיוק מעל שכבת פיגמנט כהה בחלק התחתון של הצינור ולהסיר את שכבת cytoplasmic בצבע הענבר באמצע. אל תאסוף של שכבת השומנים העליונה. אסוף את הציטופלסמה בצינור בגודל מתאים.
      הערה: באופן כללי, 1 הצפרדע מייצרת לפחות 1 מ"ל של תמצית.
    2. הציטופלסמה מוסף עם 1 / 1,000 היקף 19.7 מ"מ cytochalasin D, 1 / 1,000 מהיקף המניות LPC, ו 1/50 היקף תמהיל האנרגיה 50x. בעדינות להפוך את הצינור לערבב. אל pipet תמצית מוגזם.
    3. שמור את התמצית על קרח ולהשתמש בו בתוך 3 שעות של הכנה לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
_title "> 2. הכנת זרע Demembranated X. laevis (מותאם מ 29)

הערה: כרכי ההליך המוצגים כאן הם עד 8 אשכים.

  1. הסר 0.05% benzocaine (מלאי benzocaine 10% ערוכים אתנול מדולל ל 0.05% במים טנק צפרדע) מ 4 ° C וחם לטמפרטורת החדר. להרדים ולהקריב זכר X. laevis צפרדעים בתמיסה benzocaine בטמפרטורת החדר למשך 20 - 30 דקות. ודא למוות על ידי היעדר דופק על ידי בחינה ולהרגיש את אזור החזה, על ידי חוסר התגובה לגירוי מכאני, ו / או על ידי עריפת ראש.
  2. לעשות חתך בצורת U לאורך הבטן. הסר את מסת tubulated של גופי שומן צהובים. בחלק העליון של הכליות, לאתר את האשכים, אשר צבעם סגלגלים המונים ורודים חיוורים על 1 סנטימטר אורך 29. ובלו האשכים ולגלגל אותם על נייר סופג כדי להסיר דם ורקמות אחרות.
  3. לשטוף אשכי הצפת ט השתמש עלי מצויד חזק כדי לרכך אשכים עם 1 מיליליטר של הצפהT צינור 1.5 מ"ל עד הומוגנית (10 משיכות או יותר). צנטריפוגה 5 - 10 שניות בצנטריפוגה מיני לאסוף את supernatant, הסרת חתיכות גדולות של רקמה. חזור על צנטריפוגה שוב לאסוף את supernatant.
  4. מעבירים את הפתרון המכילים זרע אל צינור פלסטיק 15 מ"ל. הגבר את עוצמת הקול כדי סך של 2 מ"ל עם הצפת ט צנטריפוגה ב 1,411 XG במשך 10 דקות ב 16 ° C עד גלולה הזרע.
  5. הסר את supernatant ו resuspend גלולה ב 500 μl של הצפת ט צנטריפוגה ב 1,411 XG במשך 10 דקות ב 16 מעלות צלזיוס. חזור על פעולה זו פעם או פעמים לפי צורך כדי לנקות את הגלולה של תאי דם סומטיים ואדומים.
  6. Resuspend גלולה ב 100 μl הצפת T ו -300 μl הצפת ס דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
    הערה: הצפת S מכיל lysolecithin, האחראית על demembranation.
  7. הוספת שלושה כרכים של הצפת R (מוכן טרי לפני השימוש). היפוך צינור פעם אחת בדיוק. צנטריפוגות ב 1,411 XG במשך 15 דקות ב 16 &# 176; ג.
  8. Resuspend גלולה ב 400 μl הצפת R ולאחר מכן להוסיף 2 מ"ל נוספים של צנטריפוגה הצפת ר ב 1,411 XG במשך 15 דקות ב 16 מעלות צלזיוס.
  9. Resuspend גלולה ב 50 μl הצפת ט
  10. לדלל גרעיני זרע 1 demembranated μl עם 9 μl הצפה ט החל דילול זה hemocytometer. ספירת גרעיני זרע בצורת אות S דקים רשת אחת גדולה 4 x 4, ו להכפיל את המספר הזה על ידי 100 כדי להשיג את הריכוז של המנייה ב גרעיני זרע לכל μl.
  11. לדלל את המניות 100,000 גרעיני זרע לכל μl עם ההצפה T, וכתוצאה מכך מלאה 200x. כן 3 - 5 aliquots μl. פלאש להקפיא בחנקן נוזלי חנות ב -80 ° C.

