פיתחנו שיטה לפגיעה עצבית כדי לבחון באופן מהימן את העצבוב מחדש של השרירים, ובכך התחדשות של צמתים עצביים-שריריים בעכברים. טכניקה זו כוללת פגיעה בעצב הסיבי המשותף באמצעות ניתוח פשוט וניתן לשחזור מאוד. עצבוב מחדש של השרירים מוערך אז על ידי הרכבה שלמה של שריר extensor digitorum longus.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
עצב שׁוֹקִיתִי השיטה פגיעה: A Assay אמין כדי לזהות מבחן הגורמים תיקון Neuromuscular הצומת
במאמר זה
סיכום
תקציר
צומת עצב-שריר (NMJ) עובר שינויים מבניים ותפקודיים מזיקות כתוצאה הזדקנות, פציעה ומחלה. לכן, זה הכרחי כדי להבין את השינויים התאיים ומולקולריים מעורבים בשמירה ותיקון NMJs. לשם כך, פיתחנו שיטה אמין ועקבי לבחון התחדשות NMJs בעכברים. שיטת עצב פגיעה זו כרוכה ריסוק העצב שׁוֹקִיתִי נפוץ כפי שהיא עוברת מעל הראש הלטרלי של גיד שריר הסובך ליד הברך. שימוש עכברות בן 70 יום, אנו מראים כי אקסונים מוטוריים מתחילים reinnervate מטרות postsynaptic קודמים תוך 7 ימים לאחר למעוך. הם לגמרי לכבוש מחדש שטחים הסינפטי הקודם שלהם ב -12 ימים. כדי לקבוע את האמינות של שיטת פגיעה זו, השווינו שיעורי reinnervation בין עכברות ישנות פרט 70 יום. מצאנו כי מספר אתרי postsynaptic reinnervated היה דומה בין עכברים בבית 7, 9, ו -12 ימים למחוץ-פוסט. כדי לקבוע אםassay פגיעה זו יכולה לשמש גם כדי להשוות השינויים המולקולריים בשרירים, בדקנו רמות של למקטע-גמא של קולטן ניקוטינית שריר (גמא-AChR) ואת קינאז ספציפי-שריר (מושק). למקטע גמא AChR ומושק לדוחות אלו שהוגברו מאוד denervation הבאה ולחזור לרמות נורמליות לאחר reinnervation של NMJs. מצאנו קשר הדוק בין רמות תמליל עבור גנים אלה ומצב עצבוב השרירים. אנו מאמינים כי שיטה זו תאיץ את הבנתנו את השינויים התאיים ומולקולריים מעורבים בתיקון NMJ וסינפסות אחרות.
מבוא
בבעלי חיים בוגרים צעירים ובריאים, הצומת העצבי-שרירי (NMJ) הוא חיבור יציב ביותר בין הפרה-סינפסה, קצה העצב של אקסון α-מוטורי, לבין הפוסט-סינפסה, האזור המיוחד של סיב שריר חוץ-פוסאלי שבו קולטני אצטילכולין ניקוטיניים (AChRs) מצטברים באופן סלקטיבי1. המיקום הכמעט מושלם של המנגנונים הקדם-סינפטיים והפוסט-סינפטיים הכרחי להולכה עצבית תקינה, הישרדות של נוירונים α-מוטוריים וסיבי שריר ותפקוד מוטורי. למרבה הצער, תפקוד ה-NMJ מושפע לרעה מהזדקנות, מחלות כגון טרשת אמיוטרופית צידית (ALS), מחלות אוטואימוניות ופגיעה בשרירים ובעצבים היקפיים2-5. עלבונות אלה גורמים לעתים קרובות לניוון של קצות העצבים הפרה-סינפטיים, מותירים את השרירים מנותקים ומשנים באופן משמעותי את המיומנויות המוטוריות. מסיבה זו, זיהוי מולקולות המתפקדות לשמירה ותיקון של NMJ הפך לראש סדר העדיפויות. מכיוון שעצבים היקפיים מתחדשים ומעצבבים מחדש מטרות, נעשה שימוש במודלים של פגיעה עצבית היקפית לזיהוי שינויים מולקולריים הקשורים לחידוש NMJs.
