Method Article

תצפית כימות הטלומרים ו רצפים חוזרים קרינה באמצעות באתרו הכלאה (דגים) עם PNA בדיקות ב Elegans Caenorhabditis

DOI:

10.3791/54224

⸱

August 4th, 2016

 , 
1Institute of Molecular Biology and Genetics (IMBG), Seoul National University, 2Department of Biological Sciences, Seoul National University, 3Department of Biophysics and Chemical Biology, Seoul National University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מדווחים על הליך תמציתי של הכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) בבלוטת המין ובעוברים של Caenorhabditis elegans לצורך התבוננות וכימות רצפים חוזרים. צפינו וכימתנו בהצלחה שני רצפים חוזרים שונים, חזרות טלומרים ותבנית של התארכות חלופית של טלומרים (TALT).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טלומר הוא מבנה ריבונוקלאופרוטאין המגן על קצוות כרומוזומליים מפני איחוי ופירוק חריגים. אורך הטלומרים נשמר על ידי טלומראז או מסלול חלופי, המכונה התארכות אלטרנטיבית של טלומרים (ALT)1. לאחרונה, C. elegans התגלה כאורגניזם מודל רב-תאי לחקר טלומרים ו-ALT2. הדמיה של רצפים חוזרים בגנום היא קריטית להבנת הביולוגיה של טלומרים. בעוד שניתן למדוד את אורך הטלומרים על ידי בדיקת שבר הגבלת טלומרים או PCR כמותי, שיטות אלו מספקות רק את אורך הטלומרים הממוצע. נהפוך הוא, הכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) יכולה לספק את המידע של הטלומרים הבודדים בתאים. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים ותוצאות מייצגות של השיטה לקביעת אורך הטלומרים של C. elegans על ידי הכלאה פלואורסצנטית באתרה. שיטה זו מספקת הליך פשוט, אך רב עוצמה, באתרו שאינו גורם נזק ניכר למורפולוגיה. על ידי שימוש בחומצת גרעין פפטיד (PNA) המסומנת פלואורסצנטית ובדיקה המסומנת על ידי digoxigenin-dUTP, הצלחנו לדמיין שני רצפים חוזרים שונים: חזרות טלומרים ותבנית של ALT (TALT) בעוברים ובבלוטות המין.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הטלומרים מגן קצוות כרומוזומליות מן ההיתוך והשפלה סוטים. הטלומרים יונקים מורכב G-עשיר חזרות hexameric, TTAGGG, מתחמי shelterin. רצף חוזרים הטלומרים של נמטודות דומה לאלה של יונקים (TTAGGC). רוב אאוקריוטים לנצל טלומרז להוסיף חזרות הטלומרים למטרות כרומוזומליות שלהם. עם זאת, 10 - 15% של תאים סרטניים לנצל מנגנון עצמאי טלומרז, המכונה אלטרנטיבי הארכת הטלומרים (ALT) 3. בעבר, דיווחנו כי חזרות הטלומרים הרצפים הקשורים אליו, כפי ששמו tAlt, היו מוגברים הטלומרים של קווים מוטנטים טלומרז ששרדו עקרות 2 קריטיות.

אורך הטלומרים נמדד על ידי PCR כמוני או על ידי כתם דרום, מספק אורך ממוצע של הטלומרים הכוללים 4,5,6,7. ספירה קראו חוזרים הטלומרים בנתוני רצף הגנום כולו הוא גם אינדיקטור של תוכן הטלומרים הכולל 8. למרות החטאאורך הטלומרים GLE ניתוח (Stela) עשוי לספק אורך הטלומרים יחיד, זה לא יכול לספק מידע מרחבים של הטלומרים 9. בעוד POT-1 :: חלבון הכתב mCherry מספק את המידע המרחבי של הטלומרים in vivo, זה לא יכול לייצג אורכי הטלומרים פעמיים תקועים, כמו POT-1 הוא הטלומרים חד גדיל חלבון מחייב 10.

בעוד שיטות הנ"ל לספק את המידע הממוצע של רצפים חוזרים, קרינת הכלאה באתרו (FISH) מאפשרת להתבונן בכמויות ובדפוסים המרחבי של רצפים בודדים של עניין בסולם כרומוזומליות. במקום טיהור DNA, רקמות או תאים מקובעים לשמר את המידע המרחבי יליד בדגים. לפיכך, FISH הוא כלי כמותי ואיכותי הן לצורך השגחה של רצפים חוזרים הפרט, כגון חזרות הטלומרים.

