שיטה קלה הצמח Polysome Profiling

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה קלה לחילוץ ופיצול תעתיקים מרקמות צמחים על בסיס מספר הריבוזומים הקשורים. הוא מאפשר הערכה גלובלית של פעילות התרגום וקביעת סטטוס התרגום של mRNAs ספציפיים.

Abstract

תרגום mRNA לחלבון הוא תהליך ביולוגי בסיסי ומווסת מאוד. פרופיל פוליזום נחשב לתקן זהב לניתוח רגולציה תרגומית. השיטה המתוארת כאן היא דרך קלה וחסכונית להפרדת פוליזומים מרקמות צמחים שונות. שיפוע סוכרוז מיוצר ללא צורך ביצרנית שיפוע על ידי הקפאה רציפה של כל שכבה. לאחר מכן מכינים תמציות ציטוזוליות במאגר המכיל ציקלוהקסימיד וכלורמפניקול כדי לשתק את הריבוזומים הציטוזוליים והכלורופלסטיים ל-mRNA ונטענים על שיפוע הסוכרוז. לאחר הצנטריפוגה, שישה שברים נאספים ישירות מלמטה לראש השיפוע, מבלי לנקב את צינור האולטרה-צנטריפוגה. במהלך האיסוף, הספיגה ב-260 ננומטר נקראת באופן רציף כדי ליצור פרופיל פוליזום הנותן תמונת מצב של פעילות התרגום העולמית. לאחר מכן נאספים שברים להכנת שלוש אוכלוסיות mRNA שונות: הפוליזומים, mRNA הקשורים למספר ריבוזומים; המונוזומים, mRNAs הקשורים לריבוזום אחד; ו-mRNAs שאינם קשורים לריבוזומים. לאחר מכן מופקים mRNAs. פרוטוקול זה אומת עבור צמחים ורקמות שונות, כולל שתילי Arabidopsis thaliana וצמחים בוגרים, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum ועלי Oryza sativa.

Introduction

סינתזת חלבון היא תהליך חיוני ויקר במרץ בכל התאים ^1. קודם כל, התאים חייבים להשקיע אנרגיה בייצור של מכונות תרגום, הריבוזומים. לדוגמא תא שמרים שעדיין מתחלק מייצר ככל 2,000 ריבוזומים לדקה. כזה הייצור דורש עד 60% של פעילות תעתיק הכולל עד 90% מהפעילות שחבור הכולל של התא ^2. בנוסף, אנרגיה נדרשת לסינתזה של חומצות אמינו, aminoacyl-tRNA ו קשרים פפטידיים. בצמחים, הוספת חומצה אמינית אחת על עלויות שרשרת הפפטיד מן 4.5 ל 5.9 מולקולות של ATP ^3. לכן, אין זה מפתיע כי התרגום של mRNA לחלבון הוא אתר עיקרי של רגולציה, במיוחד כאשר מדובר בהתמודדות עם תנאי סביבה משתנה.

צעד החניכה של תרגום, כלומר את שיוכה של mRNA עם הריבוזום, הוא המטרה העיקרית של ההסדרהתרגום ^4. כתוצאה מכך של הסדרת התרגום וכן צעדים רגולטוריים שלאחר תעתיק אחרים, רק 40% של וריאציות בריכוז החלבון יכול להיות מוסבר על ידי mRNA שפע ^5,6. לכן, המחקר של mRNA הכולל נותן מידע עני יחסית על שפע חלבון. מצד שני, העמותה של mRNA עם ריבוזומים נותן תובנות טובות יותר שפע החלבון על ידי מתן גישה mRNAs המעורבים התרגום. mRNAs המתורגם באופן פעיל משויך כמה ריבוזומים במבנים שנקראו polysomes. לעומת זאת, mRNAs מתורגם גרוע ישויך רק אחד הריבוזום (monosome). כתוצאה מכך, מעמדם translational של mRNA יכול להיות מוערך על ידי מעקב אחר הקשר שלה עם ריבוזומים ^7.

