מאמר שיטה

קומפלקס polyelectrolyte למשלוח גורם הגדילה osteogenic דומיין כריכה הפרין

DOI:

10.3791/54202

⸱

22 באוגוסט 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Centre for Research in Medical Devices (CÚRAM), National University of Ireland Galway, 3Department of Bioengineering, Faculty of Engineering, National University of Singapore, 4Tissue Engineering Program, National University of Singapore, 5Department of Orthopaedic Surgery and the Orthopaedic Hospital Research Center, University of California, Los Angeles

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קומפלקסים פוליאלקטרוליטים בהרכבה עצמית (PEC) המיוצרים מהפרין ופרוטמין הופקדו על חרוזי אלגינט כדי ללכוד ולווסת את שחרורם של גורמי גדילה אוסטאוגניים. אסטרטגיית אספקה זו מאפשרת הפחתה של פי 20 של מינון BMP-2 ביישומי איחוי עמוד השדרה. מאמר זה ממחיש את היתרונות והייצור של PECs.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך ניתוחי עצם שיקומיים, כמויות supraphysiological של גורמי גדילה נטענות באופן אמפירי על פיגומים לקדם ואיחוי העצמה מוצלח. מינונים גבוהים של חומרים ביולוגיים חזקים מאוד נדרשים בשל חוסר יציבות גורמת גדילה כתוצאת שפלת אנזימטית מהירה כמו גם חוסר יעילות המוביל לאיתור כמויות מספיקות של גורם גדילה באתרי שתל. לפיכך, אסטרטגיות להאריך את היציבות של גורמי גדילה כגון BMP-2 / נל-1, ולשלוט שחרורם באמת יכול להפחית את המינון שלהם יעיל ובכך להפחית את הצורך במינונים גדולים יותר במהלך ניתוחים התחדשות העצם בעתיד. זה בתורו יפחית תופעות לוואי ועלויות גורם גדילה. פץ עצמית התאסף כבר מפוברקת כדי לספק שליטה טובה יותר של BMP-2 / נל-1 משלוח באמצעות הפרין פעילות ביולוגי גורם גדילה להגביר עוד יותר מחייב על ידי שיפור יציבות vivo. כאן אנו מדגימים את הפשטות של ייצור PEC אשר מסייעת deliveר"י של מגוון של גורמי גדילה במהלך ניתוחי עצם שיקומיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תחולת pseudoarthrosis דווחה להיות גבוה ככל 10 עד 45% בניתוחים בעמוד השדרה היתוך השדרה ניווניות ותיקון 1. כדי להפחית את שיעור pseudarthrosis במהלך היתוך שדרה וניתוחי עצם שיקומיים אחרים, גורמי גדילת osteogenic כגון BMP-2, נל-1 1 ו גורם גדילה טסיות נגזר (PDGF) הוכנסו לקדם דה נובו osteogenesis. בין אלה, BMP-2 היא בחירה פופולרית עבור היתוך השדרה 2. למרות העוצמה של BMP-2 בזירוז והקלה היווצרות העצם החדש כבר מבוססת היטב 3; סיבוכים משמעותיים קליני כגון היווצרות עצם heterotopic, seroma היווצרות שטף דם, תגובה דלקתית, radiculitis, osteolysis גוף שדרה, שפיכה מדרדרת ממשיכים להיות בעיות של דאגה בשל כמויות supraphysiological בשימוש 4,5.

לכן, הוריד המינון של BMP-2 נשאר אסטרטגיה רלוונטית בביתמפתה כדי למזער תופעות לוואי. חוץ מזה, מערכות הספק יעילות נדרשות לדכא את שחרור הפרץ הראשוני של BMP-2 שנצפה מערכות ספק ספוג עכשווי קולגן נוסף לשיפור שירות ממושך המקומי של ציטוקינים זה חזק. השכבה-ידי שכבתי הרכבה העצמית לסירוגין polyelectrolytes קטיוני anionic יכולה להיות מועסקת כשיטה מתכוננת להקים מתחמי polyelectrolyte על פני השטח של מטריצות פיגום או חומרים מושתלים 6. מבחינה זו, הפרין (ידוע שיש צפיפות המטען השלילית הגבוהה ביותר של כל הגורמים הביולוגיים) הוכר לאגד בשקיקה עם מגוון רחב של גורמי גדילה באמצעות תחומים מחייבים אלקטרוסטטי הפרין. ואכן, הפרין הוכח להאריך את זמן מחצית החיים ובכך להגביר את הפעילות הביולוגית של גורמי גדילה אחדים.