פרוטוקול זה מספק שיטה יעילה עבור זיהוי סימולטני של שני teloחזרות גרידא אחרות המבוססות על שיפורים מן השיטות שתוארו קודם לכן 11,12. ג זחלים או מבוגרים elegans הם אורגניזם רב-תאי עם תאים מובחנים מאוד. ההטרוגניות של תאים מעכבים על ניתוח כמותי של מספר רב של נקודות הטלומרים. כדי למקסם את מספר התאים נתחו, עובר מבודדים להפיץ בשקופיות מצופות polylysine לדגים. בנוסף, פרוטוקול זה יכול גם להיות משולב עם immunofluorescence.

כהוכחה כי הפרוטוקול עובד, אנו מראים כי אפשר לצפות ולכמת שני רצפים חוזרים שונים. בדיקת DNA נגד TALT1 נוצרה עם PCR פשוט שילוב digoxigenin-dUTP. ואז זה בדיקה TALT1 ו בדיקת PNA הטלומרים שכותרתו קרינה היו הכלאה זמנית. בהמשך לכך, digoxigenin זוהה על ידי שיטות immunofluorescence הקנונית. אנו מציגים כאן את התמונות נציג שבו TALT1 colocalized עם הטלומרים ב TRT-1 ניצולים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. בדיקות תיוג עם Digoxigenin-dUTP ידי PCR

  1. בצע תיוג PCR עם 10x תמהיל dNTP המכיל digoxigenin-dUTP כפי שתואר לעיל 13.
  2. לטהר מוצר PCR עם טיהור ספין-טור על פי ההוראה של היצרן.
    1. אם החללית היא קצרה יותר מ -200 נ"ב, להסיר digoxigenin-dUTP חינם עם כרומטוגרפיה ספין-טור מתערובת התגובה ולא טיהור ספין-טור.

2. הכנת שקופיות מצופות polylysine

הערה: התהליך כולו אורך כ -2 שעות. רוב השלבים מתבצעים בטמפרטורת חדר למעט שלב הייבוש.

  1. ניקוי שקופיות
    1. מניחים את השקופיות במיכל פלסטיק ולשטוף את השקופיות בקצרה עם מים מזוקקים (DW). הסר את המים ולמלא את המיכל עם DW המכיל נוזל לניקוי זכוכית 1%.
    2. להתסיס את השקופיות במשך 15 דקות ב 50 סל"ד בטמפרטורת החדר (RT). שטפו את השקופיות עם DW 3פעמים במשך 5 דקות כל אחד ב RT.
    3. שטפו את השקופיות עם אתנול 70% במשך 15 דקות עם תסיסה. מחק 70 אתנול% ומקום השקופיות על גוש יבש 65 ° C ו-אוויר יבש במשך 15 דקות.
  2. ציפוי polylysine של שקופיות זכוכית רבות גם
    הערה: ציפוי polylysine זכוכית שקופית הוא צעד חשוב, שכן הוא מספק את ההידבקות המדגמת לאורך כל ההליך המכתים. גרוע שקופיות מצופות תגרומנה לאובדן של מדגם.
    1. לדלל את הפתרון polylysine המניה ל -0.01% (w / v) במים מזוקקים. הוסף 20 μl של% 0.01 בדילול (w / v) polylysine אל הבארות של שקופיות זכוכית נקיות.
    2. דגירת שקופיות הזכוכית במשך 5 דקות ב RT.
    3. מניחים את השקופיות על גוש יבש 65 ° C ו-אוויר יבש 1 hr.
    4. אחסן את השקופיות polylysine בתיבת אבק חינם.

