איך ללמוד מרתף ממברנה נוקשות כמפעיל Biophysical הערמונית סרטן ומחלות גיל הקשורות אחרים או מחלות מטבוליות

סיכום

נסביר פרוטוקול למידול במיקרו-סביבה של biophysical שבו crosslinking וקשיחות מוגברת של קרום במרתף (BM) הנגרמת על ידי endproducts גליקציה מתקדמים (גילאי) יש רלוונטיות פתולוגי.

תקציר

כאן אנו מתארים פרוטוקול שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד את המיקרו-סביבה biophysical הקשורים עובי מוגבר ונוקשות של קרום במרתף (BM) במהלך פתולוגיות הקשורות לגיל והפרעות מטבוליות (סרטן למשל, סוכרת, מחלות כלי הדם, רטינופתיה, נפרופתיה ונוירופתיה) . הנחת היסוד של המודל היא crosslinking אנזימטית של מחדש BM (RBM) מטריקס על ידי טיפול עם glycolaldehyde (GLA) לקדם endproduct גליקציה מתקדמים (AGE) דור דרך התגובה Maillard. דוגמאות של טכניקות מעבדה שניתן להשתמש בהם כדי לאשר דור גיל, crosslinking אנזימטית והגדילה נוקשות GLA מטופלים RBM מתוארים. אלה כוללים הכנת יליד RBM (שטופל פוספט שנאגר מלוח, PBS) RBM הנוקשה (שטופל GLA) לקביעה: תוכן AGE שלה על ידי ניתוח photometric מיקרוסקופיה immunofluorescent, crosslinking אנזימטית על ידי polyacrylamide סולפט dodecyl נתרןג'ל אלקטרופורזה (עמוד SDS) וכן במיקרוסקופ confocal, ו rheometry באמצעות קשיחות מוגברת שלה. ההליך המתואר כאן ניתן להשתמש כדי להגדיל את הקשיחות (moduli אלסטי, E) של RBM עד 3.2 פי, עולה בקנה אחד עם מדידות שנעשו בריא לעומת רקמת ערמונית אדם חולה. כדי לשחזר את המיקרו-סביבת biophysical הקשורים להזדקנות וערמונית חולה בלוטת שלושה סוגי תאי ערמונית הוכנסו על RBM יליד והנוקשה RBM: RWPE-1, תאי אפיתל ערמונית (פץ) נגזר בלוטת ערמונית נורמלית; BPH-1, פץ נגזר בלוטת הערמונית מושפעים היפרפלזיה שפירה של הערמונית (BPH); ו PC3, תאים גרורתי נגזרים סרטן עצמות משני שמקורם בסרטן הערמונית. פרמטרים מרובים ניתן למדוד, כולל הגודל, הצורה והמאפיינים פולשנית של acini 3D הבלוטות נוצר על ידי RWPE-1 ו BPH-1 בנוגע ליישום מקורי בניגוד RBM נוקשה, ואורך התא הממוצע, מהירות הנדידה והתמדה של תנועת התא של 3D spherOIDs נוצר על ידי תאי PC3 באותם תנאים. Cell מסלולי איתות ואת לוקליזציה subcellular של חלבונים ניתן להעריך גם.

מבוא

קרום הבסיס (BM) הוא יריעה של מטריצה חוץ-תאית מיוחדת (ECM) השומרת על גבולות רקמה יציבים על ידי הפרדת שכבות של תאי אפיתל מהסטרומה¹. קישור צולב קוולנטי בין סלילי משולש סמוכים של קולגן IV ב-BM מייצב את הקשר הרוחבי שלהם על ידי הקמת רשת לא סדירה של סלילי סופר-מעוותים². סריגי קולגן IV אלה משמשים כפיגום לאינטראקציה שלו עם למינין ורכיבי BM אחרים¹. הסידור המבני של ה-BM מספק לו את החוזק המכני והקשיחות הדרושים להתפתחות תקינה של אפיתל בלוטות³.

במהלך ההזדקנות והמחלה ה-BM מתעבה ומתקשה בהדרגה^3,4. לדוגמה, עלייה של פי 3 במודול האלסטי (E) של BM העין מתרחשת בין הגילאים 50 ל-80 באוכלוסייה הרגילה, והתקשות זו מחמירה עוד יותר בהפרעות מטבוליות כמו סוכרת⁵. השינויים המבניים והביומכניים ב-BM הגורמים לנוקשות המוגברת שלו מתרחשים כאשר רכיבי ה-ECM שלו, קולגן IV ולמינין, הופכים למקושרים באופן לא אנזימטי בעקבות חשיפתם לתוצרי קצה מתקדמים של גליקציה (AGEs).

מטרת השיטה המתוארת כאן הייתה לבסס מודל לחקירת האופן שבו נוקשות BM, עקב חשיפה ל-AGE, מקדמת פולשניות של תאי אפיתל הערמונית (PEC) ותאי גידול הערמונית (PTC) בהקשר של המעבר לסרטן ערמונית גרורתי (PCa). לשם כך הותאמה שיטה קודמת ששימשה ליצירת אציני בלוטי תלת מימדי מתאי אפיתל חלב (MECs) בג'ל rBM משוחזר⁶ כדי לכלול שלב נוסף שבו ג'לי ה-rBM מטופלים מראש בגליקולאלדהיד (GLA). מתוארות מספר טכניקות להערכת קישור צולב והקשחה של ג'ל rBM שטופלו מראש, כולל ניתוח פוטומטרי, נתרן דודציל סולפט אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד (SDS PAGE), מיקרוסקופיה קונפוקלית וניתוח ריאומטרי. סוגי תאי הערמונית שנבחרו לתרבית על ה-rBM המוקשח מראש כוללים: RWPE-1, PECs שמקורם בבלוטת ערמונית רגילה⁷; BPH-1, PECs שמקורם בבלוטת ערמונית המושפעת מ-BPH⁸; ו-PC3, PTCs גרורתיים שמקורם בגידול משני הממוקם בעצם החוליה של חולה סרטן הערמונית (PCa)⁹.

בנוסף לקידום המחקר של פתולוגיה של בלוטת הערמונית, ניתן להתאים את הפרוטוקול להתקשות ג'ל rBM על ידי הטיפול בהם ב-GLA כדי לחקור כיצד נוקשות BM תורמת לפתולוגיות אחרות הקשורות לגיל ולהפרעות מטבוליות. לדוגמה, ניתן ליישם את המודל ישירות כדי לחקור כיצד סרטן גרורתי נגרם על ידי נוקשות BM באיברים כמו השד, המעי הגס, השחלה והלבלב על ידי שילוב סוגי תאים מתאימים. יתר על כן, ניתן להתאים את הפרוטוקול כדי לחקור כיצד BM נוקשה מקדם מנגנונים ביומכניים של התקדמות המחלה במחלות מיקרו-וסקולריות הקשורות לסוכרת, רטינופתיה, נפרופתיה ונוירופתיה.