3. אסיפה גרעינית

  1. מוסף 100 μl של תמצית ביצה עם 1.5 μl 35.5 מ"מ cycloheximide (ריכוז סופי ~ 0.5 מ"מ), 6 μl 20x פתרון המניות סידן (ריכוז סופי ~ 0.6 מ"מ), ו -0.7 μl 200x זרע (ריכוז סופי ~ 700זרע גרעינים / μl). קנה מידה של למעלה תגובת נפח או למטה לפי הצורך. היפוך או לטפוח בעדינות לערבב.
    הערה: חלץ אופניו מן metaphase לתוך שלבים מספקת פלטפורמה יותר חזקה ואמינה להרכבה גרעינית.
  2. דגירה באמבט מים ב 16 - C ° 20 במשך 90 דקות. מערבב על ידי קשה כל 15 דקות בעדינות כדי להבטיח גרעינים להישאר תלוי לחלץ.
  3. לעקוב אחר התקדמות של הרכבה גרעינית ב 45 דקות על ידי הכנת סקווש כדלקמן.
    1. Pipet 2 μl של תמצית לשקופית כוס ומוסיפים 2 לתקן גרעין μl.
    2. Overlay עם coverslip 22 מ"מ 2. תמונה על מיקרוסקופ epifluorescence באמצעות מים, שמן, או אוויר 20 - מטרות 100X ומסנן DAPI.
      הערה: הגרעינים ניתן דמיינו ידי הדמיה בהיר שדה, אבל הם הרבה יותר קלים לדמיין ידי קרינה.
    3. השתמש גרעינים מיד או aliquots להקפיא פלאש בחנקן נוזלי חנות ב -80 מעלות צלזיוס.
      הערה: גליצרול 4% וכאילו כדי להוסיף על יחסי ציבור גרעיניםIOR הקפאה יכול לעזור כדי לשמור על שלמות שלהם. גרעינים קפואים הם בדרך כלל עדיין קיימים וניתנים יבוא גרעיני, אולם תהליך ההקפאה יכול להוביל גרעינים שברירי שבשו או יותר מבחינה מבנית. גרעינים עד שנה לאחר ההקפאה יכולים לשמש.