3. קיבוע של תולעים בשקופית זכוכית (איור 1)

  1. עוברים הכנות לקראת FISH
    הערה: תולעים קציר לפני כל tהוא מחיידקים שבמזון הוא נצרך על ידי צפיית תקשורת הצמיחה תחת מיקרוסקופ. רעב מפחית ייצור ביצים של תולעים בוגרות ומגביר בקיעת ביצה. שיטות מפורטות מתוארות 14,15.
    1. לגדל את התולעים 50 מ"מ פטרי צלחת פי שיטות סטנדרטיות 14.
    2. אחרי כל אוכל החיידקים הוא נצרך, לחתוך את התקשורת אגרה רבעון עם מרית. לעקר את המרית לפני החיתוך על מנת למנוע זיהום.
    3. מכניסים את כל פיסת אגר על צלחת התקשורת צמיחה נמטודות 100 מ"מ (NGM). להפוך את הפיסה אגרה במהופך עבור התולעים להגיע מזון חיידקים הטרי.
    4. לאחר 48 עד 72 שעות, לאסוף את התולעים עם חיץ M9. להוסיף 3 - 5 מ"ל של חיץ M9 על צלחת NGM. חיץ פיפטה M9 על פני השטח של NGM לשטוף את התולעים.
    5. אסוף את הנוזל עם תולעים ולהוסיף שפופרת 15 מ"ל.
      הערה: אם ישן לכלוך אגר לאחר הקציר, צנטריפוגה התולעים בתמיסת 30% סוכרוז. בעוד ופסולת pelleted, תולעים לצוף עלהשטח.
    6. הוסף חוצץ M9 לפצות את נפח עד 15 מ"ל. גלולת התולעים על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 3 דקות ולהסיר את רוב למאגר M9. חזור על פעולה זו 2 פעמים יותר.
      הערה: אם התולעים עדיין צפו לאחר צנטריפוגה, להגדיר את רמת הבלם של צנטריפוגות כדי מעריכה = 1.
    7. חיץ לשאוב M9. הוסף פתרון הלבין את התולעים. לפי 0.5 מ"ל של תולעים, להוסיף 6.5 מ"ל של DW, 2 מ"ל של תת-כלורי, 1 מ"ל של 5 M KOH.
    8. דגירה תולעים עם נדנדה ב RT במשך 3 דקות ב 50 סל"ד. תולעים וורטקס למשך 15 שניות כדי לגזור את התולעים מכאניות ולחשוף את הביצים.
    9. שים את הצינור תחת מיקרוסקופ לנתיחה במהלך לבן. ודא כי תולעים נחתכים בחצי וביצים משתחררות. כאשר רוב של הגוף הבוגר נמס, להוסיף למאגר M9 לפצות את נפח עד 15 מ"ל.
    10. צנטריפוגה XG ב 300 במשך 3 דקות. לשאוב רוב M9 ולהוסיף חיץ M9 טרי לפצות את הנפח עד 15 מיליליטר. צעד חוזר על לשטוף 3 פעמים.
      הערה:הימנע משימוש כמות מוגזמת של תולעים, כפי שהם לעכב את התהליך הלבן. שמור את זמן התגובה הכולל פחות מ -8 דקות עד בכביסה. יתר מולבן ביצים לייצר autofluorescence החזק.
    11. להוסיף פוספט בופר עם polysorbate-20 (PBST) עד 200 μl ו -200 μl של paraformaldehyde 4% (PFA) כדי להפוך 2% PFA.
      זהירות: מאז PFA הוא מסרטנים, ללבוש ביגוד מגן, כפפות מגן עין לפני שימוש PFA.
    12. הוסף 40 μl של ביצים 2% PFA על הבאר של שקופית מצופה polylysine.
    13. מניחים את השקופיות בתא לח דגירה במשך 15 דקות ב RT. סגור את בתא הלח מייד אחרי המגלשות ממוקמות בתוך.
      הערה: הביצים ליישב לתחתית של שקופית בעת היותו קבועה.
  2. הכנת בלוטות המין גזור לדגים
    1. תולעים בוגרות קציר גדל על 50 מ"מ NGM צלחת על ידי pipetting 1 מ"ל של חיץ M9. תולעים קציר לפני מחיידקים שבמזון ייגמרו.
    2. לשטוף את התולעים מכל שנינות חיידקיםh חיץ M9, 2 פעמים.
      הערה: שיירי חיידקים עלולים להפריע בלוטות מין הגזורים יידבקו שקופיות מצופות polylysine.
    3. גלולת התולעים על ידי צנטריפוגה ב 300 x ז. הסר M9 ולהעביר את התולעים לצלחת NGM ריק ידי micropipette.
    4. הוסף 30 μl של חיץ M9 המכיל levamisole 2 מ"מ על באר שקופיות מטופלים polylysine.
    5. הוסף 500 μl של חיץ M9 לצינור 1 מ"ל. השתמש חיץ זה להעביר את התולעים על ידי פיפטה בפה.
    6. מלאו את קצה פיפטה בפה עם חיץ M9 ידי הצבת נימי בצינור 1 מ"ל המכיל למאגר M9.
    7. תחת מיקרוסקופ לנתח, הכניס את קצה הפה פיפטה ממש מול ראש פיפטה בפה תולעת וגרור מבוגר כך שהראש של תולעים נכנס פיפטה בפה. לאחר ראש התולעים נכנס הקצה, הגוף כולו של תולעת יצויר אל הקצה.
    8. מעבירים את התולעים לשקופית מצופה polylysine באמצעות פיפטה בפה.
    9. באמצעות סכין גילוח, לחתוך שלf הראש או קצה הזנב של תולעים בשקופית. כאשר התולעת הוא חתך, בלוטות המין תצוץ. בלוטות המין ידבק שקופיות.
      1. הכן לפחות 30 תולעים היטב אחד. עוד בארות יכולות לשמש 30 תולעים אחרים.
    10. שים את השקופית בתא לח לשאוב את למאגר M9 עם פיפטה בפה.
    11. תקן את המדגם על ידי הוספת 20 μl של 2% PFA ב RT במשך 15 דקות בתא לח.