פרוטוקול

אינדוקציה 1. של BM נוקשות מושרה על ידי GLA טיפול (Non-האנזימטית Crosslinking)

1. להפשיר בקבוקון קפוא של מטריקס בע"מ (10 מיליליטר) על ידי דוגר על 4 מעלות צלזיוס (עומד על קרח חדר או במקרר קר) עד שהנוזלים של הבקבוקון הפכו נוזל (8-16 שעות).
   זהירות: אם בחדר קר / מקרר אינו בשימוש, לכסות את הבקבוק השלם עם קרח. פעולה זו תמנע את פתרון המניות של BM לחיזוק.
2. בניסויים עתידיים וכדי למנוע מחזורי ההפשרה להקפיא חזר, להכין 25 x 0.4 aliquots מ"ל מכל בקבוקון 10 מ"ל חדש של מטריקס בע"מ. חנות בקבוקונים ב -80 ° C עד לתאריך התפוגה המצוין על ידי היצרן. בעת הצורך, להפשיר בקבוקונים ב 4 ° C עומד על קרח במשך 2 שעות.
3. כן גם משטח של קרח. הוסף שקופיות זכוכית קאמרית 8-גם על גבי הקרח כדי לשמור על טמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הליך הציפוי. להפשיר בקבוקון של מטריקס בע"מ ב 4 מעלות צלזיוס.
   הערה: One 0.4 מיליליטר בקבוקון של מטריקס בע"מ מספיק כדי COAt שקופית קאמרית 1 x 8-היטב כולו. שמור את הבקבוקון מכוסה בקרח בזמן הטיפול כדי למנוע את מטריקס בע"מ לחיזוק.
4. לחתוך את הקצה מהחלק של קצה פיפטה 200 μl באמצעות מספריים. מצננים את טיפ 200 μl פיפטה בוטה הסתיים עד 4 מעלות צלזיוס ומניחים על אותו מכשיר pipetting קיבולת 200 μl. קח את 40 μl של הפתרון מטריקס בע"מ הקר אל הקצה פיפטה ולהעביר אותו לתוך באר בשקופית הזכוכית קאמרית 8-המקוררת היטב.
   הערה: 40 μl של פתרון BM הוא מספיק כדי לכסות שטח פנים של 0.8 ס"מ ^2. טיפים ימשיכו פיפטה מקורר במהלך הליך הציפוי כדי למנוע התמצקות של הפתרון בע"מ. אין להכניס בועות אוויר לתוך התמיסה מטריקס בע"מ להבטיח הבאר מצופה באופן שווה ללא היווצרות של המניסקוס גלוי בקצוות.
5. חזור על שלב 1.4 לפי מספר בארות ותא הנדרשות.
6. לאחר ציפוי, במקום להחליק קאמרי 8-גם על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לקדם פילמורשל BM. סגור את דלת החממה בזהירות רבה כדי למנוע הפרעה רצויה של RBM הנוזלי. אין לעבור על זמן הדגירה 30 דקות כדי למנוע התייבשות של הג'ל RBM.
   הערה: ג'ל שמתקבל הוא BM מחדש הילידים (RBM). צעד דגירת 37 מעלות צלזיוס אינו מחייב 5% CO _2. עם זאת, מטעמי נוחות לבצע שלב זה חממה בתרבית רקמה נקבע על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ (עם humidification).
7. הכן 50 מ"מ glycolaldehyde (GLA) מדולל 0.2 M חיץ פוספט (pH 7.8). לעקר את הפתרון על ידי סינונו דרך המסנן מזרק 0.22 מיקרון באמצעות מזרק 50 מ"ל.
   1. לקבלת תגובה crosslinking בנפח סופי של 250 μl של 50 מ"מ GLA, להוסיף 25 μl של 0.5 M cyanoborohydride נתרן או 2.5 M aminoguanidine 125 μl של 100 מ"מ GLA (2x המניות) ו -100 μl של 0.2 M חיץ פוספט (pH 7.8 ). לעקר את פתרונות המניות על ידי העברת אותם דרך פילטר מזרק 0.22 מיקרון באמצעות מזרק 50 מ"ל.
      זהירות: טפל cyanoborohydride נתרן ללבוש חלוק מעבדה, כפפות, faceshield הנשמה תוך כדי העבודה במנדף.
8. הוסף 250 μl של פתרון GLA כדי לכסות את הג'ל RBM polymerized לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות כדי לייצר ג'ל RBM חצי נוקשה או 14 שעות כדי לייצר ג'ל RBM נוקשה.
   הערה: היקף GLA הוסיף חייבת לכסות את הג'ל RBM polymerized וצריך להיות בהתאם. אם פעמי דגירת GLA שונות משמשות, ג'לים RBM יש לנתח על מנת לקבוע את מתקפלת הגידול נוקש RBM (ראה שלב 2.4).
   1. כן בקרה שלילית על ידי דוגרי ג'ל יליד RBM ב 250 μl של בופר פוספט סטרילית (PBS) במשך 14 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
   2. הכן שני פקדים נוספים, כאשר היווצרות של בסיס שיף או התארגנות adduct Amadori במהלך התגובה crosslinking מעוכבים, על ידי תוספת של cyanoborohydride נתרן 50 מ"מ או 250 מ"מ aminoguanidine.
9. כן 1 דואר גליצין Mאסתר thyl (GEE) מדולל PBS. לעקר את הפתרון על ידי סינונו דרך המסנן מזרק 0.22 מיקרון באמצעות מזרק 50 מ"ל.
10. לאחר זמן דגירה המצוין, בזהירות להסיר את פתרון GLA מן ג'לים RBM crosslinked, פתרון GLA המכיל מעכבים מן ג'לים RBM המלא PBS מן ג'לים RBM יליד שליטה. הוסף 250 μl של פתרון GEE לכל ג'לים RBM ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
    הערה: שלב זה מרווה את התגובה crosslinking.
11. לשטוף כל ג'לים RBM 10 פעמים ב 500 μl PBS כדי להסיר כל עקבות של GLA ו GEE. דגירת ג'לים RBM הלילה ב 37 מעלות צלזיוס 400 μl של PBS על מנת למנוע ההתייבשות שלהם.
    1. לנתח את הג'לים RBM הצטברות גיל, הלא האנזימטית נכסים crosslinking ו viscoelastic (שלבים 2.1-2.4). לניתוח rheometric נכסים viscoelastic שלהם להכין את הג'לים RBM בטבעות שיבוט (שלב 2.4).
    2. עבור תרבית תאים, לשטוף ג'לים RBM 2 פעמים עם 500 μl תרבות אותיdia לפני זריעת התאים (שלבים 5 ו -6). בצע שוטף בעדינות מבלי קצה פיפטה נגיעה במשטח ג'ל.