4. הכנת X. חלץ עובר laevis

  1. להשרות X. נקבה laevis צפרדעים להטיל ביצים כמתוארות 1.1 ו -1.2.
  2. לבודד אשכים מ X. זכר laevis צפרדעים כמתואר 2.2. לצלול האשכים במדיה L15 בתוספת 50 IU / ml של פניצילין סטרפטומיצין בכוס 35 x 10 מ"מ צלחת פטרי. חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים.
  3. איסוף להפרות ביציות.
    1. אסוף טרי הטילו ביצים על ידי החזקת צפרדעים מעל צלחת לשימוש חוזרת זכוכית הפטר ולקדם הטלה על ידי הפעלת לחץ עדין על הגב תחתון ליד הביב. לסחוט את הצפרדע חזקה מדי עלול לגרום לפגיעה, שמוביל בטן req נפוחהuiring המתת חסד 29.
    2. אבזר המנה בזווית משוערת 45 °, לאפשר ביצים כדי לאסוף את דופן הקערה, להסיר את כל עודפי החיץ, ומוסיפות מספיק 1 / 3x MMR כדי בקושי לכסות את הביצים. להפרות ביציות בתוך 15 דקות של איסוף.
    3. השתמש עלי מצויד היטב מרוכך ו homogenize 1/4 של testis צינור 1.5 מיליליטר עם 500 μl של מלח גבוה השתנה המלוח של בארת (MBS המלח הגבוה). להוסיף האשכים macerated את הביצים ולאפשר הפריה להתרחש בטמפרטורת החדר במשך 15 - 20 דקות, ולאחר מכן לשטוף ביצים עם MMR 1 / 3x.
      הערה: יעילות של אשכים פוחתת עם זמן אחסון, ולכן רקמת אשכים יותר עשויה להידרש הפריה מוצלחת בעת שימוש אשכים שאוחסנו במשך יותר משבוע.
    4. אשר הפריה על ידי בדיקת התכווצות של מוט החיה פיגמנט כהה על ידי סיבוב של העוברים עם מוטות החיה שלהם פונה כלפי מעלה, בדרך כלל כ -20 - 30 דקות לאחר תוספת של טסט כתושים. צפו מחשוף התא הראשון להתרחש בתוך 90 דקות.
    5. בעזרת פיפטה זכוכית הנישאת רחבה בחריצות להסיר (לבן נפוח או חלוקה לא שווה של חלמון פיגמנט) מת, lysed, או ביצים מופרות (כלומר, לא בקעו), כפי שהם יניעו במהירות למוות עוברי שכנה.
    6. בכל מקום בין 1 - 2.5 ה.ר. לאחר הפריה, dejelly עובר 2 - 3% ציסטאין מומסת 1/3 x MMR והותאם 7.9 pH עם 10 N KOH. בצע שני שינויים חיץ כי הם כל 3 - 4 דקות. ביסודיות לשטוף את העוברים עם 6 - 10 שינויים קצרים של 1 / 3x MMR כדי להסיר כל העקבות של ציסטאין.
      הערה: עובר Dejellied יש קרום vitelline ואינם שבירים כמו ביצי dejellied.
  4. בעזרת פיפטה זכוכית הנישאת רחבה, להעביר מופרת בריאה (כלומר, בקע) העוברים בצלחת פטרי המכילה MMR הטרי 1 / 3x ולאפשר להם להתפתח לשלב הרצוי ב RT או, אם להתפתחות איטית עדיפה, 16 ° C. המשך להסיר מת או lyעובר SED שמציין חוסר בליגה הראשונה או מראה לבן ותפוח.
  5. בדוק את שלב את העוברים על ידי בדיקה לסגירתם מוחלטת כמעט של blastopore ובאמצעות השוואת ציורים של מבוים עובר זמין חומר עזר 24.
    הערה: עוברים בתרבית בשעה 16 ° C יגיע שלב 11.5 - 12 כ 12 שעות.
  6. דגירה בשלב 11.5 - 12 עוברים MMR הטרי 1 / 3x השלים עם cycloheximide 0.5 מ"מ עבור שעה 1 ב RT, לעצור עוברת שלבים מאוחר.
  7. עבר עם זכוכית נישאת רחבה או טפטף פלסטיק מינימום של 15 (רצוי 30 או יותר) עובר נעצרו שלבים לצינור microcentrifuge.
    הערה: 15 עוברים מספיקים כדי לייצר כ 20 μl של תמצית. בהיקף של עד לפי הצורך.
  8. הוסף 1 מ"ל חיץ תמוגה ביצה (ELB) בתוספת 1 μl של המניה LPC. בעדינות להפוך לשטוף עוברים, לאפשר עוברים ליפול לתחתית הצינור, להסיר את החיץ. חזור על שלב זה לשטוף פעמיים נוספות.
  9. עוברים Resuspend ב 500 μl של ELB בתוספת 0.5 μl של המניה LPC, 5 μl של 19.7 מ"מ cycloheximide, ו -5 μl של 35.5 מ"מ cytochalasin D (לעכב פילמור אקטין). צנטריפוגה ב XG 200 דקות 1 ב microcentrifuge השולחן.
  10. הסר החוצץ עודף ולהשתמש עלי למחוץ את העוברים ביסודיות. צנטריפוגה ב הרוטור דלי מתנדנד במשך 10 דקות ב XG 10,000 ו -16 מעלות צלזיוס.
  11. לנקב את שכבת השומנים מלמעלה עם טיפ pipet 200 μl. עם טיפ 200 μl pipet נקי, להסיר את השכבה בצבע ענבר ציטופלסמית באמצע כדי צינור בגודל מתאים.
  12. מוסף לחלץ העובר עם 1/50 נפח 50x תמהיל האנרגיה (לספק מערכת התחדשות ATP), 1/100 היקף cyclohexamide 35.5 מ"מ, 1/500 בהיקף 19.7 מ"מ cytochalasin D, ו- 1 / 1,000 מהיקף מניית LPC.
  13. הכן סקווש כמתואר 3.3 לדמיין גרעינים עובריים האנדוגניים לחלץ.
    הערה: תמצית עוברית אפשר להקפיא עם הגרעינים אנדוגני בנקודה זו. Aliquot להפחית להקפיא / מחזורי הפשרה ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
  14. כדי להסיר גרעינים מהתמצית העובר, לדלל את תמצית עם נפח שווה של ELB המכיל 1/50 היקף 50x תמהיל האנרגיה, 1/100 בהיקף 35.5 מ"מ cyclohexamide, 1/500 בהיקף 19.7 מ"מ cytochalasin D, ו 1 / 1,000 מהיקף המניות LPC. צנטריפוגה ב הרוטור דלי מתנדנד על 17,000 XG במשך 15 דקות ב 16 מעלות צלזיוס.
  15. אסוף את supernatant להיות זהיר, כדי למנוע כל שומנים ויככבו. נא לא להפריע את הגרעינים pelleted בתחתית הצינור. הכן סקווש כמתואר 3.3 על מנת להבטיח כי ברוב הגרעינים הוסרו. השתמש לחלץ טריים או aliquot ולאחסן ב -80 ° C.
  16. כדי לחמם להשבית לחלץ העובר על ניסויים שליטים, חום 30 - 100 aliquots μl של תמצית ב 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות באמצעות Cycler תרמית. אפשר לחלץ חום מומת לחזור לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
_title "> 5. גרעינית כיווץ Assay ו Immunofluorescence