על בסיס זה, הקבוצה שלנו מותאמת פרוטוקול שכבה אחר שכבה הרכבה עצמית לפברק קומפלקס polyelectrolyte מבוסס הפרין (PEC) כי המון ומשמר את bioactivities של גורמי גדילה osteogenic במהלך קיבוע 7,8. ליבת microbead אלגינט היה מפוברק על ידי crosslinking α-L-guluronate (G) שאריות של אלגינט עם divalent קטיון יוני סידן או סטרונציום. ליבת אלגינט היא מטריצת פיגום מתכלה; אשר לאחר ההשתלה, הוא resorbed במיטה היתוך מתן מקום ingrowth הגרמי. פולי- L- ליזין (PLL) או protamine משמש כשכבת קטיוני כדי לשזור בשתי המטריצה ​​הפיגום (במקרה זה, ליבת המוביל microbead אלגינט) ואת הפרין טעונים שלילית; בעוד שכבת פונקציות הפרין anionic לייצב בתרגום גורמי גדילה טעון. השכבה המשולשת PEC הוכחה להגדיל את קיבולת טעינה גורם גדילה במודל חזירי 9. לאחרונה, ספקי PEC הוכחו להפחית את המינון האפקטיבי בהצלחה של BMP-2 על ידי לפחות פי 20 חולדה 10 ומודלים חזיריים של היתוך שדרת 8.

ntent "> כאן אנו מדווחים שיטות פץ בודה למסירת גורם גדילה מוגברת היתוך שדרה ואת ניתוחי עצם שיקומיים האחרים באמצעות BMP-2 כגורם צמיחת osteogenic מודל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת פתרון אלגינט

  1. ממיסים 200 מ"ג של אלגינט נתרן (לא מוקרן) או 400 מ"ג של 8 MRad מוקרן אלגינט נתרן ב 10 מ"ל מים מזוקקים פעמיים ולנער עבור שעה 1 עבור אלגינט הלא הקרין ו -15 דקות עבור אלגינט מוקרן. אחסן את הפתרון אלגינט על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. סנן הפתרון אלגינט עם מסנן 0.2 מיקרומטר מזרק סטרילי לפני ייצור microbead אלגינט.

2. ייצור אלגינט Microbead

  1. לחטא את הגנרטור חרוז אלקטרוסטטי משאבת מזרק עם 70% אתנול ו למקם אותם Class II הקבינט בטיחות ביולוגית (איור 1).
  2. מניח כיור זכוכית עם בר ומערבבים מגנטי בתוך גנרטור החרוז.
  3. הגדר את האלקטרודה הזרוע של הגנרטור החרוז 9 סנטימטרים מעל הכיור.
  4. חברו את כבל האלקטרודה של הגנרטור חרוז אל בורג המחורצים 2 של האלקטרודה הזרוע, ויוצקים 80 מ"ל של תמיסת 2 SrCl לתוךאַגָן.
  5. טען 5 מ"ל של 0.2 מיקרומטר פתרון אלגינט מסונן לתוך הצינור מזרק וגומי. לאחר חיבור צינור גומי אל האלקטרודה הזרוע, לעבור על משאבת מזרק 5 מ"ל / שעה למשך 2 דקות כדי לגרש את האוויר בתוך צינורות ולספק הפתרון אלגינט אל קצה הזרבובית. כבה את משאבת מזרק.
  6. לאחר מכן, לעבור על encapsulator ולאחר מכן, משאבת מזרק כדי להתחיל דור microbead. הגדר את קצב הזרימה אלגינט ב 5 מ"ל / שעה ואת המתח 5.8 kV על encapsulator. מחק את microbeads שנוצר במהלך בשתי הדקות הראשונות (או פתרון 0.5 מיליליטר אלגינט הראשוני שאוב מן המזרק), כמו microbeads אלה נוטה להיות בגודל לא סדיר בצורה.
  7. אסוף microbeads לאחר בתמיסה כלוריד 0.2 M סטרונציום. כבה את משאבת מזרק ואת encapsulator (בסדר הזה) לאחר שאיבה בהיקף מתוכנן מראש של פתרון אלגינט. חזור על פעולה זו עבור קבוצות עוקבות של ייצור microbead. בסיום, להפוך שלf משאבת מזרק הראשון, ואחריו encapsulator.
  8. אחסן את microbeads ב 20 מ"ל של תמיסת כלוריד 0.2 M סטרונציום ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי להשלים לחצות קישור ולייצב את הג'ל.