2. כימות ללא אנזימתי Crosslinking ונוקשות של RBM מטופלים עם GLA

1. ניתוח פוטומטרי
   1. מדוד הצטברות הגיל שטופלו GLA ולשלוט ג'לים RBM באמצעות ניתוח photometric כדי לקבוע את מידת התגובה Maillard.
      1. לאחר שלב 1.11, להסיר את PBS מן ג'לים RBM בשקופיות הקאמריות 8-הבארות ולהוסיף 250 מים כפולים מזוקקים μl קר כקרח. דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 16-24 שעות כדי להבטיח כי המטריצה ​​נוזלית לחלוטין.
         הערה: פפטידים RBM בפתרון זה מכילים גילים עם תכונות אוטומטיות ניאון.
      2. מעבירים את הפתרון בע"מ מעובה לצינור 1.5 מ"ל ולמדוד את פליטת ניאון של הפתרון באמצעות ספקטרופוטומטר (גל עירור = 370 ננומטר; = אורך גל הפליטה 440 ננומטר).
2. ניתוח SDS-PAGE של פפטידים ציאנוגן ברומיד
   1. פתור את הג'לים GLA שטופלו ובקרה RBM על ג'ל polyacrylamide כדי לאשר GLA יש המושרה crosslinking לבין היווצרות של סיבים מאקרו.
      1. צנטריפוגה הפתרון בע"מ מעובה שנאספו שלב 2.1.1.2 ב XG 10,000 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
      2. כן פתרון מניות המכיל 2 גרם / מיליליטר של ציאנוגן ברומיד המדולל אצטוניטריל.
         זהירות: תמיד טפלו ציאנוגן ברומיד במנדף כשהוא לבוש מעיל מעבדה, כפפות, faceshield ההנשמה.
      3. הסר את supernatant, מחדש להשעות את גלולה ג'ל BM ב 500 μl של 20 מ"ג / ציאנוגן ברומיד מ"ל + 70% v / v חומצה פורמית דגירה לילה ב RT.
      4. השתמש מזרק חד פעמי 1 מיליליטר להעביר גלולת ג'ל BM resuspended לתוך קלטת דיאליזה עם משקל מולקולרי המנותק 3.5 kDa.
      5. להטביע את הקלטת לתוך כוס זכוכית 500 מ"ל המכיל 500 מ"ל של מים כפולות מזוקקים בר ומערבבים מגנטי.מניחים את זה על בוחש מגנטי dialyze לילה (16 שעות) בשעה 4 ° C (בחדר קר) כדי להסיר כל עקבות של ציאנוגן ברומיד וחומצה פורמית.
      6. השתמש מזרק חד פעמי 1 מ"ל להעביר הפתרון בע"מ dialyzed מתוך הקלטת לתוך צינור 1.5 מ"ל.
      7. נתחו 25 μl של כל דגימה BM על ג'ל polyacrylamide נ 12% / v ^10,11. בעקבות SDS-PAGE, לבצע צביעת כסף של ג'ל polyacrylamide ¹² כדי להמחיש את דפוס electrophoretic של פפטידים-מטריקס ציאנוגן ברומיד ^13.
3. ניתוח מיקרוסקופי Immunofluorescent
   1. בצע מכתים immunofluorescent של GLA מטופלים ולשלוט ג'לים RBM עם נוגדנים אנטי-אייג '/ pentosidine, אנטי-קולגן IV ואנטי laminin ואחריו מיקרוסקופיה confocal לדמיין AGEs שנצבר קולגן IV / rearrangements מבניים סיבים laminin ב RBM crosslinked ג'לים ^13.
      הערה: השתמש תמיד נפח מספיק כדי לכסות את entiמחדש ג'ל RBM במהלך incubations ושוטף בלי לגעת פני השטח RBM עם קצה פיפטה. לפרטים לנתח תרבויות acini 3D ידי immunofluorescence ראה התייחסות ⁶ ו במיקרוסקופ confocal של acini 3D ראה התייחסות ^14.
      1. לשטוף GLA מטופלים וג'ל מלאה RBM בשקופיות קאמרית 8-בארות 2 פעמים עם 300 μl של PBS + (PBS המכיל 0.1 מ"מ CaCl ₂ ו -0.5 מ"מ MgCl ₂₎ במשך 5 דקות ב RT.
      2. הסר את PBS + ולאחר מכן להוסיף 300 μl של 4% w / v paraformaldehyde (PFA) מדולל PBS + לכסות כל ג'ל RBM. דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לתקן את הרכיבים RBM.
      3. הסר 4% w / v פתרון PFA. להוסיף להוסיף 300 μl של 75 מ"מ NH ₄ Cl + 0.5 פתרון מ"מ MgCl ₂ ו דגירה במשך 5 דקות ב RT (לחזור 5x) כדי להרוות את קיבעון.
      4. הכן חיץ Immunofluorescence (IF חיץ) על ידי הפיכת הפתרון הבא במים סטריליים: 130 mM NaCl, 7 מ"מ Na _{2 4} HPO, 3.5 מ"מ לאא₂ PO _4, 7.7 מ"מ NaN _3, 0.1% w / v בסרום שור אלבומין, 0.5% v / v פוליאתילן גליקול tert- octylphenyl האתר ו 0.05% v / v פוליאתילן גליקול monolaurate sorbitan.
      5. להכין אם חיץ חסימה ידי השלמת IF חיץ עם 20% נסיוב עז V / V.
      6. הסר את הפתרון מרווה ולהוסיף 300 μl של אם חסימת חיץ הג'לים RBM למנוע תגובות ספציפיות. דגירת שעה 2 ב RT על פלטפורמה רועדת.
      7. הסר את חוצץ חסימת IF ו- דגירה ג'לים RBM במשך 16 שעות ב 4 ° C עם 300 μl של נוגדן ראשוני מדולל אם חסימת חיץ (1: 500 עכבר מב אנטי pentosidine; 1/250 ארנב PAB IV אנטי-קולגן; 1 / ארנב 250 אנטי laminin / C PAB).
         הערה: incubations למשך זמן ארוך יותר מ -20 שעות ב 4 ° C. יכול liquidize RBM.
      8. הסר את הנוגדן הראשוני לשטוף 3 פעמים (10 דקות כל אחד) עם 300 μl של חיץ IF בטמפרטורת החדר על פלטפורמת רועד.
      9. הסר את חוצץ IF ו-להוסיף 300 μl של נוגדנים משני (נגד ארנב עיזים או IgG-עכבר אנטי [H + L]) מצומדות עם fluorochrome מדולל 1: 500 ב IF חסימת חיץ. דגירה עבור שעה 2 ב RT על פלטפורמה רועדת.
      10. הסר את נוגדנים משני דגירה 300 μl של חיץ IF במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את חוצץ IF ו- לשטוף 3 x 10 דקות ב 300 μl של PBS + בטמפרטורת החדר.
      11. תקן להרוות בשנית, כפי שתואר לעיל (צעדים 2.3.1.2 ו 2.3.1.3).
      12. הר ג'לים RBM מוכתם במדיה הרכבה ולנתח את ההיווצרות של צרורות צפופות של רכיבים עיקריים באמצעות epifluorescent או confocal.
          הערה: לפרטים לנתח תרבויות acini 3D ידי immunofluorescence ראה התייחסות ⁶ ועבור epifluorescent ו מיקרוסקופיה confocal של acini 3D ראה התייחסות ^14.
4. ניתוח ראולוגיות
   1. ביצוע ניתוח rheometric של GLA מטופלים ולשלוט ג'לים RBM למדוד נ שלהםiscoelasticity (נוקשות).
      1. הגדרת ג'לים RBM כי הם 1 מ"מ עובי בתוך תבנית עגולה בקוטר של 8 מ"מ. לשם כך, במקום טבעת שיבוט (בקוטר 8 מ"מ) בתוך גם צלחת תרבות 24 היטב ומוסיפים BM פתרון מטריקס מוכן כמתואר בשלבים 1.3-1.6.
         הערה: שהשחזור מדויק של הג'לים RBM המשמשים בניסויים, ג'לים RBM מוכן לניתוח rheometric צריך לעבור את אותה שטח הפנים ועובי כמו ג'לים RBM להגדיר בתאי 8-היטב. הג'לים RBM ניתח באיור 3 היו 1 מ"מ עובי ו -8 מ"מ קוטר.
      2. פנקו את הג'לים RBM שהוקם טבעות שיבוט עם PBS, GLA עבור 6 שעות ו GLA במשך 14 שעות כפי שתואר לעיל (שלבים 1.8 כדי 1.11).
      3. מדוד את מודולוס האלסטיות (E) של הג'לים RBM בקוטר 8 מ"מ על rheometer בעלת לוחית 8 מ"מ במקביל משוננת גיאומטריה, על פני טווח של מתח 1-3%, בכל תנודת תדר קבועה של 1Hz וטמפרטורה של 21 מעלות צלזיוס. לפרטים נוספים אודותניתוח rheometric ג'לים ECM לראות אזכור לראות ^13,15,16 התייחסות.
         הערה: E נקבעת מודולוס אחסון גזירה שיעורר (G ') באמצעות המשוואה הבאה: E = 2 * G' * (1 + v) כאשר V היא מקדם פואסון של 0.5, כמתואר התייחסות ^{13,15 , 16.}