מודלים של פגיעה עצבית היקפית כוללים לעתים קרובות חיתוך או ריסוק מוחלט של ענפי עצב ספציפיים6. לאחר חתך, יש לתקן את הצינור האנדונוריאלי, ולעכב את ההתחדשות האקסונלית והעצבוב מחדש של תאי המטרה והרקמות. חומרת סוג זה של פגיעה גם גורמת לאקסונים להתפתל מהנתיב המקורי שלהם, וכתוצאה מכך הם לא מצליחים להגיע למטרות המקוריות. זאת בניגוד לעצבים שנפגעו באמצעות ריסוק שבו האנדונויריום נשאר רציף, ומספק נתיב לצמיחה מחודשת יעילה ותקינה של אקסונים מתחדשים. זה גם מאפשר לאקסונים למצוא ולעצב מחדש את השותפים המקוריים שלהם לסיבי שריר. ללא קשר למודל הפציעה, ישנם מספר שינויים תאיים ומולקולריים שחייבים להתרחש כדי שהאקסונים יתחדשו ויעצבו מטרות. לאחר פציעה, מקטע העצב הפרוקסימלי למטרה מתפרק ומוסר בתהליך המכונה ניוון וולריאני7. תהליך זה כולל תכנות מחדש ודה-דיפרנציאציה של תאי שוואן לתאים שאינם מיאלינים המפרישים גורמים רגנרטיביים, מנקים מיאלין ומגייסים מקרופאגים לאתר הפגיעה8. מקרופאגים בתורם משלימים את פינוי המיאלין והפסולת האקסונלית, מה שאחרת היה מעכב את הצמיחה של האקסוןהמתחדש 9. במקביל, נוירונים מוטוריים ותחושתיים מפעילים מנגנונים הדרושים לקידום התחדשות האקסונים הקטומים שלהם. ברגע שהאקסון המתחדש מגיע למטרה, עליו להפוך מחרוט גדילה לקצה עצב המסוגל להעביר כראוי (עבור אקסונים מוטוריים) או לקבל (עבור אקסונים חושיים)מידע 10. בהקשר זה, אקסונים אלפא-מוטוריים עוברים סדרה של שינויים מתוזמרים היטב שמגיעים לשיאם בהתמיינות חרוט הגדילה שלהם לקצה עצב פרה-סינפטי מתפקד לחלוטין המתנגד כמעט באופן מושלם לאתר הפוסט-סינפטי בסיב שריר המטרה11.
העצבים הסיאטיים, הטיביאליים והאביזרים היו הבחירות העיקריות לחקר התחדשות אקסונלית ו-NMJ12-14. עם זאת, ישנם מספר חסרונות בעת שימוש במודלים אלה כדי לבחון שינויים תאיים ומולקולריים הקשורים לחידוש NMJs בין בעלי חיים ובתנאים שונים. ראשית, העצב הסיאטי מספק את רוב שרירי הגפה האחורית, כאשר פציעה מגבילה משמעותית הן את התנועה והן את התחושה. לכן לא ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחקור את ההשפעה של פעילות גופנית לבד או בשילוב עם גורמים אחרים. בנוסף, העצב הסיאטי הוא מבנה עבה למדי ולכן דורש כמות גדולה של כוח דחיסה כדי לפגוע במלואו בכל האקסונים. זה בתורו עשוי לגרום לחתך מלא של האקסונים השטחיים יותר תוך השארת הצינור האנדונוריאלי של אקסונים שוכבים עמוקים יותר ללא פגע, מה שמציג שונות משמעותית בקצב ובנאמנות ההתחדשות בין אקסונים אלה. חתך מלא של עצב זה הוא אפילו פחות רצוי בהתחשב בכך שאקסונים רבים לא יצליחו להתחבר מחדש לאותם סיבי שריר. מה שמסבך את העניינים, לעצב הסיאטי יש שונות אנטומית מהותית, הן במספר והן באתר המוצא של ענפי העצב הסופיים שלו. לכן קשה מאוד לפגוע באותו אתר. בעוד שהעצב הטיביאלי קטן יותר ונוח יותר לפציעות ריסוק, אין גם נקודת ציון זמינה לשמש כאתר נגע לענף עצב זה.