  1. לבודד גרעינים התכנסו לחלץ ביצה על ידי דילול 25 - 150 μl של גרעינים מראש התאספו ב 1 מ"ל ELB צינור 1.5 מ"ל. צנטריפוגה ב 1,600 XG 3 דקות ב 4 ° C ב microcentrifuge השולחן. הסר חוצץ, נזהר שלא להפריע הגלולה שברירים של גרעינים בתחתית של התחתית.
  2. Resuspend גרעינים בנפח של תמצית העובר שווה לנפח המקורי של תמצית ביצה בשימוש 5.1. השתמש ELB או תמצית חום מומת לתגובות שליטה, לפי העניין.
  3. לטפוח בעדינות את הצינור כדי לשבור את הגלולה ו resuspend הגרעינים. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 90 דקות, הקשה על הצינור בעדינות לתערובת כל 15 - 30 דקות. הערה: רוב ההתכווצות הגרעינית מתרחש בתוך 30 הדקות הראשונות.
  4. לעקוב אחר התקדמות של התכווצות גרעינית על ידי הכנת סקווש.
    1. Pipet 2 μl של תמצית לשקופית כוס ומוסיפים 2 לתקן גרעין μl.
    2. שכבה עם 22 מ"מ 2 coverslip. תמונה על מיקרוסקופ epifluorescence.
  5. הקש את הצינור כדי resuspend הגרעינים רק לפני הוספת 500 μl של מקבע המורכב ELB, 15% גליצרול, ו -2.6% paraformaldehyde. הפוך מיד, ובמקום הצינור על הכתף במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. הכין ספין למטה צינורות על ידי outfitting עגול 15 מיליליטר צינורות זכוכית תחתונים עם מוסיף פלסטיק תחתי עגול (עיצוב שרטוטים זמינים לפי בקשה). הוסף 5 מ"ל של חיץ כרית גרעיני. זרוק coverslip עגול 12 מ"מ לתוך הצינור, להיות בטוח שהוא מניח שטוח על גבי סוגר הפלסטיק.
  7. בעדינות שכבת הפתרון המכיל גרעינים קבועים על גבי הכרית הגרעינית באמצעות קצה pipet רחב נשא. צנטריפוגה ב הרוטור דלי מתנדנד במשך 15 דקות XG ב 1000 ו -16 מעלות צלזיוס.
  8. השתמש aspirator כדי להסיר את כל המאגר ולמשוך את סוגר הפלסטיק לחלק העליון של הצינור. הסר את coverslip עם זוג מלקחיים בסדר, נזהר לציין את צד הכיסוילהחליק על אשר הגרעינים היו סובבים. פוסט לתקן מתנול קר (מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס) במשך 5 דקות ב RT.
  9. מעבירים את הצד coverslip גרעין לעלות על סדין של סרט פרפין פלסטיק ביטון בצלחת פטרי פלסטיק גדולה. מניח מגבונים חד פעמים רטובות לאורך הצד של המנה, כדי למנוע התייבשות.
  10. רעננותם גרעינים על coverslip עם 500 μl של PBS-NP40 (PBS 1x בתוספת 0.1% NP40) ואת לשאוב אחרי 5 - 10 שניות.
  11. בזהירות שכבת 75 μl של% PBS-3 שור סרום אלבומין (BSA) על coverslip. אפשר לחסום 1 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
  12. סור פתרון חסימה, דגירה עם נוגדן ראשוני (למשל, mAb414 נגד המורכב הנקבובי הגרעין, 1: 1,000) המדולל BSA PBS-3% במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף עם חמישה שינויים מיידיים של PBS-NP40.
  13. דגירה עם נוגדנים משני מדולל BSA PBS-3% במשך שעה 1 ב RT. לשטוף עם חמישה שינויים מיידיים של PBS-NP40.
  14. לִדגוֹרעם 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​Hoechst מדולל BSA PBS-3% במשך 5 דקות ב RT. לשטוף חמש פעמים עם PBS-NP40. הסר את כל עודפי החיץ.
  15. הר coverslip לשקופית עם 5 בינוני הרכבה μl antifade. חותם עם לק ברור. תמונה מיד באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence עם 20 - 100x מטרות או בחנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך הדמיה מאוחר יותר.
    הערה: בצע כימות כפי שתואר לעיל 23.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