3. מדידת גודל של microbeads אלגינט

  1. אסוף 0.5 מ"ל של microbeads אלגינט עם טפטפת פלסטיק ומניחים אותו בשקופית זכוכית. הצג את microbeads תחת מיקרוסקופ אופטי בהגדלה 10X. קח עשר תמונות של microbeads עם מצלמת CCD מיקרוסקופ. שמור את התמונות עם סרגל מידה (500 מיקרומטר) בפורמט TIFF ברזולוציה 2,048 x 1,536.
  2. שימוש בכלים בהרחבה ImageJ, למדוד את גודל microbeads וגמא בר (איור 2). המרת אורך microbeads מן פיקסל מיקרומטר.
    1. הקש על כלי השורה למתוח קו על פני באמצע חרוז אלגינט.
    2. לחץ על "נתח" על שורת התפריטים ובחר "מדוד". חלון מוקפץ יופיע.
    4. המרת בקוטר של חרוז אלגינט אורך בפועל באמצעות הנוסחה: אורך של חרוז אלגינט / אורך של סרגל מידה x 500 מיקרומטר. לדוגמה, 1.420 (קוטר נמדד על ידי ImageJ) / 2.657 (אורך סרגל קנה המידה שהיא נמדדת על ידי ImageJ) * 500 מיקרומטר = 267 מיקרומטר.
  3. קח למשל את הגודל הממוצע של 100 microbeads (ממוצע ± סטיית תקן) כמו גודל הנציג של כל מנה של microbeads.

עיקור 4.

  1. אסוף את microbeads באמצעות מסננת ניילון 100 מיקרומטר ולשטוף את החרוזים עם מים מזוקקים פעמיים.
  2. בעזרת מרית, להעביר את כל microbeads עשוי פתרון אלגינט 0.1 מ"ל לתוך צינור 2 מ"ל microcentrifuge ומכסים גזה כדי למנוע התייבשות.
  3. לבסוף, לחטא את microbeads ידי מעוקר באמצעות מצב נוזלי (115 ° C, 15 דקות) או בהתאם מטרהמפרטים של anufacturer. להוסיף 1.5 ליטר של מים מזוקקים לתא למנוע חרוזים מהתייבשות.

5. protamine ציפוי הפרין

  1. בתוך מכסה המנוע BSL-2, דגירה microbeads סטרילי עם 1 מ"ל של 2 מ"ג / פתרון protamine מ"ל (עיקור באמצעות מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר.
  2. לאחר דוגרים microbeads עבור שעה 1 (שלב 5.1), לאסוף 150 μl של פתרון protamine עבור חומצה bicinchoninic מיקרו (microBCA) מבחן (סעיף 6).
  3. שטפו את microbeads מצופה protamine פעמיים עם מים מזוקקים פעמיים. ספין למטה באמצעות צנטריפוגות העליון הספסל ב XG 200 במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר צנטריפוגה, לשאוב מים באמצעות מזרק.
  4. דגירה microbeads מצופה protamine עם 1 מ"ל של 0.5 מ"ג / פתרון הפרין מ"ל (עיקור באמצעות מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר) למשך 30 דקות כדי ליצור מורכבות polyelectrolyte (PEC).
  5. לאחר דוגרי f microbeads מצופה protamineאו 30 דקות (שלב 5.4), לאסוף 400 μl של פתרון הפרין כדי לקבוע את תוכן הפרין (סעיף 7).
  6. לאחר דגירה, לשטוף את הפרין מאוגד מן פץ על ידי שטיפה פעמיים עם מים מזוקקים פעמיים.