ענף העצב האביזר (חלק מהעצב הגולגולתי XI) המספק את שריר הסטרנוקלידומסטואיד שימש גם לחקר התחדשות של NMJs15. עצב זה אטרקטיבי במיוחד מכיוון שניתן לדמות NMJs בשריר הסטרנוקלידומסטואיד בקלות רבה יותר בבעלי חיים בהשוואה ל-NMJs בשרירים אחרים. אך בדומה לעצבים הסיאטיים והטיביאליים, אין נקודת ציון ספציפית שניתן להשתמש בה כדי לפגוע בעצב זה באותו מיקום, מה שמגביל אותו כמודל להשוואת התחדשות של NMJs בקרב בעלי חיים בודדים בקבוצת ניסוי. אתר נגע לא עקבי מציג שונות בשיעורי העצבוב מחדש של NMJ. בשל חסרונות אלה, ההליך המוצג כאן משתמש בפגיעה של ענף עצב היקפי אחר כדי לבחון NMJs מתחדשים.
העצב הסיבי המשותף, הנקרא גם העצב הפרונאלי המשותף, מכיל תכונות רבות שהופכות אותו לעצב אמין לבחינת התחדשות של NMJs בין בעלי חיים ובין טיפולים שונים. לעצב הסיבי המשותף יש מהלך אנטומי צפוי כאשר הוא עובר על גיד הראש הצדדי של שריר הגסטרוקנמיוס בברך, הצומת משמש כנקודת ציון יציבה לנגעים. הגישה לעצב מתבצעת דרך חתך קטן וזעיר פולשני ליד השרירים המעניינים אך מופרד מבחינה אנטומית. הממצאים המוצגים כאן מראים כי אקסונים מוטוריים מתחדשים מתחילים לתקן NMJs בשריר extensor digitorum longus (EDL) 8 ימים לאחר ריסוק העצב הסיבי בעכברים בוגרים צעירים בני 70 יום. חשוב לציין, הדפוס והקצב של העצבוב מחדש עקביים בקרב בעלי חיים מאותו גיל ומין ולכן מספקים מודל פגיעה אמין שיאיץ משמעותית את הבנתנו את השינויים התאיים והמולקולריים הנדרשים לשימור ותיקון NMJs.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים בוצעו על פי הנחיות NIH ופרוטוקולי חיה אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדית וירג'יניה טק ושימוש.
1. בעלי חיים הכנות לקראת ניתוח
- להרדים עכברים בתערובת של קטמין (90 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג / ק"ג) באמצעות זריקה תת עורית מפשעתי עם מזרק אינסולין סטרילי 1 מ"ל. הפתרון המוביל מכיל תערובת של מי מלח 0.9%, 17.4 מ"ג / מ"ל קטמין, ו xylazine 2.6 מ"ג / מ"ל. מניחי חיות בחזרה אל תוך כלובים בזמן המתנת תרופות ייכנסו לתוקף.
הערה: אם מינון העמסה אינו מספק הרדמה מספיק למשך ההליך, תוספת 25% של מינון העמסה ניתן להזריק. - חיות צג לפרסם הזרקה כדי לבדוק מחירי נשימה יציבים ודיכאון מתאים של רמות עוררות. בדוק את הרמה עוררת עם קמצוץ רגל אחורי, שאמורה לעורר שום תגובה כאשר הרדימו מספיק.
הערה: זה בדרך כלל לוקח 3-5דקות עבור עכבר בוגרים צעירים עם ממוצע של 25 עד 30 גרם. אם החיה עדיין תגובה לאחר 10 דקות לאחר ההזרקה, 25% נוספים של מינון העמסה הרדמה ניתן להזריק. - החל וזלין ו משחת עיניים שמן מינרלי אור העיניים של החיה כדי למנוע יובש. הסר חיות מהכלוב ומניחים על משטח נקי וישר. לגלח את הגפיים האחוריים הרצויים מרגל אגן באמצעות גוזם שיער חשמלי, החשיפה בצד הלטרלי רק של האיבר.
- למרוח מסיר שיער כימי לאתר המגולח דקות 1. הסרה ידנית של השיער באמצעות מגבוני מעבדה. לנקות את האזור עם מעבדה מקולף לנגב טבול אתנול.
2. הליך כירורגי
- לעקר מכשירי ניתוח באמצעות חיטוי או שיטה מתאימה אחרת. נקו את האתר כירורגית ולוח כירורגית עם 80% אתנול / H 2 0. לחטא את האתר כירורגית עם proviodine. יש לשים את הסמן על הלוח כירורגית וליישר עם ריסון איבר. לִשְׁמוֹרהגפה האחורית היעד במצב טבעי אנטומית עם מפרק הברך קצת מורחבת ללא סיבוב פנימי או חיצוני.