העצרת של גרעינים ב Egg חלץ

הצעדים הראשונים של פרוטוקול זה יערכו את X. laevis לחלץ ביצה (פרוטוקול 1) גרעיני זרע demembranated (פרוטוקול 2). ריאגנטים אלה משמשים לאחר מכן כדי להרכיב גרעיני דה נובו (פרוטוקול 3). איור 1 מציג כמה נתונים נציג. תוספת של סידן שמניע את תמצית ביצה נעצר meiotically לתוך שלבי ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן מוצגת שיטה חדשה לחקר מנגנוני ויסות גודל גרעיני במהלך התפתחות X. laevis . התקדמות התפתחותית קשורה לשינויים דרמטיים בפיזיולוגיה של התא, בחילוף החומרים, בשיעורי החלוקה ובנדידה, כמו גם לשינויים בגודל התאים ובמבנים התוך-תאיים. תהליכים מגוונים אלה הם מורכבים וחיוניים, ולכן קשה לחקור רק אחד מההיבטים הללו של התפתחות בסביבה in vivo . תמצית העובר X. laevis ובדיקת ההתכווצות הגרעינית המתוארת כאן מאפשרות לחקור מנגנוני ויסות גודל בהקשר חוץ גופני , תוך עקיפת האותות המורכבים והאילוצים הפיזיקליים ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