תוכן protamine 6.

  1. בצע את בדיקת microBCA לפי הוראות יצרן. בקצרה, להוסיף 150 פתרון protamine μl (לפני ואחרי הדגירה עם microbeads) לתוך צלחת 96 באר. להוסיף 150 פתרון עובד μl microBCA.
  2. השתמש פתרון אלבומין (0, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 40 ו -200 מיקרוגרם / מ"ל) כסטנדרט כיול.
  3. דגירה את התערובת למשך 60 דקות ב 60 מעלות צלזיוס. מדוד את הספיגה עם ספקטרופוטומטר ב 562 ננומטר.
  4. השתמש עקומת התקן כדי לקבוע את ריכוז protamine של כל מדגם לא ידוע על פי הוראות היצרן.
  5. קבע את התוכן protamine של microbeads ידי קיזוז הסכום הכולל של protamine בפתרון הציפוי (לפני הדגירה עם microbeads) מהסכום של protamine שנותרו פתרון הציפוי (לאחר דגירה עם microbeads).

7. תוכן הפרין

  1. הכן את 10 מ"ל של הפתרון עובד על ידי המסת 4 toluidine מ"ג נתרן כלורי כחול 20 מ"ג 0.01 N חומצה הידרוכלורית.
  2. להוסיף 400 μl של מדגם (משלב 5.5) כדי הפתרון עובד לפי יחס של 2: 3 ו מערבולת למשך 30 שניות.
  3. להוסיף 600 μl של n-הקסאן (בהיקף שווה ערך ל הפתרון מגיב עבודה) ו מערבולת את התערובת כדי לחלץ את מורכבות הפרין toluidine הכחולות.
  4. לשאוב 200 μl של השלב המימי על ידי מזרק לאחר הפרדת פאזות.
  5. מדוד את כמות toluidine הכחולה-חילוץ בלתי כלולה בשלב המימי באמצעות ספקטרופוטומטר ב 631 ננומטר.
  6. הכינו פתרונות סטנדרטיים הפרין של 0-20 מיקרוגרם / מ"ל.
  7. מגרש את הקריאה 631 ננומטר של כל תקן הפרין לעומת ריכוז הפרין מיקרוגרם / מ 'l. השתמש עקומת התקן כדי לקבוע את הריכוז הפרין של כל דגימה.

8. תמונה Confocal של מבנה שכבה אחר שכבה

  1. לפברק protamine, הפרין ונל-1 / BMP-2 אנלוגי פלורסנט CF-405 protamine (כחולה), CF 594 הפרין (אדום) ואת FITC שכותרתו נל-1 / FITC שכותרתו (ירוק) BMP-2 + הפרין + protamine פי יצרן גיליון נתונים טכני.
  2. מעיל 100 מיקרוגרם microbeads עם 300 μl של אנלוגי ניאון (שיטת ציפוי כמתואר 5.3-5.6) CF-405 protamine (כחול) (2 מ"ג / מ"ל, 1 hr הדגירה), CF 594 הפרין (אדום) (0.5 מ"ג / מ"ל, 30 דקות) ו FITC שכותרתו נל-1 / FITC שכותרתו (ירוק) BMP-2 (1.5 מ"ג / מ"ל, לילה). שטפו את microbeads פעמיים עם מים מזוקקים כדי לחסל את protamine, הפרין ניאון מאוגד ונל-1 / BMP-2.
  3. שימו לב למבנה שכבה אחר שכבה (איור 3) באמצעות מיקרוסקופ confocal בהגדלה 10X. 7

