Method Article

שיטה קלה הצמח Polysome Profiling

DOI:

10.3791/54231

⸱

August 28th, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Laboratoire de Génétique et Biophysique des Plantes, Aix-Marseille Université, 2UMR 7265 Biologie Végétale & Microbiologie Environnementales, CNRS, 3BIAM, CEA, 4Department of Biology, Biocenter, University of Copenhagen, 5Laboratoire de Chimie Bactérienne, 6CNRS, LCB UMR 7283, Aix Marseille Université

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטה קלה לחילוץ ופיצול תעתיקים מרקמות צמחים על בסיס מספר הריבוזומים הקשורים. הוא מאפשר הערכה גלובלית של פעילות התרגום וקביעת סטטוס התרגום של mRNAs ספציפיים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תרגום mRNA לחלבון הוא תהליך ביולוגי בסיסי ומווסת מאוד. פרופיל פוליזום נחשב לתקן זהב לניתוח רגולציה תרגומית. השיטה המתוארת כאן היא דרך קלה וחסכונית להפרדת פוליזומים מרקמות צמחים שונות. שיפוע סוכרוז מיוצר ללא צורך ביצרנית שיפוע על ידי הקפאה רציפה של כל שכבה. לאחר מכן מכינים תמציות ציטוזוליות במאגר המכיל ציקלוהקסימיד וכלורמפניקול כדי לשתק את הריבוזומים הציטוזוליים והכלורופלסטיים ל-mRNA ונטענים על שיפוע הסוכרוז. לאחר הצנטריפוגה, שישה שברים נאספים ישירות מלמטה לראש השיפוע, מבלי לנקב את צינור האולטרה-צנטריפוגה. במהלך האיסוף, הספיגה ב-260 ננומטר נקראת באופן רציף כדי ליצור פרופיל פוליזום הנותן תמונת מצב של פעילות התרגום העולמית. לאחר מכן נאספים שברים להכנת שלוש אוכלוסיות mRNA שונות: הפוליזומים, mRNA הקשורים למספר ריבוזומים; המונוזומים, mRNAs הקשורים לריבוזום אחד; ו-mRNAs שאינם קשורים לריבוזומים. לאחר מכן מופקים mRNAs. פרוטוקול זה אומת עבור צמחים ורקמות שונות, כולל שתילי Arabidopsis thaliana וצמחים בוגרים, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum ועלי Oryza sativa.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סינתזת חלבון היא תהליך חיוני ויקר במרץ בכל התאים 1. קודם כל, התאים חייבים להשקיע אנרגיה בייצור של מכונות תרגום, הריבוזומים. לדוגמא תא שמרים שעדיין מתחלק מייצר ככל 2,000 ריבוזומים לדקה. כזה הייצור דורש עד 60% של פעילות תעתיק הכולל עד 90% מהפעילות שחבור הכולל של התא 2. בנוסף, אנרגיה נדרשת לסינתזה של חומצות אמינו, aminoacyl-tRNA ו קשרים פפטידיים. בצמחים, הוספת חומצה אמינית אחת על עלויות שרשרת הפפטיד מן 4.5 ל 5.9 מולקולות של ATP 3. לכן, אין זה מפתיע כי התרגום של mRNA לחלבון הוא אתר עיקרי של רגולציה, במיוחד כאשר מדובר בהתמודדות עם תנאי סביבה משתנה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנה של 20 עד 50% (w / v) מעברי צבע סוכרוז

הערה: הדרגתיים עשויים 4 שכבות של סוכרוז (50%, 35% ו -2 שכבות של 20%) בצינור ultracentrifuge 13.2 מ"ל. מניסיוננו, מזיגת סוכרוז 20% בשתי שכבות נפרדות משפרת באופן משמעותי את איכות הכנות polysome.