- מניחים חיה ולוח תחת מיקרוסקופ כירורגי. אוריינט לאתר החתך הסדיר דרך מישוש של ציוני דרך שטחיים, מפרק הברך הגרמי במיוחד ואת הרכס בין קדמי tibialis ואת השרירים הגסטרוקנמיוס.
- עושים חתך כ 3 ס"מ דרך העור באמצעות מספריים או אזמל באביב תוך שימוש מלקחיים כללי עבור מרתק. הפוך את החתך בניצב כמובן שבבסיס של העצב שׁוֹקִיתִי המשותף.
- המשך החתך דרך fascia השטחית, חשיפת femoris שרירי vastus lateralis שרירים. הפרד את השרירים האלה על ידי חיתוך דרך fascia החיבור העמוק. חתך 1-2 ס"מ צריך להספיק.
- לחזור בו שריר הירך הדו-ראשי caudally באמצעות כתיבה מכאנית, חושף את העצבים שׁוֹקִיתִי המשותפים.
- עקבות העצב proximally עד היתר שלהקטע עם גיד של הראש הלטרלי של שריר הסובך נמצא. הערה: זמן חשיפה עשויה לדרוש מניפולציה נוספת של העור והשרירים חזר בו. בצומת זה משמשת ציון הדרך היציבה עבור הפגיעה העצבית.
- אחוז העצב עם מלקחיים בסדר, יישור הטיפים באופן מקביל לגבול הלטרלי של הגיד הגסטרוקנמיוס. למחוץ עצב שׁוֹקִיתִי המשותף על ידי הפעלת לחץ יציב, קשה במשך 5 שניות.
- לאשש למעוך מלא של העצב על ידי בדיקה ויזואלית דרך הטלסקופ כירורגית. היא תופיע שקופה באתר של פציעה. אם באמצעות עכברים לבטא חלבוני קרינת אקסונים פריפריה, את הקרינה תיעלם מן האתר של פציעה.
- הסר כתיבה ויישר מחדש השרירים בעמדות האנטומי שלהם. לסגור את האתר חתך עם 6-0 תפרים משי. 1-3 תפרים קטע פשוט מספיק. מניחי מחל עכבר על כרית חימום בכלוב נקי.
- ניטור כל החיות עבור 2 שעות שלאחר-אופרהtion לבדוק לנשימה וכל תופעות לוואי ההרדמה. נהל מנה ראשונית של עצירות 0.05-0.10 מ"ג / ק"ג באמצעות זריקה תת עורית מפשעתי מיד לאחר ההתאוששות מהניתוח. תן 3 מנות נוספות כל 12 שעות במשך 48 השעות הקרובות. לאחר החלמה מלאה, לחזור עכברים למתקן הטיפול בבעלי החיים.
3. בידוד מכתים של פושטי digitorum Longus (אדי) שרירים
- להקריב חיות באמצעות isoflurane. לוותר 0.5 מ"ל isoflurane נוזל לתוך שפופרת 50 מ"ל ארוז עם labwipes סופג. מניח את הצינור הסגור והפתוח עם החיה בתא 3 אטום 2,500 סנטימטר. לפחות 4 דקות של חשיפה מספיקה. מבחן עבור אובדן palpebral הבילטרליים, הבוהן קמצוץ, ורפלקסים זנב-קורט כדי להבטיח שכל סוס הוא מחוסר הכרה לפני שתמשיך עם זלוף.
- Transcardially perfuse 16 בעלי החיים הראשונים עם 10 מ"ל 0.1M PBS, אז 25 מ"ל של paraformaldehyde 4% ב 0.1M PBS (pH 7.4). הפרין (30 יחידות / 20g משקל חיה) ניתן להוסיף עם PBS (10 יחידות / מיליליטר) כדי למנוע קרישת דם במיטות נימים קטנות, שיפור תוצאות זלוף.
- הסר את עור מכסה גפיים אחוריים באמצעות מספריים לחתוך transversally דרך העור סביב ההיקף של הבטן. מקלפים את העור בעבר הגפיים והרגליים האחוריות באמצעות מלקחיים.
- הסר fascia השטחית של גפיים אחוריים ידי אחיזה ומתקלף עם מלקחיים. אם באמצעות עכברים לבטא חלבוני קרינת אקסונים פריפריה, שלאחר לתקן עכברים כל לילה PFA 4% 50 מ"ל צינורות. לשטוף שלוש פעמים עם PBS.