9. BMP-2ונל-1 ספיגת שחרור

  1. טען 13.3 μl של 1.5 מ"ג / מ"ל ​​של תמיסת BMP-2 או נל-1 על 100 מיקרוגרם של PEC. דגירת PEC על 4 מעלות צלזיוס מתחת לגיל 30 סל"ד רעדו במשך 10 שעות.
  2. לטבול את microbeads ב 1 מ"ל של בופר פוספט (PBS) בשעה 37 ° C עם רעד קבוע (30 סל"ד).
  3. אסוף 1 מ"ל של supernatant ולהחליפה 1 מ"ל PBS לאחר 1, 3, 6, 10 ו -14 ימים.
  4. להעריך את הספיגה ולשחרר יעילות של BMP-2 בשיטת ELISA פי הפרוטוקול של היצרן. להעריך את הספיגה ולשחרר יעילות של נל-1 בשיטת assay חלבון carboxybenzoyl quinoline-2-carboxaldehyde (CBQCA) על פי הפרוטוקול של היצרן.
  5. לקבוע שחרור מצטבר בשלב (t):
    שחרור מצטבר זמן (t) = שחרור בשלב (t) + השחרור קודם בשלב (t-1).
  6. מגרש שחרור מצטבר של BMP-2 ו נל-1 נגד הזמן.

10. במבחנת פעילות ביולוגיתשל-1 נל

הערה: הפעילות הביולוגית של נל-1 שוחררה מבית PEC הוערכה על ידי מדידת יכולתה להגדיל את הביטוי של phosphatase אלקליין (ALP) בתאי גזע ארנב מח עצם (rBMSC).

  1. זרע 20,000 rBMSCs לכל היטב צלחת 24 גם ולאפשר להם לגדול במשך יום אחד עם 1 מיליליטר של המדיום של הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) + 10% בסרום שור עוברי (FBS) ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  2. לאחר 24 שעות, להחליף בינוני עם 1 מ"ל של מדיום osteogenic (DMEM בתוספת 10% FBS, סטרפטומיצין פניצילין 2%, 50 מיקרוגרם / מ"ל חומצה אסקורבית, 10 מילימול / ליטר בטא glycerophosphate, ו -10 -8 mol / L dexamethasone ) למשך 7 ימים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  3. מניח 300 מיקרוגרם PEC-נל-1 (משלב 8.2) ו PEC בתוך מוסיף תרבית תאים (להוסיף TC) כדי לשמור על שרירי החזה נפרדים מן התאים (זה ימנע את הכישלון של microbeads PEC במהלך השינוי הבינוני osteogenic). TC מקום להכניס לתוך 24 גם plאכלו במשך 14 ימים.
  4. אחת לשלושה ימים, לשאוב 1 מ"ל של המדיום osteogenic ידי הצבת מחט מחוץ הכנס TC, ולהחליף עם 1 מ"ל של מדיום osteogenic טריים.
  5. לאחר 7 ו -14 ימים של דגירה, לקבוע פעילות ALP עם ערכת assay ALP בהתאם הפרוטוקול של יצרן הערכה.
    1. Lyse תאים עם חיץ assay המכיל 0.1% TritonX-100 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. אל תגרד את תאים דבקים באמצעות מגרד תא. דגירת השעית תא ב 4 מעלות צלזיוס מתחת תסיסה במשך דקות 60 לפחות.
    2. צנטריפוגה השעית התא ב 2500 XG ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. אסוף את supernatant עבור assay ALP.
    3. הוסף 50 μl של פתרון סטנדרטי phosphatase אלקליין בדילול סדרתי מן 200 עד 0 ng / ml אל הבארות של צלחת 96 באר. הסכומים הסופיים לסטנדרטי phosphatase אלקליין 10, 5, 2.5, 1.2, 0.6, 0.3, 0.15, ו -0 ng / טוב.
    4. מוסיפים את supernatant משלב 10.5.2 (50 μl / טוב) ו לדלל עם ב דילולuffer.
    5. הוסף 50 μl של פוספט p -nitrophenyl (pNPP) פתרון המצע לבאר כל אחד. מערבבים את ריאגנטים ידי טלטול הצלחת בעדינות למשך 30 שניות. דגירה את התערובת למשך 30 דקות בחושך. מדוד את הספיגה ב 405 ננומטר על ידי קורא צלחת.
    6. חישוב פעילות ALP באמצעות עקומת כיול.
  6. לקבוע תכולת החלבון באמצעות ערכת assay חלבון microBCA פי הוראות היצרן. לנרמל את פעילות ALP ידי חלוקת פעילות ALP ידי תכולת החלבון.

