מאמר שיטה

אפיון תכונות מכאניות Multiscale של רקמת המוח באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי, שפעת זחה, ו Rheometry

DOI:

10.3791/54201

⸱

6 בספטמבר 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Materials Science and Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 3Department of Mechanical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 4Department of Neurology, The F.M. Kirby Neurobiology Center, Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים סט של טכניקות לאפיון התכונות המכניות הויסקו-אלסטיות של המוח בקנה מידה מיקרו, מזו ומקרו.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לעצב מהנדס חומרים בהשראת המאפיינים של המוח, אם עבור simulants המכאני או ללימודי התחדשות רקמות, רקמות המוח עצמו חייבים להתאפיין גם בסקאלות אורך וזמן שונה. כמו רקמות ביולוגיות רבות, רקמת המוח מפגינה מבנה מורכב והיררכי. אולם בניגוד למרבית ברקמות האחרות, המוח הוא של נוקשות מכאניות נמוכות מאוד, עם E moduli אלסטי של יאנג על סדר 100s של אבא. קשיחות הנמוכה כאלו יכול להוות אתגרי אפיון ניסיוני של תכונות מכאניות מפתח. הנה, אנחנו מדגימים כמה טכניקות אפיון מכאניות כי הותאמו כדי למדוד את תכונות אלסטיות viscoelastic של התייבשות, חומרים ביולוגיים תואמים כגון רקמת המוח, בסקאלות אורך שונה ושיעורי טעינה. באותו microscale, אנו עורכים ניסויים השרץ-ציות כוח הרפיה באמצעות הזחה מאופשר מיקרוסקופ כוח אטומי. באותו mesosקייל, אנחנו עורכים ניסויים זחים השפעה באמצעות indenter instrumented מבוסס מטוטלת. באותו macroscale, אנו עורכים rheometry צלחת במקביל לכמת את moduli אלסטי הגזירה התדיר תלויה. אנו גם לדון באתגרים ומגבלות המשויכות לכל אמצעי. יחד טכניקות אלה מאפשרות אפיון מעמיק מכני של רקמת המוח, שניתן להשתמש בהם כדי להבין טוב יותר את מבנה המוח ואת מהנדס חומרים-בהשראה ביולוגית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רוב הרכות-רקמות המרכיבות איברים ביולוגיים הן מכאניות מבני מורכב, של קשיחות נמוכה לעומת עצם mineralized או חומרים מהונדסים, ולהציג שאינו ליניארי תלוי זמן עיוות. בהשוואה לרקמות אחרות בגוף, רקמת המוח הוא תואם להפליא, עם E moduli אלסטי על סדר 100s של אבא 1. מוח רקמות מפגין ההטרוגניות מבנית עם אפור ברור interdigitated ואזורי חומר לבנים כי גם נבדלים מבחינה תפקודית. מכניקת רקמת מוח הבנה תסייע בעיצוב של חומרי מודלים חישוביים לחקות את התגובה של המוח במהלך פציעה, להקל חיזוי של ניזק מכאני, ולאפשר הנדסה של אסטרטגיות הגנה. בנוסף, ניתן להשתמש במידע זה כדי לשקול מטרות עיצוב לשחזור רקמות, וכדי להבין טוב יותר שינויים מבניים ברקמת מוח הקשורים למחלות כמו טרשת נפוצה ואוטיזם. Here, אנו מתארים ולהפגין כמה גישות ניסיוניות הזמינים לאפיין את מאפייני viscoelastic של רקמות תואמות מכאני כולל רקמת המוח, על מייקרו, meso-, ו-קשקשי מאקרו.

באותו microscale, ערכנו שרץ-ציות ולאלץ ניסויי הרפיה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) זחה שבהם מופעלת. בדרך כלל, כניסת מאופשר AFM משמשת להעריך את מודולוס האלסטיות (או נוקשות מיידיות) של מדגם 2-4. עם זאת, אותו המכשיר יכול לשמש גם כדי למדוד viscoelastic microscale (הזמן- או שיעור תלוי) נכסי 5-10. העיקרון של ניסויים אלה, שמוצגים באיור 1, הוא להגביה AFM משתלח בדיקה לתוך רקמת המוח, לשמור על גודל שצוין בכוח או עומק הזחה, ולמדוד את השינויים המתאימים לעומק הפנמת כוח, בהתאמה, לאורך זמן. בעזרת נתונים אלה, אנו יכולים לחשב את השרץ compliance J C מודולוס הרפיה G R, בהתאמה.

באותו mesoscale, ערכנו ניסויים זחים השפעה בתנאים שקוע נוזל כי לשמור על המבנה רקמת ורמות לחות, באמצעות nanoindenter instrumented מבוסס מטוטלת. הגדרת הניסוי מתוארת באיור 2. כפי מטוטלת נדנדות במגע עם הרקמות, לחקור עקירה נרשמת כפונקציה של זמן עד מטוטלת הנדנוד מגיעה לנוח בתוך הרקמה. מתוך תנועה תנודתית הרמוני דיכא וכתוצאה מכך של החללית, נוכל לחשב את מקסימום x עומק החדירה המקסימלי, K קיבולת בזבוז אנרגיה, ו- Q גורם פיזור איכות (המתייחס לשיעור בזבוז אנרגיה) של הרקמה 11,12.