תרבות טיפול 3. קו PEC הרגיל, RWPE-1

1. לגדול RWPE-1 התאים סרום ללא מדיה keratinocyte (KSFM) בתוספת 5 ng / גורם הגדילה באפידרמיס מ"ל (EGF), 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​תמצית בלוטת יותרת המוח שור (BPE) ו -50 U / פניצילין מ"ל עם 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין ( להשלים KSFM).
   הערה: כדי למנוע גיוס של אפיתל-to-mesenchymal (EMT) מעבר-כמו אל תחשוף תאי RWPE-1 בסרום. אפשר להשלים KSFM להגיע RT למשך 30 דקות לאחר הסרת מאחסון ב 4 ° C ולעשות לא חם באמבט מים 37 ° C כמו זה יהיה להשבית את EGF ו BPE.
2. לשאוב מלאKSFM מתוך צלחת ומחוברות 10 ס"מ ² תאים RWPE-1, לשטוף עם 5 מ"ל של PBS מחומם מראש ולהוסיף 5 מ"ל של 0.05% טריפסין V / V להבטיח כי כל התאים מכוסים הפתרון.
   1. מניחים את התאים בתרבית רקמה החממה נקבע בתנאים סטנדרטיים של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ (עם humidification) במשך 5 עד 10 דקות. בדוק את מידת trypsinization לאחר 5 דק 'לטפוח בעדינות את צלחת התרבות כדי לנתק את התאים.
      הערה: תאים RWPE-1 לא לסבול תקופות ארוכות של trypsinization ולכן מומלץ לא לטפל יותר משני לוחות באותו זמן. כמו כן, חשוב לנתק את כל התאים מהצלחת להימנע ברירת שבטים.
3. כאשר כל התאים RWPE-1 יש ומפורר, להוסיף 5 מ"ל של PBS חם המכיל 2% v / v עוברית עגל בסרום (FCS) כדי להרוות את טריפסין. פיפטה בעדינות מעלה ומטה כדי לפזר את אגרגטים התא לפני העברת התאים צינור צנטריפוגות.
4. צנטריפוגה התאים מנתקים אותו ב 125-150 xגרם במשך 5 דקות במהירות של 25 ° C, וזורקים supernatant מחדש להשעות גלולה של התאים 5 מ"ל של שלמה KSFM עד ההשעיה של תאים בודדים מתקבל.
5. העברה 1 מיליליטר של התאים מחדש מושעה לתוך צינור חדש ולהוסיף 9 מיליליטר של שלמה KSFM להפיץ את התאים ב דילול 1: מעבר 5 לשימוש ניסיוני הבא. לספור את שאר התאים באמצעות hemocytometer להקמת acini (ראה סעיף 5.1).
   הערה: אין תרבות RWPE-1 תאים עבור יותר מ -10 קטעים מאז תקופות ממושכות לאחר התרבות הם לא יוצרים acini עם הארכיטקטורה הנכונה.
6. שנה את התקשורת והתרבות כל 48 שעות כדי להבטיח את EGF ו BPE נשארים פעילים.
   הערה: כלול שינוי בינוני זו לכל טיפולים מרחיבים מעבר 48 שעות.

תרבות 4. טיפול של הקו הסלולרי BPH, BPH-1

1. BPH-1 תרבות התאים RPMI 1640 התקשורת השלים עם 5% FCS V / V, 50 פניצילין U / ml ו -50 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין. מומלץ לחמם אתהתקשורת והתרבות, PBS ו 0.25% w / v טריפסין-0.53 M פתרון EDTA עד 37 ° C לפני השימוש.
   הערה: תאים יכולים גם להיות מתורבת בתקשורת עם v 2.5% / V ⁸ FCS.
2. לשאוב התקשורת והתרבות מתוך צלחת ומחוברות 10 ס"מ ² תאים BPH-1 לשטוף את התאים 2 x עם 3 מ"ל של PBS להסיר כל עקבות של התקשורת והתרבות עם סרום שעשויים להרוות את התגובה טריפסין.
3. לשאוב PBS ולהוסיף 3 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA כדי לכסות את התאים. מניחים את הצלחת להגדיר באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ (עם humidification) במשך 5 דקות. הסר את הפתרון טריפסין-EDTA כשהתאים הם עגולים אך נשארים מחוברים המנה. שטפו תאים עם 5 מ"ל של PBS.
4. לאחר הסרת PBS, מוסיפים 5 מ"ל של התקשורת בתרבות פיפטה בעדינות מעלה ומטה כדי לייצר ההשעיה של תאים בודדים. העברת התאים צינור 15 מ"ל.
5. קח 2 מיליליטר של השעית התא לתוך צינור צנטריפוגות חדש עם 8 מיליליטר של מדיה מלאה ו צלחת תאי BPH-1 ontOA 10 סנטימטרים ² צלחת התרבות ב דילול 1: מעבר 5 לשימוש ניסיוני הבא. לספור את שאר התאים באמצעות hemocytometer להקמת acini (ראה סעיף 5.2).
   הערה: יש לשמור תיעוד של מספר המעבר, כמו תאי BPH-1 מבוגר לא יוצר acini עם ארכיטקטורה נכונה. מספר מעבר יותר מ -10 אינו רצוי.
6. שנה את התקשורת והתרבות כל 72 שעות.