4. קיבוע ו Permeabilization

  1. הוסף בלוק אלומיניום על קרח יבש ולאחסן אותו במקפיא עמוק (-80 ° C). מתנול אצטון אחסן -20 ° C.
  2. לאחר שלב קיבעון PFA 3.1.15 או 3.2.11, להסיר מקבע באמצעות micropipette עוזב ~ 5 μl של מקבע.
  3. במילים אחרות שקופיות מצופה polylysine בשקופית המדגם. הסר את מקבע עם מגבת נייר אם הפתרון הוא מוגזם. אל תזיז את השקופיות פעם הם תקועים יחד.
  4. להקפיא את השקופיותעל בלוק אלומיניום עבור 15 דקות לפחות.
    הערה: הדגימות יכולות להיות מאוחסנות במשך לפחות 2 - 3 ימים.
  5. בעוד השקופיות מוקפאות, הכניס את הצנצנות המכילות מתנול קר אצטון על קרח.
  6. קח את השקופיות החוצה ולסובב אותם להקפיא-לפצח את המדגם. מחק את השקופית העליונה. מיד להשרות את השקופית לתוך מתנול קר קרח למשך 5 דקות.
  7. העברת שקופיות אצטון קר כקרח במשך 5 דקות.
  8. שטפו את השקופיות 3 פעמים עם PBST במשך 5 דקות כדי להסיר מקבע שיורית. המשך לשלב הבא או לאחסן את השקופיות אתנול 100% ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: הדגימות יכולות להיות מאוחסנות במשך לפחות 2 - 3 ימים.

כלת 5. של תאים קבועים

  1. הוסף 20 μl של פתרון RNase (PBST המכיל 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​RNase). דגירת השקופיות בתא הלח ב 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה.
  2. לשטוף את השקופית פעמיים ציטראט מלוחים ונתרן 2x עם polysorbate-20 (2x SSCT) במשך 15 דקות כל אחד.
  3. הוסף 20μl של פתרון הכלאה וקבע בתא לח בחממה 37 מעלות צלזיוס. אחרי השעה 1, להסיר את פתרון הכלאה ידי pipetting.
  4. לפני הסרת פתרון הכלאה, להכין את החללית. אם חללית גדילים כפולה DNA, לפגל חלליות על ידי חימום על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות על גוש יבש. לאחר חימום, לקרר את החללית על בקצרה קרח.
  5. הוסף 10 μl של פתרון הכלאה המכיל בדיקות המדגם. עבור בדיקת PNA, ריכוז שימוש ביחס של 1: 2,000 ועבור בדיקת DIG שכותרתו, ריכוז שימוש ביחס של 1: 200. מכסים את המדגם עם מכסה זכוכית.
  6. לשים מגבת נייר ספוגה במים על הגוש החום (80 מעלות צלזיוס). לשים כיסוי קופסת פלסטיק על גוש חום כדי לשמר את הלחות והטמפרטורה.
  7. לאחר הטמפרטורה של גוש החום התייצבה (עד 80 מעלות צלזיוס), במקום להחליק המדגם על מגבת נייר המחוממת לכסות את הדגימות עם כיסוי קופסא הפלסטיק. לפגל את המדגם עבור 3 דקות.
  8. Incאובאטה השקופיות בתא לח לילה בשעה 37 ° C.