באותו macroscale, השתמשנו rheometer צלחת במקביל לכמת את moduli אלסטי תלויה בתדירות גזירה,כינת מודולוס מודולוס G 'ואובדן האחסון G ", של הרקמה. בסוג זה של rheometry, אנחנו מיישמים זן זוויתי הרמוני (מקביל זן גזירה) בשעה אמפליטודות ותדרים ידועים למדוד מומנט reactional (מקביל מאמץ גזירה) , כפי שמוצג באיור 3. מתוך בפיגור המשרעת והפאזה וכתוצאה מכך של המומנט הנמדד ומשתנים גיאומטריים של המערכת, נוכל לחשב G 'ו-ז' "בתדרים היישומית עניין 13,14.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

משפט ואתיקה: כל הפרוטוקולים הניסוי אושרו על ידי ועדת המחקר בבעלי חיים של החולים לילדים בבוסטון, ומבצעים את המכונים הלאומיים לבריאות מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.

1. הליכי רכישת רקמות עכבר מוח (עבור כניסת AFM מאופשר משולי השפעה)

  1. הכינו תערובת קטמין / xylazine כדי להרדים את העכברים. שלב 5 מ"ל קטמין (500 מ"ג / מ"ל), 1 מ"ל xylazine (20 מ"ג / מ"ל) ו תמיסת מלח 7 מ"ל של 0.9%.
  2. להזריק עכבר (גזע: TSC1; Syn-Cre; PLP-eGFP; גיל: p21; מין: זכר או נקבה) עם 7 μl לכל משקל גוף גרם של הפתרון קטמין / xylazine.
  3. לאחר העכבר הוא בהרדמה מלאה, כפי שהוכח על ידי חוסר בתגובת צובט בוהן וזנב, להרדים את העכבר על ידי עריפת ראש באמצעות מספריים לנתיחה גדולים.
  4. הסר את הגולגולת על ידי חיתוך לאמצע באמצעות מספריים לנתיחה קטנים. החל מ המוחון, remחתיכות אובות של הגולגולת באמצעות מלקחיים מעוקלים. לאחר הסרת הגולגולת, לחלץ את המוח באמצעות מרית שטוחה להרים את המוח, החל משעת המוחון, ומניח את המוח על צלחת פטרי. הסר את המוח הקטן מהמוח באמצעות סכין גילוח.
  5. אם אתם משתמשים במוח כולו לבדיקות כניסת השפעה על רקמות טריות, מוח העביר לתוך צינור עגול תחתי עם 2 CO מזין בינוני עצמאי עבור רקמה עצבית למבוגרי קרח והמשך לסעיף 4. אחרת המשך לשלב 1.6 לחיתוך נהלים.
  6. התאם את הגדרות vibratome למהירות של 0.7 מ"מ / sec, תדר הרטט של 70 הרץ, ואת עובי פרוסה של 350 מיקרומטר. הקף את מנת vibratome עם קרח. מניחים טיפה של דבק מגע לצלחת vibratome ו הר המוח כך שניתן לחתוך פרוסות העטרה, עם המוח אוריינטציה לחתוך את הצד הגבי הראשון.
  7. מלא את צלחת vibratome עם פוספט שנאגר מלוח מספיק Dulbecco (DPBS) פשוט להטביע את המוח. הַעֲלָאָההמנה על vibratome כך להב הוא שקוע רק ב DPBS.
  8. לחץ כדי להתחיל לחתוך חלקים במוח עטרה 350 מיקרומטר עבה.
  9. באמצעות מכחולים, כדי למנוע נזק לרקמות, להעביר את פרוסות המוח מהאמבטיה vibratome DPBS ו לתוך צינור עגול תחתית עם מזין בינוני עצמאית 2 CO עבור רקמה עצבית למבוגרים קרח ולבצע מדידות על רקמה טרי בתוך 48 שעות. כדי להתחיל ניסויים זחים מאופשר AFM, המשך לסעיף 3.

2. נוהלי רכישת רקמות חזיר המוח (עבור rheology)

  1. השג מוח חצי חזירי פרוס sagittally בתוך ~ 1 שעות של קרבה מתוך קצב מקומי. מניח את המוח וחצי 2 CO מזין בינוני עצמאי עבור רקמה עצבית מבוגרת, ולאחסן על קרח.
  2. השתמש סכין גילוח או אזמל לעשות פרוסת מוח עטרה עבה ~ 5 מ"מ ולאחסן CO 2 מזין בינוני עצמאי עבור רקמה עצבית מבוגרת. ודא כי פרוסת surface הוא שטוח ככל האפשר. משתמש בתנועות לרוחב זהירות עם תער / אזמל במהלך חתך.
  3. רקמת מוח חזיר חנות במדיום עצמאי מזין 2 CO עבור רקמה עצבית למבוגרי קרח ולבצע מדידות rheometry (סעיף 5) על רקמות טריות בתוך 48 שעות.