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של polysomes מן שתילי thaliana ארבידופסיס בת שישה ימים, הבידוד הבא של RNA, ואת ניתוח התוצאות. Polysomes ו monosomes מופרדים באמצעות שיפוע צפיפות סוכרוז. הדרגתיים נאספים לשישה שברים. חלק מן השברים הם אספו להשיג שלושה שברים מופרדים היטב: polysomes, monosomes ואת שבריר אור (הנקרא להלן supernatant), אשר מכיל את יחידות משנה ריבוזומלי 60S ו 40S בחינם mRNAs שאינם משויכים עם ריבוזומים. ניתן לאמוד פעילות תרגום עולמית על ידי יצירת יחס polysome / monosome, אשר נקבע על ידי שילוב של השטח מתחת לעקומה, ועל ידי השוואת פרופילי polysomes. mRNAs וחלבונים אז המחולצים שברים שונים ומשמש לניתוח על ידי RT-PCR, qRT-PCR, כתם הצפון, microarray, כתם או פרוטאומיקה המערבי. פרוטוקול זה יאומת לצמחים ורקמות אחרים.

הציוד נדרש לבצע פרוטוקול זה מצוי לרוב ברוב המעבדות: אין צורך לעושה שיפוע. הקפאת כל שכבה לפני הוספת הבאה למנועs מכל תערובת או הפרעה של השכבות. לא דוקר צינור משמש לאיסוף שיפוע אשר יכול להיות מושגת על ידי טבילה של צינור נימי זכוכית של ההדרגה. לכן, צינורות ultracentrifuge יקר להישאר ניזוק וניתן להשתמש בהן שוב ושוב פעמים רבות. ביחד, זה הופך את הפרוטוקול הנוכחי שיטה קלה וזולה עבור פרופיל polysome.

Protocol

1. הכנה של 20 עד 50% (w / v) מעברי צבע סוכרוז

הערה: הדרגתיים עשויים 4 שכבות של סוכרוז (50%, 35% ו -2 שכבות של 20%) בצינור ultracentrifuge 13.2 מ"ל. מניסיוננו, מזיגת סוכרוז 20% בשתי שכבות נפרדות משפרת באופן משמעותי את איכות הכנות polysome.

1. הכן את פתרונות המניות. ודא כי כל הפתרונות הם RNAse ו DNAse בחינם.
   1. הכן תמיסת מלח 10X: 400 mM Tris-HCl pH 8.4, 200 מ"מ KCl ו -100 מ"מ MgCl _2.
   2. הכן 2 פתרון M סוכרוז: עבור 200 מ"ל, לפזר 137 גרם של סוכרוז פתרון 1X מלח.
2. לדלל את הפתרון סוכרוז בסולט פתרון, כמתואר בטבלה 1, להכין הדרגתיים. הכרכים הנתונים הם שש הדרגתיים.

ריכוז סוכרוז סופי	סוכרוז 2M (מ"ל)	פתרון מלח 1X (מ"ל)	כרך סופי. (מ"ל)
50%	8.8	3.2	12
35%	12.9	12.1	25
20%	7.4	17.6	25
20%	5.8	14.2	20

טבלה 1. דילולים של תמיסת סוכרוז להכין שש הדרגתיים.

3. יוצקים שכבות לפי טבלה 2.

שכבת סוכרוז	50%	35%	20%	20%
Vol. (מ"ל)	1.85	3.65	3.65	1.35

נפח טבלה 2. של תמיסת סוכרוז לכל שכבה.

4. לאחר שמזג כל שכבה, לשמור על הצינורות בתוך C -40 ° או מקפיאה -80 מעלות צלזיוס עד הקפאה מוחלטת לפני הוספת ההשכבה סוכרוז הבאה. מקפיא מושגת בדרך כלל לאחר 2 שעות ב -40 מעלות צלזיוס, אבל מחכה כ -6 שעות לפני לשפוך את השכבה הבאה מומלץ. שכבת 20% האחרונה אפשר להקפיא או הוסיפה טרי ביום הניסוי.
   הערה: הקפאת כל שכבה לפני הוספת הבאה מונעת מכל ערבוב או הפרעה של השכבות. הדרגתיים יכולים להישמר C -40 ° או -80 ° C במקפיא במשך שישה חודשים לפחות.
5. אם זה כבר לא נעשה, להוסיף את שכבת 20% האחרונים ההדרגתיים ביום הניסוי. לאחר מכן, תן ההדרגתי להפשיר בחדר קר או מקרר.