חברי מעבדות לוי וגטלין וכן עמיתים במחלקה לביולוגיה מולקולרית הציעו עצות ודיונים מועילים. רבקה הילד סיפקה תמיכה בשלבים המוקדמים של פיתוח פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי ה-NIH/NIGMS (R15GM106318) והאגודה האמריקאית לסרטן (RSG-15-035-01-DDC).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Alexa Fluor 568 חמור אנטי עכברIgG בדיקות מולקולריותA10037
ATP מלח דיסודיוםסיגמא אולדריץ'A2383
בנזוקאיןסיגמא אולדריץ'E1501
סרום בקר אלבומיןסיגמא אולדריץ'A3059
CaCl2Sigma AldrichC3306
צנטריפוגהבקמןJ2-21M
רוטור צנטריפוגהבקמןJS 13.1
כימוסטטיןסיגמא אולדריץ'C7268
קריאטין פוספט דיסודיוםקלביוכם2380
ציקלוהקסימידסיגמא אולדריץ'C6255
ציטוכלזין Dסיגמא אולדריץ'C8273
חד פעמי מגבונים (kimwipes)סיגמא אולדריץ'Z188956
L-ציסטאיןסיגמא אולדריץ'W326306
EGTAסיגמא אולדריץ'E4378
פורמלדהידסיגמא אולדריץ'F8775
צלחת התגבשות זכוכית (150 x 75 מ"מ)VWR89090-662
גליצרולמקרון5094-16
HEPESSigma AldrichH4034
Hoechst - ביסבנזמיד H 33342 טריהידרוכלורידסיגמא אולדריץ'B2261
HCG - גונדוטרופין כוריוני אנושי Prospechor-250-c
L15 מדיהסיגמא אולדריץ'L4386
לופפטיןסיגמא אולדריץ' L2884
ליזולציטיןסיגמא אולדריץ'L1381
mAb414Abcamab24609
MgCl2EMDMX0045-2
MgSO4 Sigma AldrichM9397
MaltoseSigma AldrichM5885
NP40BDH56009
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710
פניצילין + סטרפטומיציןSigma AldrichPp0781
פפסטאטיןSigma AldrichP5318
צינורותSigma AldrichP6757
סרט פרפין מפלסטיק (פרפילם)Sigma AldrichP7793
KClSigma AldrichP9541
KH2PO4Mallinckrodt70100
KOHBaker5 3140
PMSG - סרום סוסה בהריון GonadotropinProspechor-272-a
NaClSigma AldrichS3014
NaHCO3FisherBP328
Na2HPO4EMDSX0720-1
NaOHEMDSX0590
PestleThomas Scientific3411D56
צינורות זכוכית תחתונים עגולים, 15 מ"לCorex8441
נוגדן משני (Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG)ThermoFisherA10037
סוכרוזCalbiochem8550
ציקלר תרמיBio-RadT100
אולטרה-צנטריפוגהבקמןL8-80M
רוטור אולטרה-צנטריפוגהבקמןSW 50.1
Vectashield (מדיום הרכבה נגד דהייה)וקטורH-1000