  1. הכן את פתרונות המניות. ודא כי כל הפתרונות הם RNAse ו DNAse בחינם.
    1. הכן תמיסת מלח 10X: 400 mM Tris-HCl pH 8.4, 200 מ"מ KCl ו -100 מ"מ MgCl 2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בספרות, פרופילי polysome לעתים קרובות מוצגים מתוך שבריר האור לשבר כבד כתוצאת הדרך ההדרגתית נאספת, כלומר מלמעלה עד למטה. מאז בפרוטוקול המתואר כאן ההדרגתיים נאספים מלמטה למעלה, את הפרופילים אנו מראים להתחיל עם השבר העבה (polysomes) וללכת שבר האור (יחידות מהשנה הריבוזום בחינם RNAs) (איור 2 א). לאחר מכן, אנו אוספים כל שיפוע בשישה 2 מ"ל שברים, אבל שברים קטנים ניתן לאסוף אם ניתוח מפורט יותר של תוכן polysome צריך להתבצע.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול שאנו מציגים כאן הוא שיטה קלה וזולה ליצירת פרופילי פוליזומים ובידוד mRNAs הקשורים לפוליזומים, ריבוזומים בודדים או ללא ריבוזומים. מגוון רחב של שיטות שונות לפיצול פוליזומים מתואר בספרות. השיטה שתיארנו כאן עברה אופטימיזציה כדי לשמור רק על התרכובות הדרושות והותאמה לחומר צמחי. בפרט, הפחתנו את כמות חומר הניקוי11 והוספנו כלורמפניקול למאגר כדי לקבע את הריבוזומים הכלורופלסטיים ל-mRNA (כפי שעושה ציקלוהקסימיד עבור הריבוזומים הציטוזוליים)12 . צמצמנו גם את זמן האולטרה-צנטריפוגה הכולל7.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי הסוכנות למחקר הלאומית הצרפתית (ANR-14-CE02-0010). אנו מודים ד"ר בנימין שדה וד"ר אלודי Lanet לקריאה ביקורתית של כתב היד. אנו מודים למר מישל תרז על עזרתו עם עריכת וידאו.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
צינור אולטרה-צנטריפוגה, דופן דקה, פוליאלומר - 13.2 מ"לבקמן קולטר
, דופן דקה, פוליאלומר - 38.5 מ"לשל בקמן קולטר326823
דראמונד סיינטיפיק1-000-1000
אולטרה-צנטריפוגה Beckman CoulterOptima
רוטור אולטרה-צנטריפוגה SW41Beckman Coulter331362
רוטור אולטרה-צנטריפוגה SW32Beckman Coulter369650
משאבה פריסטלטיתכל
צינורות פוליוויניל כלוריד Tygon R3607 פישר סיינטיפיק070534-22צינורות פוליוויניל כלוריד, 2.29 מ"מ 
אספן שברים דגם 2110Bio-Rad731-8120
קובטה UVHellma170.700-QSקוורץ קובטה זרימה דרך
ספקטרופוטומטר UVVarianCary50קרא כל 0.0125 שניות
כל הכימיקליםכלשימוש רק ביולוגיה מולקולרית כיתה
Murashige ו-Skoog תערובת מלח בסיסי (MS)Sigma-AldrichM5524
מים ללא Rnaseכל
מנות פטריפישר סיינטיפיק10083251 
אוקטילפנוקסי פולי (אתילנוקסי) אתנול, מסועף (Nonidet P40)EuromedexUN3500
אקרילאמיד ליניארי (נשא אקריל)ThermoFischer מדעיAM9520נושא משקעים RNA
תוכנת ניתוחOriginPro 8OriginLab
צינור אולטרה-צנטריפוגה 331372 צינור נימי זכוכית סדרת

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nelson, C. J., Millar, A. H. Protein turnover in plant biology. Nat Plants. 1 (3), 15017(2015).
  2. Warner, J. R. The economics of ribosome biosynthesis in yeast. Trends Biochem Sci. 24 (11), 437-440 (1999).
  3. Amthor, J. S.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Polysome ProfilingPlant TissuesSucrose GradientRNA ExtractionUltracentrifugationCytosolic ExtractFraction CollectionOD MeasurementArabidopsis ThalianaNicotiana Benthamiana

Related Articles