3. כוח אטומי מיקרוסקופ מאופשר הזחה

  1. הכן 60 מ"מ בקוטר פטרי (P60) מנות עם bioadhesive שבלול הנגזרות פי הוראות היצרן.
    1. הכינו מלאי של פתרון חיץ נייטרלי המורכב 0.1 M סודיום ביקרבונט במים סטריליים עם PH אופטימלי של 8.0. מסנן לעקר (0.2 מיקרון) למאגר סודיום ביקרבונט ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
    2. במנדף זרימה למינרית, לערבב פתרון של דבק-ביו 6.25% נבעו-שבלול ו 3.125% NaOH במאגר סודיום ביקרבונט.
    3. 100μl פיפטה של ​​הפתרון ביו-דבק מן 3.1.2 על קצה פיפטה צלחת ושימוש 60 מ"מ בקוטר פטרי (P60) להפיץ solution לעיגול בקוטר 3-5 ס"מ.
    4. השאירו P60 מנות חשפו ברדס זרימה למינרית ולתת להתייבש פתרון (~ 30 דקות). מנות לשטוף 1x עם PBS 2x עם מים סטריליים. בואו אוויר יבש מנות ברדס זרימה למינרית ולאחסן בשקית פלסטיק אטומה ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש 1.
  2. כייל את AFM מדגם מוח הגדרה ב AFM.
    הערה: פעל בהתאם להוראות כיול AFM לפי היצרן.
    1. בזהירות לטעון חללית AFM עם קבוע קפיץ נומינלי של 0.03 N / m וחרוז בורוסיליקט 20 מיקרומטר בקוטר לתוך מחזיק בדיקה.
    2. כייל את קבוע הקפיץ ורגישות מנוף אופטי ההפוך (InvOLS) של שלוחת AFM בשיטת מנגינת תרמית 15,16.
      הערה: לאחר קבוע הקפיץ עבור חללית AFM מחושב, זה צריך להישאר קבוע עם שימוש חוזר. עם זאת, InvOLS השלוחה יהיה צורך recalibrated בכל פעם הליזר משורטט השלוחה. בנוסף, כיולצריכה להתבצע נגד צו מצע כמה גודל נוקשה יותר השלוחה, כגון פוליסטירן.
    3. הפעל את החימום הבמה רכוב והטמפרטורה מוגדרת 37 ° C.
    4. הר פרוסת המוח על מנות P60 המוכנים בסעיף 3.1.
      1. בעדינות יוצקת פרוס מוח עבה 350 מיקרומטר, כמו גם מדיום העצמאי CO 2 מהבקבוק התחתי העגול לתוך צלחת P60 מצופית bioadhesive הנגזרות השבלול.
      2. על ידי הטיית צלחת P60 בעדינות, מקם את פרוסת המוח במרכז המנה. במידת צורך, פיפטה לאט בינוני מתוך pipetter ידני נפרש פרוסת מוח אשר מקופלת על על עצמו או יותר מיקום פרוסת המוח במרכז המנה.
      3. מוציאים בזהירות התקשורת עודף באמצעות pipetter P1000 (לא להשתמש ואקום).
      4. מניח כיסוי על צלחת P60 ולתת פרוסת המוח לדבוק במשך 20 דקות.
    5. הסר את ראש AFM, למקם את פרוסת המוח הרכוב P60צלחת על הבמה AFM, ולהוסיף ~ 2 מ"ל מראש חימם 2 CO בינוני עצמאית.
    6. בזהירות להוסיף טיפה של תקשורת על חללית AFM כדי להגן עליו מפני שבירה בשל שטח מתח כאשר הוא הוריד לתוך תקשורתי סביב פרוסת המוח.
    7. למקם את ראש AFM לבמה, ולהתחיל הרכנת הראש עד שהוא שקוע לתוך התקשורת.
    8. באמצעות מצלמת CCD-מבט מלמעלה, למקם מחדש את לייזר על גבי שלוחה.
      הערה: היישור של הליזר על השלוחה תהיה השתנתה מעט בשל השוני מקדם שבירה של אוויר ובינוני.
    9. מתן 5 דקות עבור השלוחה להסתגל שאני שקוע בתוך נוזל חם, ולאחר מכן לאפס את היישור במראה כדי סטייה חינם של 0 V.
    10. הפעל ספקטרום תרמית על חללית AFM פי הוראות היצרן 16. השתמש בכושר שיא התרמית הראשון מחדש לחשב את InvOLS של חללית AFM בתקשורת.
    11. באמצעות מיקרוסקופ אופטי,להזיז את הבמה המדגמת כך את האזור של עניין המוח מתחת חללית AFM.
      הערה: כפיס המוח יופיע כהה כפי שהוא אטום יותר מאשר החומר האפור שמסביב. קליפת המוח היא עדיפה על כפיס המוח.
    12. אפס את היישור במראה כדי סטייה חינם של 0 V.
    13. על הסכום ומטר הסטה בתוכנת AFM, לחץ "מעורבות" כדי להעסיק את ראש AFM.
    14. באמצעות עמדת החיוג על ראש AFM, מנמיך את הראש עד קשר בין השלוחה ואת המדגם הוא עשה.
  3. (אופציונאלי) אם תרצה, למדוד את מודולוס האלסטיות של המדגם, כפי שתואר לעיל 4,17,18.