מקורות

  1. Conklin, E. Cell size and nuclear size. J. Exp. Embryol. 12, 1-98 (1912).
  2. Wilson, E. B. The Cell in Development and Heredity. , The Macmillan Company. 727-733 (1925).
  3. Levy, D. L., Heald, R. Nuclear size is regulated by importin alpha and Ntf2 in Xenopus. Cell. 143 (2), 288-298 (2010).
  4. Chan, Y. H., Marshall, W. F. Scaling properties of cell and organelle size. Organogenesis. 6 (2), 88-96 (2010).
  5. Walters, A. D., Bommakanti, A., Cohen-Fix, O. Shaping the nucleus: Factors and forces. J Cell Biochem. 113 (9), 2813-2821 (2012).
  6. Webster, M., Witkin, K. L., Cohen-Fix, O. Sizing up the nucleus: nuclear shape, size and nuclear-envelope assembly. J Cell Sci. 122 (Pt 10), 1477-1486 (2009).
  7. Edens, L. J., White, K. H., Jevtic, P., Li, X., Levy, D. L. Nuclear size regulation: from single cells to development and disease. Trends Cell Biol. 23 (4), 151-159 (2013).
  8. Jevtic, P., Edens, L. J., Vukovic, L. D., Levy, D. L. Sizing and shaping the nucleus: mechanisms and significance. Curr Opin Cell Biol. 28, 16-27 (2014).
  9. Levy, D. L., Heald, R. Mechanisms of intracellular scaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 113-135 (2012).
  10. Vukovic, L. D., Jevtic, P., Edens, L. J., Levy, D. L. New insights into the mechanisms and functions of nuclear size regulation. Int Rev Cell Mol Biol. 322, 1-59 (2016).
  11. Jevtic, P., Levy, D. L. Nuclear size scaling during Xenopus early development contributes to midblastula transition timing. Curr Biol. 25 (1), 45-52 (2015).
  12. Hara, Y., Iwabuchi, M., Ohsumi, K., Kimura, A. Intranuclear DNA density affects chromosome condensation in metazoans. Mol Biol Cell. 24 (15), 2442-2453 (2013).
  13. Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. Nuclear structure in cancer cells. Nat Rev Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).
  14. Jevtic, P., Levy, D. L. Mechanisms of nuclear size regulation in model systems and cancer. Adv Exp Med Biol. 773, 537-569 (2014).
  15. Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nat Rev Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
  16. Blom, J. H., Ten Kate, F. J., Schroeder, F. H., van der Heul, R. O. Morphometrically estimated variation in nuclear size. A useful tool in grading prostatic cancer. Urol Res. 18 (2), 93-99 (1990).
  17. Dey, P. Cancer nucleus: morphology and beyond. Diagn Cytopathol. 38 (5), 382-390 (2010).
  18. Cross, M. K., Powers, M. A. Learning about cancer from frogs: analysis of mitotic spindles in Xenopus egg extracts. Dis Model Mech. 2 (11-12), 541-547 (2009).
  19. Voeltz, G. K., Prinz, W. A., Shibata, Y., Rist, J. M., Rapoport, T. A. A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum. Cell. 124 (3), 573-586 (2006).
  20. Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
  21. Edens, L. J., Levy, D. L. Xenopus Development. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , John Wiley & Sons, Inc. 325-345 (2014).
  22. Levy, D. L., Heald, R. Biological Scaling Problems and Solutions in Amphibians. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (1), a019166(2016).
  23. Edens, L. J., Levy, D. L. cPKC regulates interphase nuclear size during Xenopus development. J Cell Biol. 206 (4), 473-483 (2014).
  24. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , 2nd edn, North-Holland Publishing Company. (1967).
  25. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: II. Control of the onset of transcription. Cell. 30 (3), 687-696 (1982).
  26. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30 (3), 675-686 (1982).
  27. Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
  28. Hannak, E., Heald, R. Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts. Nat Protoc. 1 (5), 2305-2314 (2006).
  29. Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods Cell Biol. 36, 581-605 (1991).
  30. Khan, M. A., et al. Quantitative alterations in nuclear structure predict prostate carcinoma distant metastasis and death in men with biochemical recurrence after radical prostatectomy. Cancer. 98 (12), 2583-2591 (2003).
  31. Tan, P. H., Goh, B. B., Chiang, G., Bay, B. H. Correlation of nuclear morphometry with pathologic parameters in ductal carcinoma in situ of the breast. Mod Pathol. 14 (10), 937-941 (2001).
  32. Zeimet, A. G., et al. DNA ploidy, nuclear size, proliferation index and DNA-hypomethylation in ovarian cancer. Gynecol Oncol. 121 (1), 24-31 (2011).
  33. Theerthagiri, G., Eisenhardt, N., Schwarz, H., Antonin, W. The nucleoporin Nup188 controls passage of membrane proteins across the nuclear pore complex. J Cell Biol. 189 (7), 1129-1142 (2010).
  34. Wuhr, M., et al. Evidence for an upper limit to mitotic spindle length. Curr Biol. 18 (16), 1256-1261 (2008).
  35. Loughlin, R., Wilbur, J. D., McNally, F. J., Nedelec, F. J., Heald, R. Katanin contributes to interspecies spindle length scaling in Xenopus. Cell. 147 (6), 1397-1407 (2011).
  36. Wilbur, J. D., Heald, R. Mitotic spindle scaling during Xenopus development by kif2a and importin. eLife. 2, e00290(2013).
  37. Kieserman, E. K., Heald, R. Mitotic chromosome size scaling in Xenopus. Cell Cycle. 10 (22), 3863-3870 (2011).
  38. Maresca, T. J., Freedman, B. S., Heald, R. Histone H1 is essential for mitotic chromosome architecture and segregation in Xenopus laevis egg extracts. J Cell Biol. 169 (6), 859-869 (2005).
  39. MacCallum, D. E., Losada, A., Kobayashi, R., Hirano, T. ISWI remodeling complexes in Xenopus egg extracts: identification as major chromosomal components that are regulated by INCENP-aurora B. Mol Biol Cell. 13 (1), 25-39 (2002).
  40. Goehring, N. W., Hyman, A. A. Organelle growth control through limiting pools of cytoplasmic components. Curr Biol. 22 (9), R330-R339 (2012).
  41. Du Toit, A. Development: Honey, I shrunk the nucleus. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 633(2014).
  42. Buchner, K. The role of protein kinase C in the regulation of cell growth and in signalling to the cell nucleus. J Cancer Res Clin Oncol. 126 (1), 1-11 (2000).
  43. Mochly-Rosen, D., Das, K., Grimes, K. V. Protein kinase C, an elusive therapeutic target. Nat Rev Drug Discov. 11 (12), 937-957 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Xenopus

מאמרים קשורים