5. תרבות 3D של בלוטת הערמונית acini על RBM Native והנוקשה

1. אם תאי RWPE-1 נמצאים בשימוש כדי ליצור acini, לדלל 5,000 תאים מוכנים בשלב 3.5 ב 300 μl של שלמה KSFM בתוספת 2% v / v הפתרון בע"מ.
2. אם BPH-1 תאים נמצאים בשימוש כדי ליצור acini, לדלל 2,500 תאים מוכן בשלב 4.5 ב 300 μl של התקשורת בתרבות RPMI 1640 בתוספת 2% v / v פתרון בע"מ.
   הערה: BPH-1 תאים שגודלם עולה על תאים RWPE-1 כך מספרים נמוכים יותר של תאים BPH-1 משמשים כדי להשיג חלוקה דומה של acini לאחר 6 ימים של מבוי סתוםture.
3. בעדינות זרע התאים על RBM יליד-התקשח AGE ובזהירות למקם את התרבויות להגדיר באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ (עם humidification) כדי להבטיח חלוקה שווה של acini הגוברת היטב שכל שתא מתחלק לייצר acina אחד.
4. כל 2 ימים להחליף את התקשורת והתרבות עם תקשורת ותרבות טריה המכילה פתרון 2% v / v בע"מ על מנת להבטיח כי תאי גורמי הצמיחה נדרשים acina הנורמלי הומאוסטזיס.
5. צג מורפולוגיה acinar בתרבויות גדלו באמצעות מיקרוסקופ brightfield ^13.
   הערה: לאחר 3 ימים בתרבות תאים בודדים יהוו אשכול> 3 תאים ואחרי acini בלוטת 1 שבוע הערמונית בקוטר של ~ 50 מיקרומטר יקויימו.
6. עקוב פרוטוקול המתואר 2.3 לבצע immunofluorescence באמצעות נוגדנים ספציפיים עבור סמנים של הידבקויות תא-מטריקס, הידבקויות תאים תאים, קוטביות basal-apico ואת הפולשנות ^13.
   1. השתמש במדיה גובר עם 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) או לכלול צעד נוסף (אחרי 2.3.12) להכתים גרעיני תאים על ידי דוגרים עם DAPI במשך 5 דקות ולשטוף 2 x 5 דקות עם PBS +.

6. אגרגטים תאים סרטניים 3D התרבות של ערמונית על RBM Native והנוקשה

1. תאי PC3 תרבות במדיום RPMI 1640 FCS המכיל 10% v / v ו -50 U / פניצילין מ"ל עם 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין. מומלץ לחמם את התקשורת והתרבות, PBS ו 0.25% w / v טריפסין-0.53 פתרון M EDTA עד 37 ° C לפני השימוש.
2. לשאוב התקשורת והתרבות מצלחת תרבות 10 ס"מ ² ומחוברות של תאים PC3 לשטוף את התאים 2x עם 3 מ"ל של PBS כדי להסיר כל עקבות של FCS שיכולים להרוות את התגובה טריפסין.
3. לשאוב PBS ולהוסיף 3 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA כדי לכסות את התאים דגירה במשך 1 דקות.
4. כאשר התאים הופכים מעוגל, אבל להישאר מחובר המנה, בזהירות לשאוב את הפתרון טריפסין-EDTA ולשטוף עם 3 מ"ל של PBSלהסיר כל עקבות של טריפסין.
5. לאחר הסרת PBS, מוסיפים 5 מ"ל של התקשורת בתרבות פיפטה בעדינות מעלה ומטה כדי לייצר ההשעיה של תאים בודדים. העברת התאים צינור 15 מ"ל.
6. קח 1 מ"ל של השעיה התא PC3 לתוך צינור צנטריפוגות חדשות ולהוסיף 9 מ"ל של התקשורת והתרבות. פלייט התאים על צלחת תרבות ² 10 סנטימטרים (01:10 דילול) לשימוש ניסיוני הבא. ספירת התאים הנותרים באמצעות hemocytometer.
7. לדלל 2,500 תאי PC3 מוכן בשלב 6.6 ב 300 μl של התקשורת בתרבות RPMI 1640 בתוספת v / v 2% של פתרון BM כדי לאפשר היווצרות של ג'ל שיפוע בתרבות.
8. בעדינות זרע התאים על RBM יליד-התקשח AGE ובזהירות למקם את התרבות לתוך החממה נקבע על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ (עם humidification) כדי להבטיח חלוקה שווה של גדל spheroids בבאר.
9. שנה את התקשורת והתרבות כל 72 שעות.
10. כדי לחקור את ההשפעה של RBM הנוקשה (AGE העשירי)על נדידת תאים סרטניים בערמונית, תאי PC3 התמונה באמצעות מיקרוסקופיה זמן לשגות וידאו brightfield באמצעות בקרת טמפרטורה / CO ₂ בתא humidified ^17.
    הערה: תאי PC3 לגדול בקווצות על RBM יליד ואינם מהווים acini עם לומן, אבל אם נותר לגדול יותר מ -72 שעות על הילידים RBM הם יהוו spheroids 3D.
11. בעקבות הרכישה נתונים, באופן ידני לעקוב אחר תאים PC3 ולחשב מהירות הנדידה שלהם, הצורה (יחס התארכות) והתמדה של הגירה ^17-19.
    הערה: התמדה = יחס D / T, D = המרחק מתחילתו ועד סופו של מסלול התא, T = האורך הכולל של מסלול התא.

תוצאות

3D הערמונית acini בתרבית על Stiff RBM

לאחר 6 ימים בתרבות, פץ נגזר רקמות ערמונית נורמליות (RWPE-1) (איור 1 א) ורקמות BPH (BPH-1) (איור 1 ב) טופס acini על ילידים (PBS מטופלים) RBM כי מאורגנים spheroids האחיד של אפיתל תאים. Acini אלה יש גם את המאפיינים של פץ מאורגן עם קוטביות הפסגה אל הבסיס וכן לומינל גלוי שטח ^13,20.