כדאיות התא 11.

  1. דגירה 200 מ"ג של PEC-נל-1 עם 1 מ"ל של FBS DMEM + 10% ב 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות עבור 3- (4,5-dimethylthiazol-2-י.ל.) -2,5-diphenyltetrazolium ברומיד (MTT) assay.
  2. זרע 2,000 rBMSCs לכל טוב (100 μl של DMEM עם 10% FBS) בצלחת 96 היטב דגירה במשך 1 יום ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  3. החלף DMEM + 10% FBS עם 100 μl של תמצית PEC-נל-1 / PEC דגירהב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  4. לאחר יום 1 או 3 ימים של דגירה, להוסיף 10 μl של 5 מ"ג / פתרון MTT מ"ל דגירה נוספת ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 4 שעות בחושך.
  5. הוספת 100 פתרון DMSO μl היטב כל להמיס את הגבישים formazan.
  6. קבע את הספיגה ב 570 ננומטר באמצעות קורא microplate.
  7. לחשב את שיעור הצמיחה היחסית:
    figure-protocol-1

אריזה 12. לתוך הפיגום ו- BMP-2 & נל-1 Loading

  1. ארוז את שרירי החזה לתוך הנקבוביות של Polycaprolactone כיתה רפואית bioresorbable - פוספט תלת-סידן (mPCL-TCP) פיגום בעזרת מרית מעוקרת בתוך חדר BSL-2.
  2. הוסף 1.5 מ"ג / מיליליטר פתרון של BMP-2 או נל-1 על פיגום mPCL-TCP העמוס PEC דגירת הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במנשא שלנו, protamine נבחר כתחליף של פולי- L- ליזין שכן יש תכונות כימיות דומות וזה FDA אישר כנוגדן של הפרין. תוצאות מיקרוסקופ אופטיות הראו כי microbeads הלא המוקרן היו בעלי צורה כדורית בקוטר של 267 ± 14 מיקרומטר. (0.35 זרבובית מ"מ, קצב הזרימה של 5 מ"ל / hr & 5.8 קילו וולט). רוב microbeads המוקרן הם בצורת דמעה. הקוטר נמדד על החלק העגול של microbeads מוקרן היה 212 ± 30 מיקרומטר (0.35 זרבובית מ"מ, קצב הזרימה של 4 מ"ל / hr & 6 קילו וולט).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג שיטה לעריכת פץ דרך שכבה אחר שכבה הרכבה עצמית. שכבת-ידי שכבת המבנה דמיינו באמצעות אנלוגים הניאון של protamine, הפרין, BMP-2 ו נל-1 ו מיקרוסקופיה confocal. ספיגה ובדיקות לשחרר מראים כי הפרין על PEC מתווכת ספיגה ושחרור גורם גדילת osteogenic. היעילות הספיגה של שיטת PEC היא: נל-1: 86.7 ± 2.7%, BMP-2: 70.5 ± 3.1%. מנשא PEC יש אפנון טוב יותר של נל-1 (20%) שחרור לעומת נשאית ספיחת משטח טהורה כגון חלקיקי אפטיט סידן (40-80%) 11.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין לנו ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרים אלה מומנו על ידי המועצה הלאומית למחקר רפואי, מדען קליני - מענק מחקר אישי (CS-IRG), NMRC/CIRG/1372/2013 ו-NMRC EDG/0022/2008.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אקרוקדיסק מדעי החיים 25  מסנן מזרק מ"מ עם 0.2  ומיקרו; m Supor ממברנהPALL PN4612פרוטמין סטרילי, תמיסת הפרין על ידי אולטרה-סינון
24 באר צלחתתא כוכב 662160
96 באר צלחת Nuclon Delta משטחThermo Fisher Scientific167008
(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide), MTTSigma AldrichM5655למדוד ציטוטוקסיות של PEC-NELL-1
אצטוןפישר מדעיA/0600/17משקעים CF-405
פרוטאמין מסומן
Alamar BlueInvitrogen, Life TechnologiesDAL 1025מדידת ציטוטוקסיות של
