פיתחנו שיטה לפגיעה עצבית כדי לבחון באופן מהימן את העצבוב מחדש של השרירים, ובכך התחדשות של צמתים עצביים-שריריים בעכברים. טכניקה זו כוללת פגיעה בעצב הסיבי המשותף באמצעות ניתוח פשוט וניתן לשחזור מאוד. עצבוב מחדש של השרירים מוערך אז על ידי הרכבה שלמה של שריר extensor digitorum longus.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
עצב שׁוֹקִיתִי השיטה פגיעה: A Assay אמין כדי לזהות מבחן הגורמים תיקון Neuromuscular הצומת
במאמר זה
סיכום
תקציר
צומת עצב-שריר (NMJ) עובר שינויים מבניים ותפקודיים מזיקות כתוצאה הזדקנות, פציעה ומחלה. לכן, זה הכרחי כדי להבין את השינויים התאיים ומולקולריים מעורבים בשמירה ותיקון NMJs. לשם כך, פיתחנו שיטה אמין ועקבי לבחון התחדשות NMJs בעכברים. שיטת עצב פגיעה זו כרוכה ריסוק העצב שׁוֹקִיתִי נפוץ כפי שהיא עוברת מעל הראש הלטרלי של גיד שריר הסובך ליד הברך. שימוש עכברות בן 70 יום, אנו מראים כי אקסונים מוטוריים מתחילים reinnervate מטרות postsynaptic קודמים תוך 7 ימים לאחר למעוך. הם לגמרי לכבוש מחדש שטחים הסינפטי הקודם שלהם ב -12 ימים. כדי לקבוע את האמינות של שיטת פגיעה זו, השווינו שיעורי reinnervation בין עכברות ישנות פרט 70 יום. מצאנו כי מספר אתרי postsynaptic reinnervated היה דומה בין עכברים בבית 7, 9, ו -12 ימים למחוץ-פוסט. כדי לקבוע אםassay פגיעה זו יכולה לשמש גם כדי להשוות השינויים המולקולריים בשרירים, בדקנו רמות של למקטע-גמא של קולטן ניקוטינית שריר (גמא-AChR) ואת קינאז ספציפי-שריר (מושק). למקטע גמא AChR ומושק לדוחות אלו שהוגברו מאוד denervation הבאה ולחזור לרמות נורמליות לאחר reinnervation של NMJs. מצאנו קשר הדוק בין רמות תמליל עבור גנים אלה ומצב עצבוב השרירים. אנו מאמינים כי שיטה זו תאיץ את הבנתנו את השינויים התאיים ומולקולריים מעורבים בתיקון NMJ וסינפסות אחרות.
מבוא
בבעלי חיים בוגרים צעירים ובריאים, הצומת העצבי-שרירי (NMJ) הוא חיבור יציב ביותר בין הפרה-סינפסה, קצה העצב של אקסון α-מוטורי, לבין הפוסט-סינפסה, האזור המיוחד של סיב שריר חוץ-פוסאלי שבו קולטני אצטילכולין ניקוטיניים (AChRs) מצטברים באופן סלקטיבי1. המיקום הכמעט מושלם של המנגנונים הקדם-סינפטיים והפוסט-סינפטיים הכרחי להולכה עצבית תקינה, הישרדות של נוירונים α-מוטוריים וסיבי שריר ותפקוד מוטורי. למרבה הצער, תפקוד ה-NMJ מושפע לרעה מהזדקנות, מחלות כגון טרשת אמיוטרופית צידית (ALS), מחלות אוטואימוניות ופגיעה בשרירים ובעצבים היקפיים2-5. עלבונות אלה גורמים לעתים קרובות לניוון של קצות העצבים הפרה-סינפטיים, מותירים את השרירים מנותקים ומשנים באופן משמעותי את המיו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים בוצעו על פי הנחיות NIH ופרוטוקולי חיה אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדית וירג'יניה טק ושימוש.