Acini נוצר על ידי פץ נגזר רקמות ערמונית נורמליות (RWPE-1) (איור 1 א) ורקמות BPH (BPH-1) (איור 1B) על התקשחה (AGE העשירי) RBM (שטופלה GLA) יש ארכיטקטורה שבשה (הסטה מ spheroidal כדי מצולעים בכושר ותאי בולטות / נודדות מן acini לעידן עשירי RBM) (איור 1 א). אלה acini מאופיינים גם על ידי פץ מאורגן מאוד כי איבדו קוטביות הפסגה אל הבסיס שלהם עם רווח לומינל קטן או אפסי ^13.

איור 1:. הערמונית אפיתל תאים שגודלו כמו 3D הבלוטות acini על ממברנה מרתף מחדש Native ונוקשה (RBM) (א) תמונות Brightfield של RWPE-1 תאים שגודלו במשך 12 שעות עד 6 ימים על ג'ל RBM שטופלו PBS (מקורי) או 50 מ"מ glycolaldehyde במשך 14 שעות (AGE עשירים; נוקשה); בר סולם = 50 מיקרומטר. (ב) BPH-1 תאים, גדל כמתואר פאנל; ברי סולם = 50 מיקרומטר; נתונים הוא נציג של 3 ניסויים בלתי תלויים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

טבלה 1 "src =" / files / ftp_upload / 54,230 / 54230table1.jpg "/>
טבלה 1:. מאפייני הערמונית אפיתל RWPE-1 acini גדל על שפת אם, חצי נוקשה ו ממברנה מרתף מחדש קשה (RBM) RWPE-1 acini גדלו על RBM טרום שטופלו PBS במשך 14 שעות (מקורי), glycolaldehyde (GLA במשך 6 שעות (חצי נוקשה) או GLA) במשך 14 שעות (נוקשה). לקבלת הצורה acinar, אחוז (%) ± סטיית תקן (SD) של עגול, חצי מצולעים מצולעים acini חושבו מתוך 5 ניסויים בלתי תלויים (50 acini לכמת לכל מצב). גודל acinar יחסית חושבה (יליד RBM = 100%) מן 3 ניסויים בלתי תלויים. לקבלת הפולשנות,% ± acini SD עם תאים בולטים אחד או יותר חושבו מתוך 3 ניסויים בלתי תלויים. שינוי פולד מחושב על ידי חלוקת שווי הממוצע שהושג בתנאים חצי נוקשים או נוקשים ידי הערך המקביל תנאי ילידים. ערכי P מחושבים באמצעות מבחן t (α = 0.05).

ontent "FO: keep-together.within-page =" 1 "> נוקשות RBM תלויות גיל גדל מקדמת נדידת תאים סרטניים בערמונית PC3

תאי PC3 גדלו על ילידי RBM להעביר על ידי קשר תאי תאים רציף, בעוד שתאי PC3 גדלו על גיל עשירי (נוקשה) RBM מהלך עצמאי מכל (איור 2 א) אחרים. לאחר 72 שעות בתאי PC3 תרבות מהוות מוקדים (spheroids) על ילידים (PBS מטופלים) RBM, ואילו תאי PC3 על RBM הנוקשה (AGE העשירי) לא מן spheroids ולהעביר באופן עצמאי (תרשים 2B). תאי PC3 על RBM הנוקשה (AGE העשירי) הם מוארכים יותר מאשר תאי PC3 גדל על RBM ילידים (איור 2 ג). תאי PC3 על RBM נוקשה להעביר מהר יותר מתאים PC3 גדל על RBM הילידים (2D איור). תאי PC3 על RBM נוקשה להציג ירידה התמדה בהשוואה לתאים PC3 גדל על RBM הילידים (איור 2E).

איור 2:. נדידת תאים סרטניים הערמונית על ממברנה מרתף מחדש Native ונוקשה (RBM) (א) תמונות Brightfield של תאי PC3 גדל על ג'לים RBM שטופלו PBS (מקורי) או 50 מ"מ glycolaldehyde במשך 14 שעות (AGE-עשיר, נוקשה) . תאים היו צילמו באמצעות מיקרוסקופ brightfield (אובייקטיבי 10X) ושיעור רכישת 1 התמונה לכל שעה במשך 12 שעות ואחריו תא מעקב ליצור מסלולים. מהתמונות המוצגות מתאימות נקודות הזמן לאחר 0, 3, 6, 9 ו -12 שעות. מסלולים של תאים בודדים מוצגים עבור נקודת 12 שעות הזמן. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (ב) בתאים PC3 בתרבית על RBM יליד או נוקשה במשך 72 שעות, צילמו כמתואר בלוח (א). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. פרטים מראים אזור נבחר בהגדלת 2X. (ג) ממוצע ± סטיית תקן אורך תא (מיקרומטר); הבדל משמעותי בין RBM יליד RBM נוקשה (p = 1.2 x 10 ^-23). ( (E) ממוצע ± סטיית תקן התמדה של תנועת התא (יחס D / T, כאשר D = המרחק מתחילתו ועד סופו של מסלול התא, T = האורך הכולל של מסלול התא); הבדל משמעותי בין RBM יליד RBM הנוקשה (p = 0.0007). עבור לוחות לספירה> 10 תאים נותחו, נתונים הוא נציג של 3 ניסויים בלתי תלויים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