2. הכנת תמציות Cytosolic

הערה: אנו recommבסופו של שימוש בשני מילויים לדגימה ביולוגית. 300 מ"ג הוא הכמות האופטימלית של חומר צמחי להכין שני מילויים כשעובדים עם 6 ימים שתילי thaliana ארבידופסיס ישנים. כשעובד עם פחות רקמות translationally פעילות, כמות חומר צמחי ניתן להגדיל עד 600 מ"ג.

1. שתילים ישנים קציר ששת ימים גדלו על ½ Murashige ו Skoog ⁸ בינוניים בתוספת 1% סוכרוז או מדיה מקבילה ידי מהיר הקפאה בחנקן נוזלי
2. חומר צמחי טוחנים במכתש ועלי precooled עם חנקן נוזלי.
3. לשקול 300 מ"ג של חומר אבקת בצלחת במשקל precooled. בצע פעולה זו במהירות כדי למנוע הפשרת המדגם.
   הערה: שמור על דגימות קפואות לתקופה שלא תעלה על שבוע אחד במקפיא -80 מעלות צלזיוס.
4. להוסיף 2.4 מ"ל של חיץ polysome precooled (4X תמיסת מלח, 5.26 מ"מ EGTA, 0.5% (v / v) פולי Octylphenoxy (ethyleneoxy אתנול), מסועף, 50 μg.ml ^-1 cycloheximide, 50 μg.ml ¹chloramphenicol) ו homogenize ידי ערבוב עם קצה פיפטה. העבר לשתי צינורות 1.5 מ"ל. לעבוד במהירות כדי למנוע את הדגימות מן ההתחממות.
5. צנטריפוגה ב XG 16,000 במשך 15 דקות ב 4 ° C ב microcentrifuge כדי גלולה פסולת.
   הערה: כדי למנוע השפלה RNA, תמיד לשמור על דגימות ב 4 ° C, השתמש פתרונות חינם RNase / DNase ולעבוד בתנאים חינם RNase / DNase. הפרין ניתן להוסיף למאגר polysome, לריכוז סופי של 300 μg.ml ^-1, כדי לשפר את ההגנה RNA. עם זאת, מאז הפרין יכול להפריע ניתוח במורד זרם, זה יהיה חייב להיות מוסר במהלך שלב משקעי RNA על ידי ביצוע משקע ליתיום כלוריד במקום משקעי אתנול (הערה השווה 4.7).

3. פרופיל Polysome

1. בזהירות פיפטה את supernatant מבלי להפריע גלולה. אם שברי צמח כבר pipetted, חזור על שלב 2.5. טען את supernatant על גבי שיפוע ידי בעדינות pipetting על דפנות הצינור בזרם קבוע. השתמש שיפוע אחד לכל צינור 1.5 מ"ל.
2. מעבירים precooled דליים צנטריפוגות ב 175,000 XG במשך שעה 2. 45 דקות ב 4 ° C, בתוך ultracentrifuge (למשל 32,000 סל"ד כשמשתמשים הרוטור SW41).
3. הגדר את מערכת איסוף שיפוע כמתואר באיור 1. קובט UV יש pathlength 1 מ"מ.

איור 1. מערכת איסוף Gradient. קובט UV מחובר על ידי צינורות פוליוויניל כלוריד צינור נימי זכוכית יורד לתחתית השיפוע. שיפוע התקדמות דרך בזכות מערכת משאבה peristaltic. OD ₂₆₀ קורא ברציפות ו -2 מ"ל שברים נאספים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר שלנתון זה.

4. התאם את אספן חלק כדי RT, ולהגדיר את הקרוסלה במהירות שתאפשר גביית 2 מ"ל שברים. השתמש צינורות אוסף מראש מקורר.
5. אסוף את השברים מלמטה למעלה באמצעות צינור נימי זכוכית המחוברים באמצעות צינורות פוליוויניל כלוריד למערכת אוסף השיפוע. השתמש סרט פרפין פלסטיק כדי לאבטח את החיבור בין צינורות פוליוויניל כלוריד ואת צינור נימי זכוכית.
6. קראו את הספיגה ב 260 ננומטר מלמטה העליון של השיפוע. כאשר השיפוע כולו נאסף, ומקום הצינורות האוספים על קרח לפני מיצוי RNA.