  4. ניסויי ציות שרץ.
    1. לבנות פונקצית כוח ליישם בעורך הפונקציה של התוכנה. פונקצית הכח מורכבת רמפת 0.1 שניות עד לנקודת סט של 5 ננ והחזק אותו במשך 20 שניות, ואחריו שניות 1 כבש לכוח היישומית 0 NN.
      1. על הזחה Master Pאנל, לפי שיטת הכניסה, בחר "Load" עבור Indenter מצב; "N" עבור יחידות; ו "עורך פונקציה" לתפקוד Indenter.
      2. בעורך הפונקציה, על מגזר לוח Parms, צור פלח פונקצית כוח ליישם שמתחיל ב 0 NN, ומסתיים 5 NN, עם זמן של 0.1 שניות. לחץ על "הוספה ->".
      3. במקטע הבא, בחר להתחיל 5 NN, קץ 5 NN, וזמן עד 20 שניות. לחץ "כנס ->."
      4. במקטע האחרון, קבע מתחילים 5 NN, קץ 0 NN, וזמן 1 שניות. לחץ על "לצייר" ולסגור את חלון עורך פונקציה.
    2. על חיל Tab של לוח ההורים, לבדוק "רמפת indenter לאחר הדק" ולהגדיר את פונקצית הכח המופעל על הדק לאחר שהגיע לנקודת הפעלה של 0.1 V.
    3. לחץ "יחיד חיל" על החלק התחתון של חיל Tab של לוח ההורים, אשר יפעיל את פונקצית הכח להחיל בנוי לעמידת שרץ.
    4. לאחרכניסת כוח אחד הוא סיים, להעלות את ראש AFM כך שזה מתוך קשר עם המדגם מחדש ולאחר מכן להעסיק את הראש מחדש אפס סטייה בחינם.
    5. למקם את הבמה מדגם לאתר תחום עניין חדש, ולהפחית את הראש AFM ליצור קשר. הערה: ראש AFM חייב להיות חזר בו מן השטח מדגם כאשר הבמה מדגם מועבר. אי ביצוע הוראה זו עלולה לגרום ניזק שלוחת AFM העדינה.
    6. חזרו על שלבי 3.4.3-3.4.5 עד כמות הנתונים רצויה נאספה.
  5. ניסויי הרפית כוח.
    1. לבנות פונקצית כניסה שיושמה עורך הפונקציה של התוכנה. פונקצית הכניסה מורכבת רמפת 0.1 שניות עד לנקודת סט של 3 מיקרומטר והחזק אותו במשך 20 שניות, ואחריו שניות 1 כבש לעומק זח של 0 מיקרומטר.
      1. בלוח מאסטר הזחה, לפי שיטת הכניסה, בחר "הזחה" עבור Indenter מצב; "מ" עבור יחידות; ו "; עורך פונקציה "לתפקוד Indenter.
      2. בעורך הפונקציה, על מגזר לוח Parms, צור פלח פונקצית כוח ליישם שמתחיל ב 0 מיקרומטר, ומסתיים 3 מיקרומטר, עם זמן של 0.1 שניות. לחץ על "הוספה ->".
      3. במקטע הבא, בחר להתחיל 3 מיקרומטר, קץ 3 מיקרומטר, וזמן עד 20 שניות. לחץ "כנס ->."
      4. במקטע האחרון, קבע מתחילים 3 מיקרומטר, קץ 0 מיקרומטר, וזמן 1 שניות. לחץ על "לצייר" ולסגור את חלון עורך פונקציה.
    2. על חיל Tab של לוח ההורים, לבדוק "רמפת indenter לאחר הדק" ולהגדיר את פונקצית הכח המופעל על הדק לאחר שהגיע לנקודת הפעלה של 0.1 V.
    3. לחץ "יחיד חיל" על החלק התחתון של חיל Tab של לוח ההורים, אשר יפעיל את הפונקציה כניסה להחיל נבנתה לרגיעת כוח.
    4. לאחר כניסת כוח אחד הוא סיים, להעלות את ראש AFM כך שזהמתוך קשר עם המדגם ולאחר מכן לשוב וללבוש את ראש הסטייה מחדש אפס.
    5. מיקום מחדש את הבמה כדי לאתר שטח חדש של עניין, ולהפחית את הראש כדי ליצור קשר.
    6. חזור על שלבי 5.3-5.5 עד כמות הנתונים רצויה נאספה.
  6. להסיק ניסויים וניקוי.
    1. לאחר שסיים ניסויים, להעלות את ראש AFM ולהסירו מן המדגם.
    2. השתמש רקמות במעבדה כדי להסיר עודפי נוזלים בזהירות בלי לגעת השלוחה.
    3. בזהירות לנקות את בעל שלוחה AFM באמצעות כמות קטנה של אתנול. אין לחשוף את האלקטרוניקה העדינה על בעל שלוחת אתנול. הסר השלוחה ומקום AFM במכל אחסון.
    4. השלך את דגימת רקמות המוח על ידי ביצוע פרוטוקולי בטיחות ביולוגי מתאימים.
  7. באמצעות MATLAB, לחשב תאימות השרץ ולאלץ moduli הרפיה שימוש בגיאומטריה indenter, על פי הפתרון הנובע ידי לי Radok 1960 19.
    1. חישוב הכח F ועומק זח figure-protocol-1 מנתונים על z עמדת שלוחה, סטיית ד, ו קבוע קפיץ, ג k