דיון

פרוטוקול עבור הדור של acini הבלוטות 3D מ MECs ג'ל טהור RBM ⁶ שונתה במחקר קודם על ידי תוספת של 4 מ"ג / מ"ל סוג אני קולגן מטריקס RBM. התוספת של קולגן הביאה מודולוס האלסטיות של הג'ל RBM גובר מצד 175 ± 37 כדי 1589 ± 380 פסקל. 9.1 פי גידול זה נוקש מווסת את הצמיחה, הישרדות, ההגירה והבחנה של MECs ^21. פרוטוקול שונה שוב על ידי לרבות הורה חורג טיפול עם D - (-) - ריבוז לקדם crosslinking אנזימטית של קולגן מסוג I כי נוספו הג'ל RBM. הגידול 15 פי כתוצאה נוקשות נמצא לשתף פעולה עם השינוי בשעור של MECs לקדם התנהגות פולשנית שלהם ^22. הגישה ניסיון מהסוג מוסיף לי קולגן כדי ג'ל RBM מקלה על האינטראקציה הישירה של MECs עם סיבי קולגן, אשר מתרחש רק ברקמות אנושיות לאחר המכשול הפיזי בין stromaאפיתל שמספקת BM עוברת שפלה פרוטאוליטים. על ידי יצירת acini הבלוטות 3D מ פץ ג'ל RBM טהור טרום שטופלו GLA, הפרוטוקול הנוכחי פותח את הדרך ללמוד כיצד קשיחות בע"מ כשלעצמו יכול לעורר התנהגות פולשנית שלהם (איור 3). רמות קשיחות בע"מ המושרה בפרוטוקול זה יש רלוונטי פיסיולוגי. דגירה עם 50 מ"מ GLA עבור 6 שעות ו -14 שעות בהתאמה הגדילה את moduli אלסטי של הג'ל RBM טהור 175 ± 90 ו 322 ± 160 לעומת 122 ± 55 פסקל ג'ל RBM שטופלו PBS (טבלה 1). 1.7 ל 3.2 לקפל זו העלייה נוקשה RBM משכפלת את גידול 2.5- ל -3.4 פי נוקשות שנצפו ממאיר לעומת ערמונית נורמלית או BPH רקמות ^23-26. כפי שצוין בפרסום אחרון ¹³ השינויים המורפולוגיים מושרה על ידי ההצטברות של AGE וקשיחות RBM ב acini PEC ניתן לכמת עבור שינוי משמעותי סטטיסטית מן arounded לצורתו מצולעים, ירד לומינל / אזור acinar הכולל, ותאי בולטות נודדות מן acina לעידן עשירי RBM (איור 3). Immunoblotting יכול לשמש גם כדי להעריך סמנים של EMT (הפסד למשל של E-cadherin ¹³⁾ ואת התנהגות התכווצות (שרשרת-2 אור שרירן פוספורילציה למשל, pMLC2 ¹³⁾ ב פץ הגדלים רגילה לעומת RBM נוקשה (איור 3). הערכה נוספת באמצעות מכתים immunofluorescent ו מיקרוסקופיה confocal ניתן ליישם כדי להמחיש את BM (למשל laminin, קולגן IV וגיל הצטברות ^13), קוטביות הפסגה אל הבסיס הסלולרית (למשל לוקליזציה הפסגה של EEA1: אנטיגן endosomal מוקדם 1; ו GM130: 130 ציס-Golgi kDa סמן ¹³⁾ ודפוסי הסלולר של מולקולות הדבקה (לוקליזציה E-cadherin למשל לצמתים תאים תאים ¹³⁾ (איור 3).

איור 3:. סקירה של הפרוטוקולים השונים שהוצגו כאן התרשים מתאר כיצד להכין להקשיח את הקרום במרתף מחדש (RBM) עם glycolaldehyde (תגובת מייארד), איך זרע תאים אל RBM הנוקשה, כיצד לנתח את RBM הנוקשה ( היקף תגובת Maillard) ונהלים, שניתן להשתמש בם כדי לנתח את השינויים התאיים ומולקולריים המושרים על ידי RBM AGE-עשיר. גיל, endproducts גליקציה המתקדם; BM, קרום במרתף; DAPI, 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole; EEA1, אנטיגן endosomal מוקדם 1; GAPDH, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; GLA, glycolaldehyde; GEE, אתיל אסתר גליצין; GM130, 130 kDa סמן ציס-Golgi; p-MLC2 (Thr18 / Ser19), שרירן שרשרת-2 אור פוספורילציה באתרים תראונין 18 סרין 19; RBM, קרום במרתף מחדש; SDS-PAGE, ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide סולפט dodecyl נתרן. לקבלת RWPE1 acini בר סולם = 10 מיקרומטר; עבור תאים סרטניים PC3סולם spheroids בר = 100 מיקרומטר. נתון זה יש הבדל בין התייחסות ^13. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

שלבים לפתרון הבעיה יהיה צורך אם D - (-) - ריבוז נבחר כסוכן crosslinking עבור RBM. במהלך פיתוח פרוטוקול נמצא כי טיפול עם 1 M D - (-) - ריבוז במשך 72 שעות, כפי שתואר לעיל עבור ג'לים RBM / קולגן ^22, מביא את התייבשות ההצטמקות של ג'לים RBM. ההערכה של ריכוזים נמוכים של D - (-) - ריבוז ושעות טיפול קצרות עשויה לעזור להתגבר על מגבלה זו.

מגבלה פוטנציאלית יישומים עתידיים של הפרוטוקול יכולה להיות נתקלה בם רמות גבוהות של נוקשות RBM הן רצויות. אם פעמי דגירה ארוכות ריכוזים גבוהים יותר של GLA משמשים כדי לגרום לרמות גבוהות של נוקשות ג'ל RBM זה יהיה צורך להעריך אם יש תנאי טיפול אלה השפעה על הישרדות ובחלוקה של תאים, כפי שתואר לעיל ^13. כמו כן יש לציין כי הדגירה של תאים RWPE-1 עם סרום גורם מעבר EMT דמוי פנוטיפי וחשיפה בסרום או חומרים המכילים בסרום יש להימנע. לדוגמא, אם ניסויים כרוכים transfection של קצר מפריעי RNA (siRNA) oligonucleotides, ההליך צריך להיות מותאם באמצעות תאי RWPE-1 גדלו ב KSFM, מבלי לכבות את תאי תקשורת transfection בסרום נמוך. חסרון זה עלול לסכן את רמת גן ההשתקה מושג כאשר באמצעות siRNA חולף גישות במודל. עבור מטרות חלבון מסוימות זה יהיה מומלץ להעסיק וקטורי shRNA מושרים עבור להשתקת גנים מתכוננת ואת הירידה ברמות חלבון. עיבודים המשלבים crosslinking האנזימטית ידי תא סטרומה או מונואמין lysyl הקשורים תאים סרטניים (לקס) ¹⁷ יכול גם להיות משולב בתוך דגמים עתידיים.

jove_content "> פרוטוקול זה יקל על המחקר העתידי של מנגנונים פרו-פולשני מופעלים על ידי נוקשות תלויות גיל בע"מ ב פץ (RWPE-1, BPH-1) והערכת המטרות אנטי-גרורתית PTCs פולשנית (PC3). בהתחשב בכך BPH נחשב הפרעה מטבולית ^27, פרוטוקול זה גם סולל את הדרך לקראת ההבנה המשופרת שלנו על הקשר בין הפרעות מטבוליות וסיכון לסרטן הערמונית גדל. בהתחשב בכך נוקשות בע"מ המושרה על ידי חשיפתה גילים יכולות להיות הטריגר הפולשנות בסרטן אחר סוגים, זה יהיה עניין להשתמש בפרוטוקול להקים מודלים דומים המשלבים תאים נורמלים אפיתל ותאי גידול מאיברים אחרים (למשל שד, מעי גס, שחלות, לבלב).