6. מתרחץ Immunofluorescence

  1. לחמם את הפתרון לשטוף הכלאה (2x SSC, 50% לפוראמיד) ל -37 מעלות צלזיוס.
  2. לשטוף את המדגם ב PBST פעמים ב RT במשך 5 דקות. הסר את מכסה הזכוכית.
  3. לשטוף את המדגם בפתרון לשטוף הכלאה על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  4. לשטוף את שקופית המדגם ב PBST 3 פעמים ב RT. הערה: בצע את כל השלבים הבאים בתא לח ב RT.
  5. הוסף 20 μl של פתרון חסימת דגירה במשך שעה 1 ב RT בתא לח.
  6. הסר פתרון חסימת ולהוסיף FITC פתרון נוגדן אנטי digoxigenin מצומדות (1: 200) במשך 3 שעות ב RT או לילה ב 4 מעלות צלזיוס.

שמה ותצפית 7.

  1. לשטוף את השקופית מדגם עם PBST 2 פעמים במשך 15 דקות כל אחד.
  2. הוסף 10 μl של פתרון הרכבה עם DAPI. החזר את מכסה הזכוכית ולחץ בעדינות. הסר פתרון עודףעם מגבת נייר.
  3. כדי למנוע אידוי של פתרון גובר, לאטום את הקצוות של זכוכית המכסה עם לק.
  4. שימו לב תחת מיקרוסקופ confocal. אל תכלול עובר עם רקע גבוה. דגש על תחום בעל 4 - 20 גרעינים.
  5. צלם תמונות על פי ההוראה של היצרן עם עדשה אובייקטיבית 100X.
    הערה: Excite המדגם עם לייזר 405 ננומטר עבור DAPI, עם 555 ננומטר לייזר עבור Cy3, עם 488 ננומטר לייזר עבור FITC.

8. כימות איתותים הטלומרים

הערה: כימות נעשה כפי שתואר לעיל 16. כל התמונות כי הם להיות לעומת צריך לקחת עם אותה הגדרה כולל זמן חשיפה ומקור אור.