      figure-protocol-2 ו figure-protocol-3 .
    2. אתר את נקודת המגע לאורך עקומת הכניסה באמצעות האלגוריתם המתואר לין et al. 20.
    3. גדר חלון עניין לניתוח נתונים. החלון של עניין הוא האזור בו גם כוח (לתאימות השרץ) או עומק ההזחה (לרגיעה כוח) נשמר לפי שווי setpoint (כלומר, אזור 3 כפי שמוצג באיור 1C, D).
    4. בניסויי ציות שרץ, לחשב את מודולוס ציות השרץ הניסיון, ג J (t), בתגובת עומס צעדn 1 "src =" / files / ftp_upload / 54,201 / 54201eq4.jpg "/>:
      figure-protocol-4 ,
      כאשר H (t) הוא פונקצית צעד Heavyside ו R הוא הרדיוס של החללית הכדורית.
    5. בניסויי הרפית כוח, לחשב את מודולוס הרפית כוח הניסיוני, G R (t), בתגובה לעומק זחת צעד figure-protocol-5 :
      figure-protocol-6 .

4. השפעת הזחה

  1. כייל את nanoindenter המאובזרת ולהתאים הגדרות ברירת מחדל כדי לאפשר ניסויי השפעה דינמיים על רקמות מוח hydrated פי הוראות היצרן.
    1. הר בדיקה כדורית ידי החלקתה על המטוטלת באמצעות פינצטה.
    2. מדביקי מדגם קוורץ התמזג על הפרסום המדגם, אשר מוברג לתוך translationalשלב.
    3. לכו לתפריט כיול ובחר "נוזל התא." פעל על פי ההוראות של התוכנה כדי ליצור קשר עם מדגם קוורץ התמזגו.
    4. בחר "רגילה" עבור סוג Indenter ולהשתמש ערך ברירת המחדל של 0.05 Mn עבור טען Indenter. לחץ על "המשך" כדי לבצע את הכיול עבור תצורת indenter הנורמלית.
    5. הזז את הבמה מדגם בחזרה על ידי 5 מ"מ לפחות. הר זרוע המנוף, המאפשרת הבדיקה כדי להיות וריד לתוך נוזל התא, וחזור על כיול נוזל תא בתצורה החדשה על ידי בחירה "נוזל תא" עבור סוג Indenter. לחץ על "המשך" כדי לקבל את פקטור כיול נוזל התא.
    6. הפעל את אפשרות תוכנת נוזל תא על ידי הלחיצה על תפריט הניסוי ובחירה "אפשרויות מיוחדות." השתמש ערך הכיול האחרון.
    7. להגדיל את מרווח צלחת קבלים כמו זה יוביל עד לעומק מדידים מרבי גדול, אשר הכרחי כאשר בודקים גדולחומרים תואמים hly.
      1. בתפריט המערכת, בחר "הגדרות מוגנות ללא" ו "מכונת פרמטרים" כדי לשנות את שיעור עומס בדיקת מטוטלת, שיעור עומס אפס, רמפת מתנה לקזז 0.5 MN / sec, 0.1 MN / sec, ו -3 V, בהתאמה.
      2. עם מפתח ברגים, להפוך את שלושת אגוזים שולט כיוון השעון מרווח צלחת קבלים במרווחים קטנים.
      3. לאחר כל תור שלם בכיוון השעון, בחר "התאמת תיבת גשר" תחת תפריט תחזוקה ולקבל מבחן מטוטלת טוב, אשר יחייב הזזת משקל נגד מאזן הרחק המטוטלת.
      4. חזור על שלבים 4.1.7.2-4.1.7.3 עד כיול עומק משוער קורא ערך של 70,000 ננומטר / V ומעלה.
    8. מקם עצירת מגבלה חדשה בתחתית המטוטלת שניתן להדליק ולכבות באמצעות ספק כוח. לחזור בו תחנת הגבול המקורית יושבת מאחורי המטוטלת כדי להסיר מכשול פוטנציאלי של המטוטלת ולאפשר גבוהיםמירויות השפעה כמו גם במעמקי חדירה גבוהים לתוך דגימות תואמות.
    9. אפשר הקבינט כדי להגיע לשיווי משקל תרמי (לוקח כ 1 שעה).
    10. בעוד הקבינט equilibrates, לחזור לתפריט המערכת ובחר "הגדרות מוגנות ללא" ו "פרמטרים של מכונה." הגדר את כיול העומק (dcal) קשר המהיר עד 1 מיקרומטר / sec, מהירות קשר הזחה העיקרית עד 3 מיקרומטר / sec, ואת מהירות קשר עומס אולטרה הנמוכה עד 1 מיקרומטר / sec.
    11. בתפריט הכיול, בצע כיול עומק סטנדרטי תצורה חדשה זו.
    12. הפעל את אספקת החשמל של סולנואיד ולהגדיר אותו ל -10 V. עבור לתפריט ניסוי ובחר "אימפקט" ו "התאם אימפולס תזוזה." פעל בהתאם להוראות תוכנה (הנחיות אוטומטיות) כדי לכייל את מרחק התנופה של המטוטלת.