הערה: עכברים קבועים ניתן לאחסן PBS ב 4 מעלות צלזיוס. אם לא, דלג על שלב זה והמשך לשלב 3.6 בלי חיות שלאחר התיקון. - לנתח את שרירים אדי 18 מ גפיים אחוריים עכבר, ויש להקפיד לשמור הפרוקסימלי וגידים דיסטלי המלאה ככל האפשר.
- דגירה שרירי אדי בחסימת המאגר (PBS 1x המכיל 0.5% Triton X-100, 3% BSA ו -5% נסיוב עז) לפחות 1 שעה.
- כדי להמחיש אקסונים מוטוריים מסופי העצב שלהם, שרירי מקום צינורות המכילים neurofilament (1: 1,000) ו synaptotagmin-2 (1: 250) נוגדנים מדוללים חסימת חיץ במשך 3 ימים. לשטוף שרירים שלוש פעמים עם 1X PBS ו 10 דקות בכל פעם. הערה: דלג על שלב זה אם באמצעות עכברים לבטא חלבונים הקרינה (XFP) אקסונים הפריפריה.
- כתם הנגדי ללא פגע אד כביקורת חיובית עבור עצבוב NMJ מלא. בקרות שליליות צריכות לכלול אד שהושג ב 4 ימים שלאחר פציעה, נקודת זמן שבו NMJ הוא denervated לחלוטין, כמו גם אד מוכתם נוגדנים משני בלבד.
- דגירה שרירית עם נוגדנים משני מתאימים מתויגים fluorescently כדי לזהות neurofilament ו synaptotagmin-2 עבור 1 יום. לשטוף שרירים שלוש פעמים עם 1X PBS ו 10 דקות בכל פעם. הערה: שלב זה יכול להתבצע ביחד עם צעד 3.10. דלג על שלב זה אם באמצעות עכברים לבטא חלבוני קרינת אקסונים פריפריה.
- כדי להמחיש את postsyבאזור naptic של NMJ, דגירה שרירי עם 5 מיקרוגרם / מ"ל Alexa-555-bungarotoxin אלפא מצומדות מדולל חסימת חיץ לפחות 2 שעות. לשטוף שרירים שלוש פעמים עם 1X PBS ו 10 דקות בכל פעם.
- כדי הר השרירים כולה בשקופיות זכוכית בעלי מטען חשמלי חיובי, למקם את השריר ישירות בשקופית, להוסיף כמה טיפות של גליצרול מבוסס הרכבה בינונית בשקופית ומכסים coverslip. לחץ על coverslip נגד השקופיות כדי לשטח את השריר. משרים את התקשורת הרכבה מההיקף של מגבונים במעבדה באמצעות שקופיות coverslip. החל לק כדי לאטום את הקצוות בין coverslip והחלק.
4. הדמיה וניתוח נתונים
- כדי לנתח את המבנה של NMJs, תמונה השריר אדי באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal מצויד להלהיב 488, 555 ו 633 ננומטר אור וללכוד את האור הנפלט עם 20X ו 40X מטרות.
- כדי להמחיש כולו NMJs, ליצור תמונות הקרנת העוצמה המקסימלית של שניות אופטימשא במרווחי 1 עד 2 מיקרומטר בנפרד משתרעת הנמוכה ביותר לאזורים גלויים הגבוה ביותר של NMJ. צור תחזיות בעצמה מקסימלית באמצעות תוכנת הדמיה זמינה מסחרי.
- כדי לקבוע שיעורי reinnervation, לסווג NMJs כמו: 1) לחלוטין denervated = האתר postsynaptic הוא לגמרי נטול קשר עם האקסון, פחות מ -5% colocalization בין האקסון AChRs. 2) חלקית מעוצבבים = האקסון חלקית חופף postsynapse, 5-95% colocalization בין האקסון AChRs. 3) עצבוב מלא = כמעט פרד המושלם בין-סינפסה פוסט טרום, יותר מ 95% colocalization בין האקסון AChRs. אל תכלול NMJs העומד בניצב למישור ההדמיה או אינם מדמיינים מלא בתמונה. הערה: כל הניסויים האלה, לפחות 3 חיות ו -50 NMJs לכל חיה נבדקו. תוצאות נחשבו משמעותיות באמצעות סטודנט מבחן t עם ערך P של פחות מ 0.05.