  1. לייצא את התמונה .tif בפורמט.
  2. הורד והתקן את תוכנת ניתוח תמונה.
  3. הפעילו את התוכנה וניתוח תמונה ולחץ מסכים כפתור.
  4. לחץ על לחצן פתוח. פתח את התמונות עם FISH הטלומרים ידי לחיצה כפולה על קובץ התמונה.
  5. נְקִישָׁה[עריכה] - [אזור עיבוד בחר], באזור הנבחר של ריבית על ידי שמאל לחץ וגרירה. אל תכלול את כל המכתים הלא ספציפי.
  6. לחץ [מידה] - [נקודת צפיפויות אופטיות], בחר בערוץ עם אות הטלומרים והזן את שם הקובץ כדי לשמור את התוצאות בקובץ .txt.
    הערה: העמודה של התוצאות לפי הסדר הבא: הקרינה של נקודה, עוצמת רקע של ספוט שטח של המקום.
  7. הצב את הספרות ולחסר עוצמת רקע של מקום מן הקרינה של נקודה. הערכים כעת ניתן לנתח סטטיסטית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זה היה בעבר דווח כי ניצול ALT יכול לצאת מן מוטציה טלומרז מחסר, TRT-1 (ok410), בתדירות נמוכה ידי שכפול מקומי פנימי 'תבנית של ALT' (tAlt) רצפים לצורך תחזוקה הטלומרים 2. באמצעות בדיקת PNA, הצלחנו לחזות הטלומרים ב בלוטות המין הגזורות (איור 2 א). האות הטלומרים הקלוש זוהה הוא TRT-1 (ok410) וניצולת ALT. האות מטושטשת היה חפפו רק עם DAPI, דבר המצביע על כך שהם לא יכולים להיות autofluorescence. הטלומרים דמויים בינ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היתרון העיקרי של פרוטוקול שלנו הוא הפשטות של ההליך ללא נזק בולט את המורפולוגיה של המבנה התאי. צעדים אחדים היו אופטימיזציה עבור ג elegans FISH בפרוטוקול זה. השלבים הקריטיים לדגים מוצלחים כוללים תיוג של בדיקות, קיבעון של עוברים וחדירים. שיטת תיוג Digoxigenin-dUTP מספקת שיטת תיוג קלה לשימוש על ידי PCR או ניק-תרגום. כדי לתייג רצף יעד ארוך, ניק-תרגום הוא מועדף. במקרה זה, חלליות צריך להיות מעוכל עם אנזים הגבלה מתאים כדי להקל על החדירה של בדיקות. התג ביוטין-dUTP אינו מומלץ בגלל ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זני תולעים מוטנטיים סופקו באדיבות על ידי המרכז לגנטיקה של Caenorhabditis. מחקר זה נתמך על ידי מענק של פרויקט המו"פ של טכנולוגיית הבריאות של קוריאה באמצעות המכון לפיתוח תעשיית הבריאות של קוריאה (KHIDI), במימון משרד הבריאות והרווחה, הרפובליקה של קוריאה (מספר מענק: HI14C1277).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
בדיקת PNAPANAGENEמותאמת אישית
Anti-Digoxigenin-Fluorescein, שברי FabRoche11207741910להשתמש ב-1:200 מדולל ב-PBST
Digoxigenin-dUTPRoche11573152910
אלבומין בסרום בקרSIGMA-ALDRICHA-7906
ParaformaldehydeSIGMA-ALDRICHP-6148הכינו 4% פרפורמלדהיד על ידי חימום ב-DW עם כמה טיפות NaOH. הוסף 0.1 נפח של 10x PBS.
VectashieldVector LaboratoriesH-1200
תמיסת3x SSC, 50% פורממיד, 10% (w/v) דקסטרן סולפט, 50 & #956; גרם/מ"ל הפרין, 100 & #956; גרם/מ"ל שמרים tRNA , 100 & # 956; גרם/מ"ל זרע סלמון סוניקטיבי DNA
שטיפת Hybridizaiton2x SSC, 50% פורממיד
פורממיד BIONEERC-9012מתנול רעיל
קרלו ארבה
אצטוןקרלו ארבה
הפריןSIGMA-ALDRICHH3393להכין 10 מ"ג/מ"ל לתמיסת מלאי
דקסטרן סולפטSIGMA-ALDRICH67578
10x PBSעבור 1 ליטר DW: 80 גרם NaCl, 2.0 גרם KCl, 27 גרם Na2HPO4• 7H2O, 2.4 גרם KH2PO
PBST1x PBS, 0.1% tween-20
פוליסורבט 20SIGMA-ALDRICHP-2287השם המסחרי הוא Tween-20
תמיסת פולי-L-ליזין (0.1% w/v)SIGMA-ALDRICHP-8920הכן תמיסה טרייה של 0.01% w/v לפני השימוש
M93 גרם KH2PO4, 6 גרם Na2HPO4, 5 גרם NaCl, 1 מ"ל MgSO4, H2O עד 1
ליטר תמיסת20% נתרן היפוכלוריט, 0.5 M KOH
מאגר1x PBST, 1 מ"מ EDTA, 0.1% BSA, 0.05% נתרן אזיד (רעיל)
תמיסתנוגדנים מאגר עם 5% אלבומין בסרום בקר (BSA)
illustra Microspin G-50GE healthcare27-53310-01
20x SSCלייצור 1 ליטר, 175.3 גרם NaCl, 88.2 גרם נתרן ציטראט, H2O עד 1 ליטר, התאם pH ל 7.0
2x SSCT 2x SSC, 0.1% tween-20
10x digoxigenin-dUTP mix1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65 mM dTTP, 0.35 mM DIG-11-dUTP
PCR טיהור עמודותCosmo genetechCMR0112
מנקה זכוכית / ULTRA CLEANDukssan תרמילים טהורים8AV721
רב בארות זכוכית שקופיותMP ביו-רפואיות
אמצעילהכנת 1 ליטר, 3 גרם NaCl, 17 גרם אגר, 2.5 גרם פפטון, H2O עד 974 מ"ל. חיטוי וקירור הבקבוק. הוסף 1 מ"ל של 1 M CaCl2, 1 מ"ל של 4 מ"ג/מ"ל כולסטרול באתנול, 1 מ"ל של 1 M MgSO4, 25 מ"ל של 1 M KPO4.
להבנוצותגילוח
Rnase AEnzynomics
BSASIGMA-ALDRICHA7906
מיקרוסופ קונפוקליZeissLSM 510EC Plan-Neofluar 100X שימש כעדשה אובייקטיבית.
תאקופסת פלסטיק מלאה במגבת נייר ספוגה בתוכנת ניתוח תמונות DW
 ד"ר פיטר לנדסדורפTFL-telohttp://www.flintbox.com/public/project/502
הזמנה Hybridizaiton תמיסת הלבנה נוגדנים חסימת 96041205 גידול נמטודות Levamisole SIGMA-ALDRICH 196142 מס' 11 לח