  2. הר רקמת מוח עכבר בתא הנוזלי.
    1. לאחר קצירת המוח כולו מן STEp 1.5, לאחסן אותו מיד ב- CO 2 מזין בינוני עצמאית למדיה רקמה עצבית למבוגרים קרח.
    2. כאשר ההתקנה הזחה השפעה תושלם במלואה, בזהירות להעביר את המוח לתוך צלחת פטרי יחד עם 2 CO בינוני עצמאית. פורסים את המוח לתוך 6 מ"מ חלקים עבים עם משטחים שטוחים משני צדי.
    3. ציית את רקמת פרוס לתפקיד מדגם אלומיניום עם שכבה דקה של דבק cyanoacrylate.
    4. חלק את התא הנזיל בהיקף של למעלה O-Ring השני על הפרסום המדגם, ולמלא את נוזל התא עם 5 מיליליטר של מדיום עצמאי 2 CO לטבול את הרקמה מלאה. פירסום המדגם מכן הוא רכוב בזהירות על הבמה translational בתוך nanoindenter המאובזרת.
  3. למדוד את תגובת ההשפעה של רקמת המוח.
    1. במידת הצורך, הסר את החללית כדורית ולהחליף אותו עם החללית של עניין מבלי להסיר את זרוע המנוף.
    2. בתפריט המערכת, בחר "ללא מוגןהגדרות "ו" פרמטרים של מכונה. "שנו את מהירות קשר ההשפעה העיקרית עד 5 מיקרומטר / sec.
    3. עם מדגם אמבטיה נמוכה (כיוון -Z) ורחוק המטוטלת (+ x כיוון), לנוע בכיוון -x עד הקצה על זרוע המנוף ממוקם כראוי מעל האמבט. צעד בכיוון + Z עד הקצה הוא שקוע לחלוטין בתוך האמבטיה מול המדגם.
    4. באמצעות חלון מדגם שליטת במה, ליצור קשר בזהירות, ואחר כך שוב בשלב ממשטח המדגם בכ -30 מיקרומטר.
    5. בתפריט הניסוי, לחץ על "שפעת" כדי להגדיר ניסוי השפעה. בחר טעינה ספציפי דחף שיתייחס ישירות מהירות ההשפעה שמתקבל על סמך כיול מרחק התנופה. הפעל את הניסוי המתוכנן.
    6. כאשר המטוטלת נעה הלוך שטח המדגם ממשיך לנוע למישור המדידה, סובב את המתג להפסיק גבול התחתון כבוי.
    7. שים לב כמו מטוטלת נדנדות forwARD להשפיע על המדגם. העקירה של החללית כפונקציה של זמן תתועד על ידי התוכנה.
    8. כשחלון xyz הבמה מופיע, סובב את המתג להפסיק להגביל מחדש.
    9. חזור על שלבים 3.4-3.8 כדי לבדוק כמה מטענים במקומות שונים לפי הצורך.
  4. ניתוח העקירה רכשה לעומת זמן תגובה של המטוטלת באמצעות סקריפטים MATLAB מותאמים אישית כדי לקבוע את מקסימום x עומק חדירה המקסימאלי, K קיבולת בזבוז אנרגיה, ו- Q גורם איכות פיזור. 11
    1. לכו לתפריט הניתוח ולייצא את הנתונים בקובץ טקסט.
    2. קח את נגזרת הזמן של פרופיל העקירה להשיג מהירות כפונקציה של זמן. גדר אפס תזוזה כמו O1 x נקודת קשר.
      הערה: נ מהירות השפעה היא המהירות המרבית הערב לפנות מקסימום x תואם את העיוות שבו החללית.מהירות הפוחתת ראשונה לאפס. x O2, שהוא שווה ערך ל x r, הוא המיקום הנדרש כדי לחדש את הקבלה במגע עם המדגם המעווה במחזור הבא. V המהיר ריבאונד החוצה הוא המהירות ב r x העקירה.
    3. גדר K (unitless) כאנרגיה הנצרכת על ידי המדגם מתוקנן לפי סכום האנרגיות המדגמות התאוששו התפוגגו במהלך מחזור ההשפעה הראשון. חישוב K מבוסס על המאפיינים הפנימיים של המטוטלת 21 (כגון קשיחות סיבוב ריסון), x O1, x max, x r, v ב, ומתוך נ.
      הערה: לקבלת מידע נוסף, ניתן להתייעץ העבודה של Kalcioglu ואח ', 2011..
    4. מאז עקירה ניתן לתאר תנועה תנודתית הרמונית דכאה, להתאים פונקצית דעיכה מעריכית אל המקסימום של דיסמיקום לעומת עקומת זמן.
    5. חישוב ש (unitless) כמו π כפול מספר מחזורים נדרש עבור משרעת התנודה להקטין בפקטור של e. ערך Q גבוה יותר פירושו שיעור פיזור אנרגיה נמוך יותר.