4. RNA הפקה

1. פינת השברים שנאספו משני הדרגתיים, ב 50 מ"ל כתרי צינורות צנטריפוגה, כדלקמן:
   Polysomes: שברים 1 עד 3 (12 מ"ל)
   Monosomes: חלק 4 (4 מ"ל)
   Supernatant: שברים 5 ו -6 (8 מ"ל)
2. לכל חלק, להוסיף 1 כרך. hydrochloride guanidine 8M,50 מיקרוגרם מובילים אקריליק ו -1.5 vol. isopropanol.
   הערה: מנשא אקריליק הוא acrylamide ליניארי, משמש coprecipitant כדי לשפר את ההתאוששות של חומצות גרעין במהלך משקעי אלכוהול.
3. מערבבים על ידי היפוך הצינורות המשקע O / N ב -20 ° C.
4. צנטריפוגה ב 175,000 XG במשך שעה 1 ב 4 ° C, בתוך ultracentrifuge (32,000 סל"ד ב הרוטור SW32). אם השלב משקעים מתבצע בתוך שפופרת אשר אינה עולה בקנה אחד עם ultracentrifugation, והעברת צינור מתאים.
5. בטל supernatant ו לפזר את גלולה ב 200 חיץ TE μl RNAse ללא (10 mM Tris-HCl pH 7.5 - 1 מ"מ EDTA). מעביר צינור 1.5 מיליליטר טרי.
6. חלץ RNA על ידי הוספת 1 כרך. מים פנול רווי (pH 6.6) ו 1 כרך. כלורופורם: אלכוהול isoamyl (24: 1). מערבבים נמרצות. צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 20 דקות ב 4 °. מעביר את השלב המימי לצינור 1.5 מיליליטר חדש.
   הערה: פנול חומצה (pH 4.5) ניתן להשתמש כדי למזער זיהום הדנ"א.
7. המשקע RNA על ידי הוספת 1/10 vol. 3 נתרן אצטט M ו- 3 vol. 100% אתנול. אפשר משקעים ב -80 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות או O / N ב -20 ° C. צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C..
   הערה: אם אתה משתמש הפרין למאגר polysome (הערה השוו 2.5), לבצע ליתיום כלוריד (LiCl) ממטרים במקום משקעים אתנול כדי להסיר כל שמץ של הפרין כראוי שעלולה להפריע ניתוח במורד הזרם ^9. לאחר החילוץ, להוסיף LiCl לריכוז סופי של 2.5 מ 'אפשר משקעים במשך 30 דקות ב -20 ° C או O / N ב 4 ° C. צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C..
8. שטפו את הכדור עם אתנול 500 μl 75%. האוויר היבש גלולה ו להתמוסס 30 μl חיץ TE. הערכת איכות RNA על ידי אלקטרופורזה על ג'ל agarose 1.2% חינם RNAse (100V, 15 דקות) או על ידי שיטות אלקטרופורזה נימי.

ניתוח 5. נתונים

1. נתונים גולמיים ייצא תוכנת ניתוח גרפית ונתונים.
   הערה: כפי שניתן לראות בתרשים 2A ו- B, את הפרופילים גלם לתת מידע איכותי: מספר פסגות polysome כי ניתן לראות, את גובה שיא monosome, ואת הנוכחות של הכתף המתאים יחידות משנה הריבוזום בחינם.
2. מיזוג פרופילים על מנת לאפשר השוואה של פרופילים בין דגימות. השתמש בכלי קורא מסך כדי לקבוע את ערך X של שיא monosome עבור כל דגימה וליישר את פסגות monosome ידי הסרת נקודות נתונים נוספות בתחילת העקומות. זהה את הנקודה הנמוכה ביותר של העקומה ולקבוע ערך Y שלה (שימוש באפשרות קורא המסך). הגדר את הערך Y הנקודה הנמוכה ביותר ל -0 באמצעות הפונקציה "סט עמודות ערך".
3. קבע את יחס polysomes / monosomes ידי שילוב השטח מתחת לעקומה מפרופילי גלם (איור 3 ג). השתמש בכלי בורר נתונים להגדרת הגבול של האזור כדי להיות משולב. ואז להשתמש בפונקציה לשלב (ניתוח-מתמטיקה).
4. נרמלהעקומות אל פסגת monosome ידי חלוקת כל נקודות הנתונים של עקומה ידי ערך Y של הפסגה של פסגת monosome (נקבעו באמצעות כלי קורא המסך). בחר את העמודה, ולאחר מכן תחת-מתמטיקה ניתוח, בחר לנרמל ולבחור את "מחולק לסכום מסוים" שיטות. שלב זה מאפשר השוואה של הרמה היחסית של polysomes (איור 3D).