- כדי לעוור המפעיל, אנשים נפרדים יכולים לבצעניתוח הניתוח ותמונה. ללא ידע של קבוצות הטיפול, הנתח יכול להיות אובייקטיבי עם ניקוד NMJ. לחלופין, תמונות יכולות להיות אקראיות והציגו למפעיל לניתוח ללא ידיעת בעלי חי המקור.
5. PCR כמותי
- להקריב חיות באמצעות isoflurane נקע בצוואר הרחם. סר עור fascia השטחית מכסה שרירי רגליים על פי צעד 3.3. לנתח הקדמי tibialis ואת השרירים אדי פי לשלב 3.4.
- פלאש להקפיא את קדמי tibialis כולו ושרירי אדי צינור 1.5 מיליליטר על חנקן נוזלי. הסרה של רקמה מהצינור ומקום במכתש מראש צונן שקוע חלקית בחנקן נוזלי. טוחני שריר קפוא לאבקה דקה בעזרת מכתש ועלי.
- ממסי אבקת שריר קפוא לתוך מגיב מיצוי RNA זמין מסחרי ולבצע מיצוי RNA וסרת הדנ"א הגנומי עם ערכה זמינה מסחרי על פי i של היצרןnstructions.
- בצע שעתוק לאחור עם שילוב transcriptase הפוך זמין מסחרי על פי הוראות היצרן.
- בצע qPCR באמצעות ערכה זמינה מסחרי באמצעות גני משק מתאימים (ראה טבלה של חומרים). השתמש Cycler תרמית PCR כמוני זמינה מסחרי לבצע PCR (ראה טבלה של חומרים).
- חישול בטמפרטורת גדר ל -58 מעלות צלזיוס. להתאים את הפרמטרים אופניים נוספים למפרט של יצרן של תערובת ירוקה פולימראז תקי / SYBR. כלול צעד עקום להמס סופי בתכנית Cycler תרמית מורכבת 0.5 ° C מגביר מצטבר מ -65 ° C עד 95 ° C כדי לבדוק סגולי פריימר פריימר היווצרות dimer.
- קביעת רמות ביטוי mRNA ביחס ידי 2 - שיטת ΔΔCT 21 באמצעות 18S RNA כמו גן השליטה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
העצב שׁוֹקִיתִי משותף, גם הנקרא העצב peroneal משותף, נובעת גיד הנשה מעל fossa popliteal, שם הוא נדנדות סביב ראשו של שוקית אל ההיבט הקדמי של הרגל (איור 1 א). יש לה סניפים לתוך עצבים שטחיים ועמוקים שׁוֹקִיתִי, יחד לספק את dorsiflexors של כף הרגל ועל בהונות (הקדמי tibialis, longus digitorum פושטי ו brevis, ו פושטי halluces השרירים longus), ואת everters של כף הרגל (שרירי peroneus). גם עצב זה נושא סיבים חושיים מקרינים אל dorsum של כף הר...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השיטה המוצגת בכתב היד הזה מספקת הזדמנויות ייחודיות לזהות מנגנונים המעורבים בתיקון צמתים תוקפות (NMJ). שיטה זו כרוכה ריסוק העצב שׁוֹקִיתִי נפוץ כפי שהיא עוברת מעל גיד הגסטרוקנמיוס ליד הברך. אנו מראים כי רק אחרי 5 שניות של לחץ בעצבים עם מלקחיים, ניוון מוחלט יצוין ב -4 ימים לאחר פציעה. בעכברים בוגרים צעירים, אלפא-מנוע אקסונים מתחילים reinnervate אתרי הסינפטי קודמים השריר פושט אצבעות הארוכות (EDL) ב -7 ימים שלאחר פציעה, ששיאה היה הרפורמציה של אתרי presynaptic שאינם נבדלים מאלו עכברים ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
המחברים מודים לחברי מעבדת ואלדז על המשוב האינטלקטואלי על הניסויים ועל ההערות על כתב היד.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| קטמין | VetOne | 501072 | |
| קסילזין | לויד בע"מ | 003437 | |
| בופרנורפין | זופארם | 1Z-73000-150910 | |
| Nair | Nair | ||
| מגבוני קים | Kimtech | 34155 | |
| סכין גילוח חשמלי | Braintree Scientific | CLP-64800 | |
| 80% EtOH/H20 | |||
| 10% Proviodine | |||
| 1 מ"ל מספריים | |||
| Vannas | 91500-09 | ||
| מס' 15 אזמל | Braintree Scientific | SSS 15 | |
| #5 מלקחיים | Dumont | 11252-00 | |
| 6-0 תפר משי על מחט חיתוך הפוכה | תפר אקספרס | 752B | |
| כרית חימום מכרסמים | Braintree Scientific | AP-R-18.5 | |
| בדיקות מולקולריות | מצומדות אלפא-BTX | B35451 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| אולימפוס סטריאו זום מיקרוסקופ | אולימפוס | 562037192 | |
| Zeiss 700 מיקרוסקופ קונפוקלי | Zeiss | ||