5. Rheology

  1. הגדרה וכיול של rheometer לפי הוראות היצרן.
    1. אתחל את rheometer ידי פתיחת החלונית מכשיר / שליטה. בכרטיסיית לוח בקרה, לחץ על "לאתחל".
    2. הר צלחת מדידה 25 מ"מ בקוטר (PP25) ומערכת תרמית.
    3. (אופציונאלי) כדי להפחית פליטה בין לוחות rheometer ואת הרקמות, לגזור פרוסות נייר זכוכית דבק התואמות את הצורה של צלחת rheometer העליונה לדבוק נייר הזכוכית לצלחת העליונה ותחתונה.
    4. הפוך על קשר בין הצלחת העליונה ותחתונה על ידי לחיצה על "להגדיר אפס פער" בלוח הבקרה.
    5. אפס מתמר כוח נורמלי על ידי CLIcking "לאפס כוח נורמלי."
    6. לבצע בדיקת אינרציה ידי פתיחת לשונית השירות בלוח הבקרה, לחיצה על "מערכת מדידה," ולאחר מכן לחיצה על "מבחן אינרציה". רשום את האינרציה הישנה וחדשה. ודא כי האינרציה היא בתוך מגבלת המותר עבור החללית, כמפורט על ידי היצרן.
  2. טען מדגם לתוך rheometer.
    1. לאחר קצירת רקמות חיתוך קטע העטרה של המוח חזיר ~ 5 מ"מ עובי, ולאחסן אותו על הקרח ב- CO 2 בינוני עצמאית.
    2. מניח את המוח בין שתי הצלחות. הסר טיפות מים גדולות מן המשטח העליון והתחתון של המדגם כדי למנוע החלקה, אבל לא לייבש את המדגם.
    3. לאט לאט להוריד את צלחת המדידה עד שהצליח במגע מלא עם המשטח העליון של הרקמה ואת הכח הנורמלי הנמדד עקבי 0.01 Mn לאחר תקופת רגיעה 5-10 דקות.
      1. בלוח הבקרה, זן לגבהים נמוכים ברציפות in בתיבת מדידת המיקום ולוחץ על "מדידת מיקום" להנמיך את צלחת המדידה לאט.
      2. כאשר בתוך מילימטר של מגע עם הרקמות, מנמיך את צלחת המדידה במרווחי 0.1 מ"מ עד שהצלחת מלאה במגע עם המשטח העליון של הרקמה. ודא כי הכח הנמדד-הנורמלי הוא עקבי 0.01 Mn לאחר תקופת רגיעה 5-10 דקות.
      3. רשום את הכח הנורמלי המדוד הראשוני. מדידות חוזרות יש לנקוט באותו מדגיש / זנים דחיסה.
    4. חתוך את המדגם עם להב פלסטיק אם המדגם עולה על הקוטר של הצלחת. פיפטה בנפח קטן (~ 1-2 מ"ל) של התקשורת על הקצוות של המדגם כדי ללחלח את הרקמה.
    5. (אופציונלי) מנמיכים את מכסה המנוע תרמית. בלוח הבקרה, להגדיר את הטמפרטורה עד 37 מעלות צלזיוס ולחץ על "להגדיר".
  3. בצעו לטאטא המשרעת להקים בטווח viscoelastic ליניארי של החומר (כלומר, גזירהזנים שבו G 'ו-ז' 'הם קבועים) בתדרים של עניין (למשל, 1 rad / sec).
    1. בחר "קובץ / חדש". בכרטיסייה ג'ל בחר "לטאטא Amplitude: טווח LVE." בחר חלון ולחץ על "מדידה 1:. לטאטא משרעת" לחץ לחיצה כפולה על תיבת התנודה. הזן את זן התחלתי וסופי (למשל, 0.01 כדי 105), תדירות (למשל, 1 rad / sec) ואת מספר הנקודות לכל עשור (למשל, 6 נקודות / דצמבר). בחר "אישור" ולחץ להתחיל. "
    2. חזור על הליך זה במשך כמה פרוסות עם ניסויים חוזרים ונשנים על מנת להבטיח עקביות של הטווח ליניארי אלסטי. הדחיסה הצירית של המדגם צריכה להישאר קבועה בין דגימות.
  4. לנהל תדר מטאטא של הרקמה זן בטווח viscoelastic ליניארי של רקמות (למשל, 1% זן) 22, ובבית טווח תדרים של עניין (למשל, 0.1-100 rad / sec).
    1. נְקִישָׁה "קובץ / חדש" תחת לשונית ג'ל בוחר "תדר לטאטא." לחץ חלון / מדידה 1: לטאטא תדר. לחץ לחיצה כפולה על תיבת התנודה. הזן את טווח התדרים (למשל, 0.1 כדי 100 rad / sec), זן (למשל, 1% זן) ומספר נקודות לעשור (למשל, 6 נקודות / דצמבר). "בסדר" בחר ולחץ על "התחל" כדי ליזום את לטאטא תדירות.
  5. לטאטא תדירות חזור (שלב 5.4) ב כפילויות או triplicates.
  6. בדוק את הנתונים המחושבים וייצא אוטומטית על ידי rheometer: G 'ו-ז' "כפונקציה של (לטאטא תדר) תדירות או זן גזירה (לטאטא משרעת) הערה:. G" ו- G '' מחושבים מתוך (מקסימום של המדגם T reactional משרעת מומנט) '0, וזווית עקירת סיבוב (או זווית הטיה) figure-protocol-7 בפיגור, והפאזהמשוואה 1 "src =" / files / ftp_upload / 54,201 / 54201eq9.jpg "/>, תשובת מדגם לזן תנודתית יישומית (איור 3):
    figure-protocol-8
    figure-protocol-9
    כאשר R ו- H הוא הרדיוס וגובה של המדגם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 4 מראה הפנמת כוח נציג לעומת תגובות זמן (איור 4 ב ', ה) לתאימות שרץ ולאלץ ניסויי הרפיה, בהתחשב כוח שימושי או עומק הזחה (איור 4 א, ​​ד), בהתאמה. בעזרת נתונים אלה ואת הגיאומטריה של המערכת, ג J השרץ הציות (t) ולאלץ הרפיה moduli G R (t) ניתן לחשב עבור אזורים שונים של המוח (איור 4C, F). בעוד שמחקרים קודמים הראו הבדל בין moduli אלסטי של אזורים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקה כל המוצג במאמר זה מודד היבטים שונים של תכונות מכניות של המוח רקמות. תאימות זחילה ו moduli הרפית המתח הם מידה של תכונות מכאניות תלוי זמן. Moduli האחסון והאובדן מייצג תכונות מכאניות תלוי שיעור. כניסת שפעת גם מודדת תכונות מכאניות תלוי מקום, אבל בהקשר של פיזור אנרגיה. כאשר ואפיון תכונות מכניות רקמות, הן הזחה AFM מאופשר ו rheology משמשים שיטות נפוצות. כניסת AFM מאופשר חשובה מאוד מכיוון בנוסף לספק תכונות חומר תלוי זמן, פרמטרים ניסיוניים שונים ניתן להשתמש כדי למדוד תא מודולוס אלסט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים על תמיכתם בעבודה זו על ידי האגודה הלאומית לטרשת נפוצה ומרכז סימונס למוח החברתי. BQ מודה על התמיכה מתוכנית המלגות לתואר שני במדע והנדסה של ההגנה הלאומית של ארה"ב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קסילזיןלויד מעבדהתרופת מרשם
קטמיןאנאסד זריקות תרופתמרשם
ויברטום (מיקרוטום להב רוטט)LeicaVT1200
Hibernate-A בינוניGibcoA1247501CO2 מדיום עצבי בלתי תלוי לרקמות בוגרות
מיקרוסקופ כוח אטומי, MFP-3D-BIOAsylumResearch-Petri
ToolHeater AsylumResearch-AFM
0.03 N/m, 10  ומיקרו; m רדיוס כדור בורוסיליקטNovascanPT.
Cell-TakCorning354240דבק ביולוגי שמקורו בצדפות
נתרן ביקרבונטS5761ניתן להשתמש בספקים חלופיים
נתרן הידרוקסיד, 1 NSigma-Aldrich59223Cספקים חלופיים ניתן להשתמש ב-Instrumented
Indenter, NanoTest VantageMicro Materials Ltd.-יש לעבד את קצה הבדיקה (אגרוף שטוח מפלדה, 1  קוטר מ"מ, 4-5  אורך מ"מ)
NanoTest תא נוזלימיקרו חומרים בע"מ-
ריאומטר צלחת מקביל MCR501אנטון-פאר-PP25
 ניתן להשתמש בלוח מדידה שטוח בקוטר 25 מ"מAnton-Parr-25
נייר זכוכית דבקMcMaster-Carr4184A48ספקים חלופיים
Loctite 4013 Instant AdhesiveHenkel20268ניתן להשתמש בספקים חלופיים
Probe, GSשל מ"מ