איור 2. פרופילים polysome נציג. ארבידופסיס thaliana wild-type (wt, אקוטיפ Col-0) ושתילים מוטציה גדלו במשך שישה ימים על ½ Murashige ובינוניים Skoog תחת photoperiods יום ארוך (16 שעות אור, 8 שעות חושך). ת: פרופילי polysome גלם מן השתילים WT. B: פרופילי polysome גלם מן שתילי מוטציה. C: קביעת אחוז polysomes ו monosomes ידי שילוב של השטח מתחת לעקומה D: Profi Polysomeles מנורמל שיא monosome. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Results

בספרות, פרופילי polysome לעתים קרובות מוצגים מתוך שבריר האור לשבר כבד כתוצאת הדרך ההדרגתית נאספת, כלומר מלמעלה עד למטה. מאז בפרוטוקול המתואר כאן ההדרגתיים נאספים מלמטה למעלה, את הפרופילים אנו מראים להתחיל עם השבר העבה (polysomes) וללכת שבר האור (יחידות מהשנה הריבוזום בחינם RNAs) (איור 2 א). לאחר מכן, אנו אוספים כל שיפוע בשישה 2 מ"ל שברים, אבל שברים קטנים ניתן לאסוף אם ניתוח מפורט יותר של תוכן polysome צריך להתבצע.

Discussion

הפרוטוקול שאנו מציגים כאן הוא שיטה קלה וזולה ליצירת פרופילי פוליזומים ובידוד mRNAs הקשורים לפוליזומים, ריבוזומים בודדים או ללא ריבוזומים. מגוון רחב של שיטות שונות לפיצול פוליזומים מתואר בספרות. השיטה שתיארנו כאן עברה אופטימיזציה כדי לשמור רק על התרכובות הדרושות והותאמה לחומר צמחי. בפרט, הפחתנו את כמות חומר הניקוי¹¹ והוספנו כלורמפניקול למאגר כדי לקבע את הריבוזומים הכלורופלסטיים ל-mRNA (כפי שעושה ציקלוהקסימיד עבור הריבוזומים הציטוזוליים)¹² . צמצמנו גם את זמן האולטרה-צנטריפוגה הכולל⁷.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
צינור אולטרה-צנטריפוגה, דופן דקה, פוליאלומר - 13.2 מ"ל		בקמן קולטר
, דופן דקה, פוליאלומר - 38.5 מ"ל	של בקמן קולטר	326823
דראמונד סיינטיפיק	1-000-1000
אולטרה-צנטריפוגה	Beckman Coulter	Optima
רוטור אולטרה-צנטריפוגה SW41	Beckman Coulter	331362
רוטור אולטרה-צנטריפוגה SW32	Beckman Coulter	369650
משאבה פריסטלטית	כל
צינורות פוליוויניל כלוריד Tygon R3607	פישר סיינטיפיק	070534-22	צינורות פוליוויניל כלוריד, 2.29 מ"מ
אספן שברים דגם 2110	Bio-Rad	731-8120
קובטה UV	Hellma	170.700-QS	קוורץ קובטה זרימה דרך
ספקטרופוטומטר UV	Varian	Cary50	קרא כל 0.0125 שניות
כל הכימיקלים	כל		שימוש רק ביולוגיה מולקולרית כיתה
Murashige ו-Skoog תערובת מלח בסיסי (MS)	Sigma-Aldrich	M5524
מים ללא Rnase	כל
מנות פטרי	פישר סיינטיפיק	10083251
אוקטילפנוקסי פולי (אתילנוקסי) אתנול, מסועף (Nonidet P40)	Euromedex	UN3500
אקרילאמיד ליניארי (נשא אקריל)	ThermoFischer מדעי	AM9520	נושא משקעים RNA
תוכנת ניתוח	OriginPro 8	OriginLab