ערכת בדיקת פוספטאז אלקליין (ALP)AnaspecAS-72146
אמוניום כלורידMerckArt 1145מגיב עצירה בתיוג FITC
נטול מים דימתיל סולפוקסיד (DMSO)Invitrogen, Life TechnologiesD12345ממס לאיזותיוציאנט פלואורסצנטי I
דימתיל סולפוקסיד ( DMSO)Sigma AldrichDissolve  formazan 
AutoclaveHirayamaHU-110עיקור חרוזי אלגינט על ידי קיטור
בטא-גליצרופוספטSigma AldrichG9422
BMP-2 (ערכת השתלת עצם גדולה II) מדטרוניק סופרמור דאנק, ממפיס טנסי, ארה"ב7510800גורם גדילה אוסטאוגני, יש צורך בדיאליזה כדי להסיר רכיב מייצב המפריע לצימוד FITC
קרבוקסיבנזואיל קינולין-2-קרבוקסלדהיד (CBQCA) Thermo Fisher ScientificA-6222לכימות מסננת תאים של חלבון NELL-1
(100  ומיקרו; m)BD Science352360החזק PEC עבור
מגרד תאים לבדיקת ALP 290  מ"מ להב רחב 20  מ"מSPL Life Science90030נתק את התא מצלחת 24 בארות
CF 405S, Succinimidyl EsterSigma AldrichSCJ4600013צבע פלואורסצנטי כחול לתיוג פרוטמין
CF 594, HydrazideSigma AldrichSCJ4600031צבע פלואורסצנטי אדום עמוק לתיוג הפרין
צנטריפוגהBeckman CoulterMicrofuge 22R
מיקרוסקופ קונפוקליאולימפוס FV1000
דקסמתזוןסיגמא אולדריץ'D4902מרכיב של מדיום גידול אוסטאוגני
עמודי התפלה דקסטרןפירס (תרמו מדעי) 43230
DMEMגיבקו 12320
BMP-2 קוונטיקין ELISA ערכתמחקר & D SystemDBP200קבע שחרור BMP-2
סרום בקר עוברי FBSHycloneSV30160.03
Fluoescein Isothiocyananate, איזומר ISigma AldrichF7250צבע פלואורסצנטי ירוק לתיוג NELL-1 ו-BMP-2
תוספות תרבית תאים ThinCert,
עבור 24 צלחות באר, גריינר סטרילי		 662630מונע שטיפת PEC בעת החלפת מדיום אוסטאוגני
משאבת מזרק Havard Appartus (11 פלוס)Havard Apparatus70-2208
n-Hexane (>99%)Sigma Aldrich139386
HeparinSigma AldrichH3149נקשר עם גורם גדילה אוסטאוגני
עם תחום קשירת הפרין
חומצה הידרוכלורית (37%)Merck100317
קלסרחממהמאוד C8150
ערכת בדיקת חלבון MicroBCA Thermoscientific23235
קורא מיקרופלייטTecanInfinite M200לבדיקות ALP ו- microBCA
אנקפסולטור תאים NiscoEngineering Incיחידת אנקפסולציה VAR V1
מיקרוסקופ פלואורסצנטיאולימפוספיגום IX71
mPCL-TCP (גודל הנקבוביות הוא 1.3  mm)OsteoporePCL-TCP 0/90Hold PEC for in vivo מחקר
פניצילין-סטרפטומיצין 10,000 יחידה/מ"ל, 100  מ"לתרבית תאי היקלוןSV30010אנטיביוטיקה
10x פוספט חוצץ מלח (PBS)VivantisPB0344-1L10x תמיסה,
פולי-L-ליזין בדרגה טהורה במיוחד MW 15,000-30,000סיגמא אולדריץ'P2568פוליקציה
מלח פרוטמין סולפט, מסלמוןסיגמא אולדריץ'P4020פוליקציה
שייקר LabnetS2025
צינורות דיאליזה מעור נחש 3,500 MWCO 22  מ"מ x 35 רגלתרמו פישר סיינטיפיק68035הסר FITC לא מגיב על ידי דיאליזה
נתרן כלוריMerck1.06404.1000
נתרן הידרוקסידQrecS5158
נתרן ביקרבונטUS ביולוגיS4000מאגר
נתרן פחמתיסיגמא אולדריץ'S7795-500Gמאגר
סטרונציום כלוריד HexahydrateSigma Aldrich255521Crosslinker למרית אלגינט
3dia
מזרק 5 מ"לTerumo140425Rקוטר המזרק משפיע על קצב הזרימה
75 ס"מ2 בקבוק תרבית תאיםקורנינג730720
טולואידין כחולסיגמא אולדריץ'52040בדיקת
Trypsin 1xHyclone Cell CultureSH30042.01
נתרן אלגינטNovamatrix (FMC Biopolymer, פרינסטון, ניו ג'רזי)Pronova UPMVGחומר ליבה של מיקרו-חרוזים
PEC-BMP-2 קורוזיבי צוואר הפרין