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Reddel, R. R., Bryan, T. M., Murnane, J. P. Immortalized cells with no detectable telomerase activity. A review. Biochemistry-Moscow. 62, 1254-1262 (1997).
  2. Seo, B., et al. Telomere maintenance through recruitment of internal genomic regions. Nat Commun. 6, 8189(2015).
  3. Cesare, A. J., Reddel, R. R. Alternative lengthening of telomeres: models, mechanisms and implications. Nat Rev Genet. 11, 319-330 (2010).
  4. Meier, B., et al. trt-1 is the Caenorhabditis elegans catalytic subunit of telomerase. Plos Genetics. 2, 187-197 (2006).
  5. Cawthon, R. M. Telomere measurement by quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 30, 47(2002).
  6. Raices, M., Maruyama, H., Dillin, A., Karlseder, J. Uncoupling of longevity and telomere length in C. elegans. PLoS Genet. 1, 30(2005).
  7. Southern, E. M. Detection of Specific Sequences among DNA Fragments Separated by Gel-Electrophoresis. Journal of Molecular Biology. 98, 503(1975).
  8. Lee, M., et al. Telomere extension by telomerase and ALT generates variant repeats by mechanistically distinct processes. Nucleic Acids Res. 42, 1733-1746 (2014).
  9. Cheung, I., et al. Strain-specific telomere length revealed by single telomere length analysis in Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 32, 3383-3391 (2004).
  10. Shtessel, L., et al. Caenorhabditis elegans POT-1 and POT-2 repress telomere maintenance pathways. G3. 3, Bethesda. 305-313 (2013).
  11. Duerr, J. Immunohistochemistry. WormBook (The C. elegans Research Community). , (2006).
  12. Phillips, C. M., McDonald, K. L., Dernburg, A. F. Cytological analysis of meiosis in Caenorhabditis elegans. Meiosis: Volume 2, Cytological Methods. , Springer. 171-195 (2009).
  13. Emanuel, J. R. Simple and efficient system for synthesis of non-radioactive nucleic acid hybridization probes using PCR. Nucleic acids research. 19, 2790(1991).
  14. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  15. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J Vis Exp. , e4019(2012).
  16. Poon, S. S. S., Martens, U. M., Ward, R. K., Lansdorp, P. M. Telomere length measurements using digital fluorescence microscopy. Cytometry. 36, 267-278 (1999).
  17. Ferreira, H. C., Towbin, B. D., Jegou, T., Gasser, S. M. The shelterin protein POT-1 anchors Caenorhabditis elegans telomeres through SUN-1 at the nuclear periphery. J Cell Biol. 203, 727-735 (2013).
  18. Lee, M. H., Schedl, T. RNA in situ hybridization of dissected gonads. WormBook. , 1-7 (2006).
  19. Tabara, H., Motohashi, T., Kohara, Y. A multi-well version of in situ hybridization on whole mount embryos of Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 24, 2119-2124 (1996).
  20. Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Curr Protoc Cell Biol. 18, Unit 18 14(2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Telomere FISHPNA ProbesC elegansFluorescence In Situ HybridizationTelomere LengthAlternative Lengthening of TelomeresTelomere QuantificationFluorescent MicroscopyProbe HybridizationAntibody Staining

Related Articles