1. בעלי חיים הכנות לקראת ניתוח
- להרדים עכברים בתערובת של קטמין (90 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג / ק"ג) באמצעות זריקה תת עורית מפשעתי עם מזרק אינסולין סטרילי 1 מ"ל. הפתרון המוביל מכיל תערובת של מי מלח 0.9%, 17.4 מ"ג / מ"ל קטמין, ו xylazine 2.6 מ"ג / מ"ל. מניחי חיות בחזרה אל תוך כלובים בזמן המתנת תרופות ייכנסו לתוקף.
הערה: אם מינון העמסה אינו מספ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
העצב שׁוֹקִיתִי משותף, גם הנקרא העצב peroneal משותף, נובעת גיד הנשה מעל fossa popliteal, שם הוא נדנדות סביב ראשו של שוקית אל ההיבט הקדמי של הרגל (איור 1 א). יש לה סניפים לתוך עצבים שטחיים ועמוקים שׁוֹקִיתִי, יחד לספק את dorsiflexors של כף הרגל ועל בהונות (הקדמי tibialis, longus digitorum פושטי ו brevis, ו פושטי halluces השרירים longus), ואת everters של כף הרגל (שרירי peroneus). גם עצב זה נושא סיבים חושיים מקרינים אל dorsum של כף הר.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השיטה המוצגת בכתב היד הזה מספקת הזדמנויות ייחודיות לזהות מנגנונים המעורבים בתיקון צמתים תוקפות (NMJ). שיטה זו כרוכה ריסוק העצב שׁוֹקִיתִי נפוץ כפי שהיא עוברת מעל גיד הגסטרוקנמיוס ליד הברך. אנו מראים כי רק אחרי 5 שניות של לחץ בעצבים עם מלקחיים, ניוון מוחלט יצוין ב -4 ימים לאחר פציעה. בעכברים בוגרים צעירים, אלפא-מנוע אקסונים מתחילים reinnervate אתרי הסינפטי קודמים השריר פושט אצבעות הארוכות (EDL) ב -7 ימים שלאחר פציעה, ששיאה היה הרפורמציה של אתרי presynaptic שאינם נבדלים מאלו עכברים .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
המחברים מודים לחברי מעבדת ואלדז על המשוב האינטלקטואלי על הניסויים ועל ההערות על כתב היד.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| קטמין | VetOne | 501072 | |
| קסילזין | לויד בע"מ | 003437 | |
| בופרנורפין | זופארם | 1Z-73000-150910 | |
| Nair | Nair | ||
| מגבוני קים | Kimtech | 34155 | |
| סכין גילוח חשמלי | Braintree Scientific | CLP-64800 | |
| 80% EtOH/H20 | |||
| 10% Proviodine | |||
| 1 מ"ל מספריים | |||
| Vannas | 91500-09 | ||
| מס' 15 אזמל | Braintree Scientific | SSS 15 | |
| #5 מלקחיים | Dumont | 11252-00 | |
| 6-0 תפר משי על מחט חיתוך הפוכה | תפר אקספרס | 752B | |
| כרית חימום מכרסמים | Braintree Scientific | AP-R-18.5 | |
| בדיקות מולקולריות | מצומדות אלפא-BTX | B35451 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| אולימפוס סטריאו זום מיקרוסקופ | אולימפוס | 562037192 | |
| Zeiss 700 מיקרוסקופ קונפוקלי | Zeiss | ||
| משאבת זלוף פריסטלטית בזרימה משתנה | Fisher Scientific | 13-876-3 | |
| Aurum Total RNA Mini Kit | Bio-Rad | 7326820 | |
| Bio-Rad iScript RT Supermix | Bio-Rad | 1708840 | |
| SsoFast Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1725200 | |
| Bio-Rad CFX96 | Bio-Rad | 1855196 | |
| Puralube Vet משחה | Puralube | 1621 | |
| Synaptotagmin-2 נוגדנים | נוגדנים-Online | ABIN401605 | |
| נוגדנים נוירופילמנט | נוגדנים-מקוון | ABIN2475842 |
מקורות
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Induction, assembly, maturation and maintenance of a postsynaptic apparatus. Nat. Rev. Neurosci. 2 (11), 791-805 (2001).
- Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