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yuan, W., et al. NELL-1 based demineralized bone graft promotes rat spine fusion as compared to commercially available BMP-2 product. Orthop Sci. 18, 646-657 (2013).
  2. Anderson, C. L., Whitaker, M. C. Heterotopic ossification associated with recombinant human bone morphogenetic protein-2 (infuse) in posterolateral lumbar spine fusion: a case report. Spine. 37, 502-506 (2012).
  3. Glassman, S. D., et al. RhBMP-2 versus iliac crest bone graft for lumbar spine fusion: a randomized, controlled trial in patients over sixty years of age. Spine. 33, 2843-2849 (2008).
  4. Tannoury, C. A., An, H. S. Complications with the use of bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) in spine surgery. Spine J. 14, 552-559 (2014).
  5. Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J. 11, 471-491 (2011).
  6. Abbah, S. A., Lam, C. X., Hutmacher, D. W., Goh, J. C., Wong, H. K. Biological performance of a polycaprolactone-based scaffold used as fusion cage device in a large animal model of spinal reconstructive surgery. Biomaterials. 30, 5086-5093 (2009).
  7. Abbah, S. A., Liu, J., Lam, R. W., Goh, J. C., Wong, H. K. In vivo bioactivity of rhBMP-2 delivered with novel polyelectrolyte complexation shells assembled on an alginate microbead core template. J. Control. Release. 162, 364-372 (2012).
  8. Wang, M., et al. Polyelectrolyte Complex Carrier Enhances Therapeutic Efficiency and Safety Profile of Bone Morphogenetic Protein-2 in Porcine Lumbar Interbody Fusion Model. Spine. 40, 964-973 (2015).
  9. Abbah, S. A., Lam, W. M., Hu, T., Goh, J., Wong, H. K. Sequestration of rhBMP-2 into self-assembled polyelectrolyte complexes promotes anatomic localization of new bone in a porcine model of spinal reconstructive surgery. Tissue Eng. Part A. 20, 1679-1688 (2014).
  10. Hu, T., et al. Novel Protamine-Based Polyelectrolyte Carrier Enhances Low-Dose rhBMP-2 in Posterolateral Spinal Fusion. Spine. 40, 613-621 (2015).
  11. Hu, J., Hou, Y., Park, H., Lee, M. Beta-tricalcium phosphate particles as a controlled release carrier of osteogenic proteins for bone tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 100, 1680-1686 (2012).
  12. Darrabie, M. D., Kendall, W. F., Opara, E. C. Characteristics of Poly-L-Ornithine-coated alginate microcapsules. Biomaterials. 26, 6846-6852 (2005).
  13. Li, X., Min, S., Zhao, X., Lu, Z., Jin, A. Optimization of entrapping conditions to improve the release of BMP-2 from PELA carriers by response surface methodology. Biomed Mater. 10, 015002(2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

NELL

מאמרים קשורים