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול, יחד עם התזמונים שלהם, מסוכם באיור 4. במהלך השלב הראשוני זה הכרחי כדי לשמור על פתרון המניות של RBM על 4 מעלות צלזיוס בזמן שהוא מפשיר למנוע pol שלהymerization. טיפים פיפטה לא צריך להיות ממוקם לתוך התמיסה RM המניה עד שהם כבר מקורר עד 4 ° C. עבור השלב הבא חשוב גם כדי להבטיח את השקופיות הקאמריות יש equilibrated עד 4 מעלות צלזיוס לפני שהם מכוסים פתרון RBM. ברגע הטמפרטורה של פתרון RBM היא עלתה מעל 4 מעלות צלזיוס הוא יעבור פילמור בלתי הפיך כדי ליצור ג'ל. זה חיוני כי RBM אינה מופרע בשלב פילמור כדי להבטיח שהיא יוצרת משטח ישר מתאים תרבית תאים וניתוח מיקרוסקופי. משך הדגירה עם GLA עם או בלי מעכבי התגובה Maillard (cyanoborohydride נתרן amingoguanidine) יקבע איך נוקשה הג'ל RBM הופך. מומלץ להשתמש דגירת hr 6 עם GLA אם תנאים חצי נוקשים נדרשים, דגירת 14 שעות אם נדרשים תנאים נוקשים (טבלה 1). פעמי דגירה חלופיות או ריכוזים של GLA יכולות לשמש אם רמות שונותשל קשיחות הם רצויים. בניתוח rheological במקרה זה של הג'לים RBM צריך להיות משולב כצעד הכרחי. בעקבות הצעד של מרווה התגובה Maillard ידי הדגירה עם GEE ואת השלבים כביסה הבאים עם PBS, ג'לים RBM ניתן להשתמש מיד או לאחסן 4 ° C עד 48 שעות לפני השימוש בהם עבור תרבית תאים. לאחר בתרביות תאים מוגדרות חשוב לשנות את מדיום התרבות (כולל כל טיפולים) כל ימים. מומלץ לשמור על תרביות תאי 3D עבור 3-12 ימים בהתאם לפרמטרים תחת חקירה. לקבלת 3D PEC acini מומלץ לנתח התרבויות לאחר 6 ימים, לניתוח 3D PTC spheroids מומלצת לאחר 3 ימים של תרבות בערכאה הראשונה.

איור 4:. סקירה פשוטה של הפרוטוקול עם שלבי תזמונים קריטיים הצביע על פלהבתרשים w מתאר כיצד להכין להקשיח את הקרום במרתף מחדש (RBM) עם glycolaldehyde (תגובת מייארד) בצעדי תזמונים קריטיים מצוינים. נקודות כאשר הפרוטוקול ניתן לעצור, וג'ל RBM מאוחסן, מסומנים גם. RBM, קרום במרתף מחדש; GLA, glycolaldehyde; GEE, אתיל אסתר גליצין; ON, לילה; PBS, פוספט שנאגר מלוח; RT, בטמפרטורת החדר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
I - חומר לתרבית חד-שכבתית
BPH-1	CaP מסד נתונים של קו תאים	PCaCL-132	איש קשר: simon.hayward@mcmail.vanderbilt.edu
מדיה מלאה ללא סרום קרטינוציטים	ThermoFisher Scientific	17005-075	אין לחמם ב 37 º C לפני השימוש
סרום עגל עוברי	First Link UK Ltd	02-00-850	חנות בכתובת -20 º C במכסות
PC3	American Type Culture Collection	CRL-1435
פניצילין/סטרפטומיצין	ThermoFisher Scientific	15070-063
טבליות מלח פוספט בופר (Dulbecco A)	אוקסואיד	BR0014G
RPMI 1640 בינוני	סיגמא-אולדריץ'	R5886	חם ב 37 º C אמבט מים לפני השימוש
RWPE-1	American Type Culture Collection	CRL-11609
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T4049
Name	>Company	Catalog Number	Comments
II - חומר לתרבות תלת מימדית
אצטוניטריל	סיגמא-אולדריץ'	271004
אמינוגואנידין הידרוכלוריד	סיגמא-אולדריץ'	396494	מגרה את העיניים, מערכת הנשימה
והעור מגלשות בתא, 8-well	Thermo Scientific Nunc Lab-Tek	TKT-210-816M
מטריצת תרבית משוחזרת ממברנת הבסיס (rBM) תמצית גורם גדילה מופחת	AMS Biotechnology	3445-005-01	חנות קרום מרתף (BM) ב -80 º C בציטוטים
ציאנוגן ברומיד	סיגמא-אולדריץ	C91492	רעיל במגע עם העור ובשאיפה
חומצה פורמית	סיגמא-אולדריץ'	695076
גליצין אתיל אסטר הידרוכלוריד (GEE)	סיגמא-אולדריץ'	50060	מגרה את העיניים
גליקולאלדהיד דימר (GLA)	סיגמא-אולדריץ'	G6805
סודיום ציאנובורוהידריד	סיגמא-אולדריץ'	71435	דליק מאוד; רעיל על ידי עור מגע ומסנן מזרק אינהלציה
0.22 מיקרון	אפלטון וודס	BC680
שם	Company	Catalog Number	Comments
III - חומר לכימות תגובת מיילארד
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	ThemoFisher Scientific	D3571	רגיש לאור ומאוחסן ב-20 º C ב-aliquots
צילינדרים משובטים	Sigma-Aldrich	C1059
עז נגד עכבר IgG (H+L) Alexa Fluor 488 מצומד	ThemoFisher Scientific	A-11001	רגיש לאור
עז נגד ארנב IgG (H+L) Alexa Fluor 488 מצומד	ThemoFisher Scientific	A-11034
סרום עיזים	Abcam	ab7481	חנות ב-20 º C ב-aliaquots
Vectashield הרכבה מדיה	Vector Laboratories	H-1000
שיבוט עכבר אנטי-פנטוזידין, PEN-12 mAb	TransGenic Inc	KH012
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	F8775	Store ב-20 & C ב- aliquots
ארנב אנטי אנושי קולגן IV נוגדן רב-שבטי	נוגדנים Acris	R1041	ב -20 º C ב-aliquots ארנב
אנטי-למינין מזגן pAb	Santa Cruz Biotechnology Inc	sc-7292	חנות ב-20 º C ב- aliquots
פוליאתילן גליקול טרט-אוקטילפניל אתר (Triton-X100)	סיגמא-אולדריץ'	T9284
פוליאתילן גליקול סורביטן מונולאורט (Tween-20)	סיגמא-אולדריץ'	P1379
קלטת דיאליזה Slide-A-Lyzer	ThemoFisher Scientific	66333
Name<	strong>Company	< strong>מספר קטלוגי	הערות
IV - ציוד
ARG2 מתח מבוקר ריאומטר סיבובי	T.A. מכשירים
Axiovert S100 (הגדלה פי 20) מיקרוסקופ	Zeiss
CO2 תא דגירה לח מבוקר עבור מיקרוסקופ Zeiss Axio S100	מיקרוסקופ Solent Scientific
Confocal Axiovert 200M (40X, 63X הגדלה) מיקרוסקופ	Zeiss
Olympus LH50A מצויד במצלמה דיגיטלית באמצעות ניגודיות פאזה	אולימפוס
ספקטרופוטומטר קורא צלחות PHERAstar Plus	BMG Labtech
Name	Company	Catalog Number	Comments
V - תוכנה
תמונה J 1.47v	המכון הלאומי לבריאות, ארה"ב
MetaXpress	חלוקות מולקולריות