| משאבת זלוף פריסטלטית בזרימה משתנה | Fisher Scientific | 13-876-3 | |
| Aurum Total RNA Mini Kit | Bio-Rad | 7326820 | |
| Bio-Rad iScript RT Supermix | Bio-Rad | 1708840 | |
| SsoFast Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1725200 | |
| Bio-Rad CFX96 | Bio-Rad | 1855196 | |
| Puralube Vet משחה | Puralube | 1621 | |
| Synaptotagmin-2 נוגדנים | נוגדנים-Online | ABIN401605 | |
| נוגדנים נוירופילמנט | נוגדנים-מקוון | ABIN2475842 |
מקורות
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Induction, assembly, maturation and maintenance of a postsynaptic apparatus. Nat. Rev. Neurosci. 2 (11), 791-805 (2001).
- Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease. Front. Neurosci. 8, 252(2014).
- Apel, P. J., Alton, T., et al. How age impairs the response of the neuromuscular junction to nerve transection and repair: An experimental study in rats. J Orthop Res. 27 (3), 385-393 (2009).
- Balice-Gordon, R. J. Age-related changes in neuromuscular innervation. Muscle Nerve Suppl. 5, S83-S87 (1997).
- Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Fox, M. A., Sanes, J. R. Shared resistance to aging and ALS in neuromuscular junctions of specific muscles. PloS one. 7 (4), e34640(2012).
- Nguyen, Q. T., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Pre-existing pathways promote precise projection patterns. Nat. Neurosci. 5 (9), 861-867 (2002).
- Küry, P., Stoll, G., Müller, H. W. Molecular mechanisms of cellular interactions in peripheral nerve regeneration. Curr Opin Neurol. 14 (5), 635-639 (2001).
- Gaudet, A. D., Popovich, P. G., Ramer, M. S. Wallerian degeneration: gaining perspective on inflammatory events after peripheral nerve injury. J Neuroinflammation. 8, 110(2011).
- Chen, P., Piao, X., Bonaldo, P. Role of macrophages in Wallerian degeneration and axonal regeneration after peripheral nerve injury. Acta Neuropathol. 130 (5), 605-618 (2015).
- Chen, Z. -L., Yu, W. -M., Strickland, S. Peripheral regeneration. Annu Rev Neurosci. 30, 209-233 (2007).
- Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions. Nat. Rev. Neurosci. 15 (11), 703-718 (2014).
- Geuna, S. The sciatic nerve injury model in pre-clinical research. J. Neurosci. Methods. 243, 39-46 (2015).
- Batt, J. A. E., Bain, J. R. Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. J. Vis. Exp. (81), e50657(2013).
- Savastano, L. E., Laurito, S. R., Fitt, M. R., Rasmussen, J. A., Gonzalez Polo, V., Patterson, S. I. Sciatic nerve injury: a simple and subtle model for investigating many aspects of nervous system damage and recovery. J. Neurosci. Methods. 227, 166-180 (2014).
- Kang, H., Lichtman, J. W. Motor axon regeneration and muscle reinnervation in young adult and aged animals. J Neurosci. 33 (50), 19480-19491 (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).
- Feng, G., Mellor, R. H., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
- Bowen, D. C., Park, J. S., et al. Localization and regulation of MuSK at the neuromuscular junction. Dev Biol. 199 (2), 309-319 (1998).
- Gay, S., Jublanc, E., Bonnieu, A., Bacou, F. Myostatin deficiency is associated with an increase in number of total axons and motor axons innervating mouse tibialis anterior muscle. Muscle Nerve. 45 (5), 698-704 (2012).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