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van Dommelen, J. A. W., Hrapko, M., Peters, G. W. M. Mechanical Properties of Brain Tissue: Characterisation and Constitutive Modelling. Mechanosensitivity of the Nervous System. , 249-281 (2009).
  2. Liu, F., Tschumperlin, D. J. Micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (54), e2911(2011).
  3. Peaucelle, A. AFM-based mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments. (89), e51317(2014).
  4. Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (76), e50497(2013).
  5. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Vivanco, M. dM., Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation and creep on living cells with the atomic force microscope: a means to calculate elastic moduli and viscosities of cell components. Nanotechnology. 21, 445101(2010).
  6. Desprat, N., Richert, A., Simeon, J., Asnacios, A. Creep function of a single living cell. Biophysical Journal. 88 (3), 2224-2233 (2005).
  7. Lu, H., Wang, B., Ma, J., Huang, G., Viswanathan, H. Measurement of creep compliance of solid polymers by nanoindentation. Mechanics Time-Dependent Materials. 7 (3/4), 189-207 (2003).
  8. Cheng, L., Xia, X., Scriven, L. E., Gerberich, W. W. Spherical-tip indentation of viscoelastic material. Mechanics of Materials. 37, 213-226 (2005).
  9. Kalcioglu, Z., Qu, M., Van Vliet, Multiscale characterization of relaxation times of tissue surrogate gels and soft tissues. 7th Army Science Conference Proceedings. , (2010).
  10. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Vivanco, M. D., Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation microscopy: Imaging local stress in cells. Journal of Biomechanics. 43 (2), 349-354 (2010).
  11. Kalcioglu, Z. I., Qu, M., et al. Dynamic impact indentation of hydrated biological tissues and tissue surrogate gels. Philosophical Magazine. 91 (7-9), 1339-1355 (2011).
  12. Kalcioglu, Z. I., Ra Mrozek, R. a, Mahmoodian, R., VanLandingham, M. R., Lenhart, J. L., Van Vliet, K. J. Tunable mechanical behavior of synthetic organogels as biofidelic tissue simulants. Journal of Biomechanics. 46 (9), 1583-1591 (2013).
  13. Janmey, P. A., Georges, P. C., Hvidt, S. Basic rheology for biologists. Methods in Cell Biology. 83, 3-27 (2007).
  14. Miller, K., Kurtcuoglu, V. Biomechanics of the Brain. , Springer Science & Business Media. (2011).
  15. Lévy, R., Maaloum, M. Measuring the spring constant of atomic force microscope cantilevers: thermal fluctuations and other methods. Nanotechnology. 13 (1), 33-37 (2002).
  16. Fuierer, R. Basic Operation Procedures for the Asylum Research MFP-3D Atomic Force Microscope. MFP-3D Procedureal Operation "Manualette". , Asylum Research. (2006).
  17. Elkin, B. S., Ilankovan, A., Morrison, B. Age-dependent regional mechanical properties of the rat hippocampus and cortex. Journal of Biomechanical Engineering. 132, 011010(2010).
  18. Elkin, B. S., Azeloglu, E. U., Costa, K. D., Morrison, B. Mechanical heterogeneity of the rat hippocampus measured by atomic force microscope indentation. Journal of Neurotrauma. 24 (5), 812-822 (2007).
  19. Lee, E. H., Radok, J. R. M. The Contact Problem for Visooelastic Bodies. Journal of Applied Mechanics. 27 (3), 438-444 (1960).
  20. Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
  21. Constantinides, G., Kalcioglu, Z. I., McFarland, M., Smith, J. F., Van Vliet, K. J. Probing mechanical properties of fully hydrated gels and biological tissues. Journal of Biomechanics. 41 (15), 3285-3289 (2008).
  22. Shen, F., Tay, T. E., et al. Modified Bilston Nonlinear Viscoelastic Model for Finite Element Head Injury Studies. Journal of Biomechanical Engineering -- Transactions of the ASME. 128 (5), 797-801 (2006).
  23. van Dommelen, J. aW., vander Sande, T. P. J., Hrapko, M., Peters, G. W. M. Mechanical properties of brain tissue by indentation: Interregional variation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 3 (2), 158-166 (2010).
  24. Rother, J., Nöding, H., Mey, I., Janshoff, A. Atomic force microscopy-based microrheology reveals significant differences in the viscoelastic response between malign and benign cell lines. Open biology. 4 (5), 140046(2014).
  25. Du, P., Lu, H., Zhang, X. Measuring the Young's Relaxation Modulus of PDMS Using Stress Relaxation Nanoindentation. Symposium DD - Microelectromechanical Systems - Materials and Devices III. 1222 (c), (2009).
  26. Elkin, B. S., Morrison, B. Viscoelastic properties of the P17 and adult rat brain from indentation in the coronal plane. Journal of Biomechanical Engineering. 135, 114507(2013).
  27. Brands, D. W., Bovendeerd, P. H., Peters, G. W., Wismans, J. S., Paas, M. H., van Bree, J. L. Comparison of the dynamic behavior of brain tissue and two model materials. 43rd Stapp Car Crash Conference Proceedings. , 313-320 (1999).
  28. Hrapko, M., van Dommelen, J. A. W., Peters, G. W. M., Wismans, J. S. H. M. Characterisation of the mechanical behaviour of brain tissue in compression and shear. Biorheology. 45 (6), 663-676 (2008).
  29. Pogoda, K., Chin, L., et al. Compression stiffening of brain and its effect on mechanosensing by glioma cells. New Journal of Physics. 16 (7), 075002(2014).
  30. Peters, G. W. M., Meulman, J. H., Sauren, A. A. H. J. The applicability of the time/temperature superposition principle to brain tissue. Biorheology. 34 (2), 127-138 (1997).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Brain Tissue CharacterizationAtomic Force MicroscopyImpact IndentationRheometryViscoelastic PropertiesMechanical CharacterizationCreep ComplianceForce RelaxationFrequency SweepHydrated Tissue

מאמרים קשורים